2. 郑州大学, 郑州 450000;
3. 浙江海隆生物技术有限公司, 绍兴 312000
2. Zhengzhou University, Zhengzhou 450000, China;
3. Zhejiang Novo-biotech Co., Ltd., Shaoxing 312000, China
猪圆环病毒2型(PCV2)是引发猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)的主要病原，给我国养殖业造成了巨大的经济损失[1]。患病猪在临床上表现为消瘦、食欲不振、精神状态差，皮肤出现红色或紫色的圆形斑点等症状[2]。安全有效的疫苗是预防猪圆环病毒感染最好的方法[3]，现有的商业化疫苗主要分为3种，包括全病毒灭活苗、弱毒疫苗以及亚单位疫苗[4]。重组亚单位疫苗作为第二代新型疫苗，相对于常规灭活疫苗、弱毒疫苗，具有技术先进、安全性高、易于短时间大规模生产等优点[5]；此外，亚单位疫苗不含病毒[6]，能够起到净化清除病毒的作用，代表着动物疫苗未来的发展方向。
PCV2共有11个开放阅读框(open reading frames，ORFs)，然而仅有三个开放阅读框被认为可以编码蛋白[7]，目前功能已知的有Rep和Cap蛋白。Cap蛋白构成病毒的核衣壳，是PCV2唯一的结构蛋白[8]，在体外可形成病毒样颗粒VLP结构，能诱导中和抗体的产生[9]，因此被广泛用于猪圆环病毒亚单位疫苗的研究。
目前，国内外常用的Cap蛋白的表达体系主要包括真核表达体系和原核表达体系。真核表达主要包括杆状病毒、哺乳动物细胞以及毕赤酵母细胞[10]。杆状病毒蛋白表达体系能够进行蛋白转录后加工修饰[11]，且已有相关的亚单位疫苗上市，但受到其表达产量的限制，生产成本方面要高于普通疫苗；Ding等[12]利用酵母表达Cap重组蛋白，通过对生产工艺的优化，最终产量达到198 mg·L-1，比传统培养提高了64%。酵母表达系统虽然成本低，却存在着菌体难以破碎、发酵周期长等问题。原核表达系统是一种发展成熟且已被普遍应用的蛋白表达体系，它操作简单，对设备和环境要求也相对较低，但是原核表达系统不能进行蛋白翻译后加工修饰，且易形成蛋白包涵体，不利于后期纯化[13]。因此，建立一种表达量高、蛋白纯度高、易于纯化、适于工业化生产且免疫原性好的PCV2-Cap蛋白新型表达系统至关重要。
中国仓鼠卵巢(CHO)细胞源于中国仓鼠卵巢的上皮细胞系[14]，被认为是最具代表性的哺乳动物细胞表达系统。相对于其他的蛋白表达系统，CHO细胞系有以下优势：(1)CHO细胞可以在无血清的、化学成分清晰的培养基中贴壁或者悬浮生长[15]；(2)具有翻译后修饰功能，表达的重组蛋白以天然形态存在[16]；(3)细胞在生长过程中对外来致病菌有一定的抵抗力；(4)CHO细胞易于形成工程细胞系，稳定表达目的蛋白，并且产量和质量能够达到生产要求[17]，有利于进行大规模生产。
本研究利用CHO-K1真核表达体系的优势，拟构建表达PCV2-Cap的CHO-K1悬浮稳转细胞系，并评估蛋白的免疫原性，为开发新型的猪圆环病毒亚单位疫苗奠定基础。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞与载体CHO-K1细胞和pEE12.4载体经改造后由浙江海隆生物有限公司提供。
1.1.2 主要试剂Q5MixPCR酶、EcoRⅠ和HindⅢ限制性内切酶购自美国NEB公司；T4 DNA连接酶购自TaKaRa公司；胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒、去内毒素质粒大提试剂盒购自上海生工；胎牛血清购自Hyclone公司；胰酶0.25% trypsin-EDTA，DMEM/F12，均购自Gibco公司；LipofectamineTM LTX购自美国Thermo Fisher公司；甲硫氨酸亚砜亚胺(L-methioninesulfoximine，MSX)购于Sigma公司；盐酸嘌呤霉素购自迈晨公司；ISA 201 VG购自法国赛比克公司；BCA蛋白质定量试剂盒购自美国Thermo Fisher公司；PCV2细胞毒由本实验室保存。
