在全球范围内，反刍动物是人类食物的重要来源，随着世界人口的不断增长，将来对动物性食品特别是牛奶和牛肉的需求也随之增加，尤其是新兴发展中国家^[1]。瘤胃微生物对反刍动物的生产效率和健康状况以及温室气体的排放起着至关重要的作用^[1-3]，而瘤胃生态系统中微生物群落的结构和功能特性主要受动物基因型、日粮和养殖环境的影响^[4-6]。在高效反刍动物养殖生产中优化养殖环境、饲喂策略和营养调控，需要更好地了解以上因素对反刍动物瘤胃微生物的影响，研究瘤胃微生物已采用从传统经典的培养方法到一般分子检测^[7-8]，但一般来说，仅限于以上研究方法，揭示其功能及代谢规律是非常有限的。因此，采用多组学(宏基因组、转录组、蛋白质组和代谢组)技术手段和生物信息学方法，探索日粮、养殖环境、饲喂策略等对瘤胃微生物、消化代谢和饲料利用效率的影响及其机制是不可或缺的检测手段之一。因此，本文综述了近年来反刍动物瘤胃微生物研究方法的最新进展，旨在为调控瘤胃微生物以提高反刍动物生产和减轻环境污染提供技术手段和理论基础。

1 瘤胃微生物研究方法发展概况

经典的传统纯培养方法在微生物分离、纯化、筛选和培养方面发挥了重要的作用，将微生物单一个体进行形态学、生理学、遗传学等生物学研究和认知，进而实现多种行业微生物的开发和利用。1966年Hungate^[7]在瘤胃微生物进行开创性工作以来，相关研究得到迅速发展。2011年，新西兰AgResearch研究机构在此基础上成立了全球瘤胃微生物“Hungate1000项目”，将对1 000个培养的瘤胃微生物基因组进行测序，增加对瘤胃微生物的认知，最近完成了对420个瘤胃微生物(主要是细菌)的测序，但是培养瘤胃微生物在瘤胃微生态环境中所占比例也只有3.6%^[9]。然而，研究表明，根据现有的培养方法和技术，不同生境微生物可培养率所占比例极低，严重限制了人们对微生物资源的认识和开发。

近年来，随着基因组学、现代分子技术结合现代仪器及生物信息学分析在各个领域的应用，微生物多组学(宏基因组学Metagenomics^[10]、宏转录组学Metatranscriptomics^[11]、宏蛋白组学Metaproteomics^[12]、代谢组学Metabolomics^[13]、多组学Multi-omics^[14]) (图 1)也应运而生，并逐渐得到快速发展，以上各种组学的具体测定方法有大量报道，在此不再累述。当然，近年来多组学技术在反刍动物瘤胃微生物方面的研究也逐年增多。在Web of Science用主题词“Metagenomics”or “Metatranscriptomics”or“Metaproteomics”or“ Metabolomics”and“Rumen microbiome”检索，自2004年至今有关“组学”和“瘤胃微生物”方面刊出的英文文章457篇，尤其是近5年的研究(2014-2018年)更为迅速(图 2)。

2 组学技术在瘤胃微生物群落及其代谢研究中的应用

据统计，全世界约有包括牛、绵羊和山羊在内的36亿头养殖的反刍动物^[1]。这些反刍动物能够将人们不可利用的非淀粉植物性碳水化合物转化为可食用的肉类和奶等食品，而这种转化代谢过程是由瘤胃厌氧环境中繁多复杂的微生物群落所驱动的。反刍动物附有一个复杂的消化道微生物群落，特别是瘤胃内，每毫升瘤胃液中包含约10¹⁰个细菌、10⁷个古细菌、10⁸个原虫和10³个真菌^[4]，但不同的种类其丰度和组成不同^[15]。这些微生物可以分泌多种纤维和蛋白分解酶产生协同作用，将宿主所摄取的有机物质进行降解，其降解过程不是通过单一微生物，而是需要许多功能不同的微生物的协作，最终生成短链脂肪酸和微生物蛋白，为宿主提供能量和氨基酸，同时在其生长过程中也产生其他代谢物。近年来，国内外学者对瘤胃微生物结构组成及代谢途径进行了深入研究，尤其在反刍动物营养^[16]、纤维素降解^[17]和甲烷排放^[6]等方面进行了相关研究。

2.1 宏基因组学在瘤胃微生物研究中的应用

扩增子(amplicon sequencing)和鸟枪测序(shotgun metagenomics)及其分析是目前宏基因组研究中最常用的技术^[18]。为阐明整个瘤胃微生物结构和组成，Kittelmann等^[19]通过454-焦磷酸测序技术，分析了3类反刍动物(羊、牛和鹿)中的11个品种，并使用QIIME数据库，获得了257 485个细菌，125 052个古菌，45 231个原生动物和186 485个真菌的序列数，并确定了瘤胃微生物系统发育的潜在关系。最近，Wilkinson等^[20]已采用16S rDNA测序和用于准确预测人微生物组的PICRUSt数据库对瘤胃微生物进行了功能分析，结果显示，其预测功能与宏基因组学/宏转录组学数据所预测的功能相关性较差。Wilkinson等^[20]通过参照Hungate1000基因组对PICRUSt数据库进行了修改，开发了一个反刍动物瘤胃微生物功能预测平台——CowPI (http://www.cowpi.org/)。然而，尚未有足够的研究来进一步证实这种分析平台所预测瘤胃微生物基因组功能的准确性，因此，还需从多方面用不同种类的反刍动物对CowPI软件平台进一步验证其预测瘤胃微生物基因功能的准确性。

扩增子测序分析与更彻底和准确的鸟枪宏基因组分析方法相比，其成本确实较小，但它在准确预测微生物组功能方面存在着较大的局限性^[20]。为表征瘤胃微生物生物量降解基因和基因组，Brulc等^[21]将鸟枪宏基因组方法应用于反刍动物瘤胃微生物测序和分析，有助于更好地了解廇胃微生物在降解木质纤维素过程中的协同作用。Jami等^[22]测序和分析了奶牛瘤胃微生物268 Gb序列，并发现27 755个特定的碳水化合物活性基因表达了90种候选蛋白，其中57%对纤维素底物具有酶活性，同时还组装了15个未培养的微生物基因组。宏基因组学已被广泛应用于瘤胃微生物诸多方面的研究(表 1)。

2.2 宏转录组学在瘤胃微生物研究中的应用

宏基因组学可描述特定环境下微生物基因的存在、组成以及它们具有的基因组潜力，但不能描述这些基因在特定环境中的表达和功能。而宏转录组学是通过测定基因转录来描述这些基因的活性和分析它们的功能，是在某个特定时刻生境中所有微生物基因转录体的集合，通常被称为RNA-seq，这是原位衡量宏基因组表达的一种方法，其拼接过程非常关键和重要^[32]。由于样品中rRNA极其丰富，为获得足够的mRNA序列，需要深度测序和更强大的数据处理或使用试剂盒来消除rRNA，前者价格昂贵，目前，用于去除瘤胃微生物转录组中rRNA的试剂盒取得了不同程度的成功^[33-34]，同样，用试剂盒也可去除真核生物rRNA，因此，对于复杂的瘤胃微生物组，需要多种试剂盒来去除原核和真核rRNA，此过程可能导致部分RNA降解，将影响微生物组的转录谱，这种方法既昂贵、费力，又影响分析结果的准确性。不过，Comtet-Marre等^[35]开发了一种特定的rRNA试剂盒，可有效去除瘤胃微生物rRNA，为瘤胃环境下微生物宏转录组的研究提供了潜在的解决方案。尽管有这些进展，但研究表明，mRNA和蛋白质水平之间的相关性可能很弱且可变，这可能部分在于转录后的修饰作用^[36]。Ingolia等^[37]利用核糖体分析(Riboseq)已被开发为量化和表征翻译的直接方法，为高通量测序提供了在翻译停止时核糖体数量和位置的精确记录。这种技术在纯培养物上的应用是有效的，但该技术(MetaRibo-Seq)在宏转录水平上的开发尚处于起步阶段，在瘤胃微生物组研究中仍需进一步验证(表 1)。

2.3 宏蛋白质组学在瘤胃微生物研究中的应用

宏蛋白质组学是研究一个细胞或一个组织基因组所表达的全部蛋白质的总和，表征微生物群落功能活动，为介于DNA/RNA测序和代谢组学之间的一门科学，它更清楚地阐述了微生物组的功能^[12]。宏蛋白质组分析DNA/RNA测序方法具有一些理论上的优势，因为细胞定位与活动调节是发生在蛋白质水平上的，其在转录组与蛋白质组得到的信息将大不相同。对微生物群落功能与代谢途径的认识必须对蛋白质组进行分析，通过揭示环境中蛋白质的组成与丰度、蛋白质的不同修饰、蛋白质和蛋白质之间的相互关系，可以认识微生物群落的发展、种内相互关系和营养竞争关系等^[38]。二维凝胶电泳(2D-PAGE)方法首先使用pH梯度将同一个维度等电点的蛋白质分离，然后凝胶电泳按大小将蛋白质区分开来，得到代表宏蛋白质组的斑点图案，然后切除、消化各个斑点并结合质谱法鉴定所得肽。该方法已被用于分析测定多种环境微生物蛋白质组的研究中^[39]。然而，瘤胃含有较多的植物次生代谢物，如单宁和酚类物质，它们会影响瘤胃消化物样品质量，干扰其蛋白质组的提取和纯化^[39]。尽管如此，Snelling和Wallace^[40]采用2D-SDS-PAGE指纹图谱结合LC-MS分析数据鉴定出与瘤胃微生物群落功能活性直接相关的蛋白质，鉴定出了参与纤毛虫运动的结构蛋白(肌动蛋白、α和β微管蛋白等)、参与中枢代谢的酶(由Firmicutes和Bacteroidetes分泌)，也发现了参与甲烷合成的关键酶(高丰度的古细菌蛋白)。Deusch和Seifert^[41]利用下一代质谱仪和分析软件鉴定出了超过2 000种与瘤胃微生物群落相关的蛋白质。Hart等^[42]开发了一种分析瘤胃宏蛋白质组学的方法，该方法可将蛋白质组学数据与宏转录组信息进行比较。开发相关软件有助于宏蛋白质组的分析，如Muth等^[43]开发的Meta-proteome Analyzer可帮助分析和揭示宏蛋白质组数据。目前，该方法显示出巨大的潜力，可有效补充其他组学技术的不足，进一步确定瘤胃微生物组的功能(表 1)。

2.4 代谢组学在瘤胃微生物研究中的应用

瘤胃代谢组学与蛋白质组学方面的研究都处于起步阶段。代谢组学是对生物内源性整体代谢物定性和定量的综合分析，从生物体或生物系统中收集尽可能多的代谢信息。研究对象主要是关注分子量 < 1 000 u的代谢产物，它们具有化学复杂性和异质性，因此，分析这些代谢物是所面临的主要挑战^[44-45]。样品的提取简单，但最佳提取方法的选用是确保有效代谢物提取的关键^[46]。用于分析代谢组学的仪器设备非常多，主要区别在于其检测的灵敏度和覆盖率。迄今为止，瘤胃代谢组常用的仪器设备有液-质联用(LC-MS)、气-质联用(GC-MS)和核磁共振(NMR)。NMR因其高可靠性和可绝对量化等特点而被应用最多^[47]。LC-MS由于仪器灵敏度高、处理能力强、数据分析方便和数据库丰富等特点，也越来越受到关注。此外，现已推出一个强大在线分析工具Global Natural Products Social Molecular Networking，它可根据光谱相似性数据对质谱进行聚类，并大大改善其数据的注释^[48]。代谢组学一般有靶向和非靶向代谢组分析方法^[49]，目前大多数关于瘤胃代谢组的研究主要采用靶向法。因瘤胃液的化学组成可真实反映瘤胃微生物区系和日粮的关系，因此，开展日粮对瘤胃代谢组的影响引起了广泛关注。Ametaj等^[50]采用NMR代谢组学方法分析了日粮精/粗比例对奶牛瘤胃液的影响，结果表明，随着精料含量的增加，在瘤胃液中甲胺、亚硝基二甲胺、乙醇等有害或潜在有害化合物含量升高。Saleem等^[51]采用NMR、ICP-MS、GC-MS、DFI-MS、Lipidomics多种代谢组学技术平台，对64个瘤胃液进行了分析，结合现代仪器分析技术手段检测了瘤胃液代谢物，得到了246种代谢小分子。这246种化合物是瘤胃代谢物的一部分，包括磷脂、无机离子、气体、氨基酸、二羧酸、脂肪酸、挥发性脂肪酸、甘油酯、碳水化合物和胆固醇酯等。基于这些信息，研究者还建立了一个可搜索的瘤胃代谢物数据库，以便于分析瘤胃代谢产物(www.rumendb.ca)。Zhang等^[52]研究也表明，不同日粮精/粗比例对奶牛瘤胃代谢物(如有机酸、氨基酸、胺、糖和核苷/核苷酸等代谢物)都有影响。

瘤胃微生物所产生的代谢物是反刍动物肉和奶等产品合成的原料，同时，它们也包含了瘤胃微生物与日粮相互作用的有用信息^[51-54]。此外，Saleem等^[51]证实，磷脂酰胆碱可作为瘤胃原生动物丰度的生物标志物，瘤胃代谢物差异可用于鉴定瘤胃功能。Artegoitia等^[54]筛选了33种具有高或低平均日增重的肉牛代谢标志产物。Kingston-Smith等^[55]采用傅立叶变换红外光谱(FT-IR)研究了3种不同黑麦草在瘤胃中与微生物相互作用的差异，其差异产物主要有脂肪酸、酰胺、糖和烷烃。目前研究的重点是描述瘤胃环境如何受到日粮组成的影响，而在瘤胃代谢组学结合其他技术手段分析反刍动物消化代谢的研究还较少。因此，为更全面诠释复杂的瘤胃系统和探索瘤胃微生物如何应对外源胁迫等因素对反刍动物的影响，研发与瘤胃代谢组相关的多组技术，将有助于揭示瘤胃微生物基因组功能-宿主代谢表达相互作用的机制^{[53, 56-59]}。

2.5 整体多组学在瘤胃微生物研究中的应用

以上各种技术方法在瘤胃微生物多样性、基因功能和/或活性方面的研究都得到了新颖而独到的信息。将这些不同资料整合到描述所记录的微生物活动的模型中，使研究者对反刍动物-瘤胃微生物互作的理解将会进一步增强。例如，Shi等^[60]研究表明，瘤胃内甲烷产生的差异不是由宏基因组测得相关微生物基因丰度的差异所引起的，而是由宏转录组所测的基因差异表达所引起的。若不整合两种类型的数据进行对比，就不可能做出科学的判断和区分。同样，Hart等^[42]对同一瘤胃样品中产生的蛋白质组图谱分析表明，瘤胃细菌丰富的门是Bacteriodetes、Firmicutes和Proteobacteria。这与16S rRNA宏基因组分析所确定的结果相一致。但相比转录组学或宏基因组学分析，采用蛋白质组学MASCOT等工具，所得的分析数据能够更好地鉴定蛋白质的活性和作用，并阐明与瘤胃环境更相关的结果。利用在线数据库和检索软件工具^{[9, 24, 60-61]}，可在各种情况下更好诠释和理解瘤胃微生物功能和活性。这些工具包括BioCyc^[62]和京都基因数据库(KEGG)^[63]等。然而，以上许多数据库是针对人病原微生物或模型好氧微生物(如大肠杆菌)的，并不一定能真实反映厌氧瘤胃环境条件下微生物的重要功能，因此，对瘤胃微生物的研究和分析得到的可能只是部分结果，尚需深入研究。目前，有近500个来自瘤胃微生物的基因组，再经过各国瘤胃微生物同行协同努力，未来将形成一个类似于INTERMINE的能产生已知和预测代谢功能的特定瘤胃微生物数据库^[64]。最终目标是能够整体分析来自所有“组学”的数据信息，认知和诠释瘤胃微生物组的真实“系统”及其相互作用，并最终在计算机模型中模拟微生物群落的行为^[64-65]。

3 结论与展望

瘤胃微生物生存于特殊的生态环境条件下，对反刍动物的生产效率和健康状况以及环境污染起着至关重要的作用。其采用宏基因组学的优势在于，利用低成本能够从每个样品获得数百万个读数序列来表征微生物群落信息，但其功能特征和代谢机制尚未得到很好的诠释。另一个局限性是宏基因组只产生相对丰度，这阻碍了定量研究的发展，削弱了人们对微生物生态学的理解。因此，未来将各组学数据整合到数学模型中，可以揭示微生物与瘤胃生态环境特征之间的联系，再利用各组学与生物信息学、微生物纯培养技术相结合，可具体探究瘤胃环境中某一种类或一属类微生物的代谢与作用机制。此外，利用多组学技术加深研究和探索瘤胃微生物、反刍动物瘤胃下游的消化道部分-其他胃和肠道微生物及相互作用的了解，对阐明和开发改善反刍动物的生产和减少环境污染的新方法至关重要。因此，可以使用日益成熟的组学方法结合不断发展的仪器分析和生物信息技术，利用数学模型来进一步揭示反刍动物“瘤胃黑箱”微生物组-宿主深层的关联机制。