1.1.3 引物设计及合成通过对猪圆环病毒2型Cap蛋白核苷酸序列进行密码子优化，得到OPTI-Cap序列，送南京金斯瑞公司合成基因序列。
根据核苷酸序列，用SnapGen设计上、下游引物，序列如下：上游引物5′- CGGAAGCTTATG-GGCAAGAACGGCATCTTCAATAC-3′；下游引物5′-GGCGAATTCTCAATGGTGATGGTGATGGTGC-3′。
1.2 pEE12.4-PCV2-Cap重组质粒的构建 1.2.1 PCR产物及载体双酶切反应PCR扩增出Cap目的片段并做胶回收，将胶回收产物和载体分别做双酶切，酶切体系如下：目的片段和载体各2 μg，5 μL 10×cutsmart，2.5 μL HindⅢ-HF酶，2.5 μL EcoRⅠ-HF酶，ddH2O补足50 μL，37 ℃水浴2~3 h。酶切结束后，用琼脂糖凝胶检测并做胶回收，测回收的浓度。
1.2.2 连接反应用T4 DNA连接酶将目的片段和载体进行连接，连接体系如下：T4 DNA ligase 1 μL，10×T4连接buffer 1 μL，目的片段1 μL，载体4 μL，ddH2O 3 μL，同时设置对照组(不加入目的片段)。将加好的体系放入PCR仪，16 ℃反应2 h后，将连接产物做转化，涂布在氨苄抗性平板上，置于37 ℃恒温培养箱过夜，观察菌落生长情况。
1.2.3 质粒抽提与双酶切鉴定挑取上述平板上的单菌落接种至5 mL氨苄抗性LB液体培养基中，37 ℃ 220 r·min-1摇菌过夜，离心收集菌体，提取重组质粒。利用HindⅢ-HF和EcoRⅠ-HF对质粒进行酶切验证，酶切正确的质粒进一步测序验证。
1.3 无内毒素质粒提取和线性化处理 1.3.1 无内毒素质粒提取测序正确的克隆接种至100 mL含氨苄抗性的培养基中，于37 ℃摇菌过夜。离心收集菌体，无内毒素提取质粒，测量浓度并做电泳检测，-20 ℃保存。
1.3.2 质粒线性化处理取150 μg质粒做单酶切，250 μL反应体系如下：质粒pEE12.4-PCV2-Cap 150 μg，酶PvuⅠ 15 μL，10×cutsmart 25 μL，dd H2O补足250 μL。置于37 ℃酶切过夜。纯化线性化质粒，步骤如下：首先加入十分之一体积的3 mol·L-1醋酸钠缓冲液上下颠倒混匀，再加入2倍体积的预冷无水乙醇，颠倒混匀，冰浴30 min。4 ℃ 12 000 r·min-1离心15 min，弃掉上清。向管中加入预冷的75%乙醇500 μL，混匀漂洗，以除去残余的盐。4 ℃ 12 000 r·min-1，离心2 min，弃掉上清，并重复漂洗一次。室温放置10~15 min，挥发乙醇，用纯水将沉淀的核酸重新溶解，测浓度。
1.4 pEE12.4-PCV2-Cap重组质粒转染CHO-K1细胞与单克隆筛选 1.4.1 CHO-K1细胞转染转染之前要先将细胞培养基换为无抗无血清的DMEM/F12培养基。稀释质粒：125 μL OPTI-MEM中加入2.5 μg质粒，2.5 μL plus reagent，混匀，室温静置5 min。稀释Lipofectamine LTX：125 μL OPTI-MEM中加入9 μL Lipofectamine LTX，2.5 μL plus，轻轻混匀，室温静置5 min。将稀释好的质粒和Lipofectamine LTX混合物轻轻混匀。室温放置5 min，然后逐滴加入六孔板中，边滴加边轻轻晃动六孔板，使脂质体能够均匀分布。另外留出两个孔设置阴性对照和阳性对照，阳性对照：转染表达GFP蛋白的质粒，阴性对照：除不加质粒外，其他组分相同。将六孔板置于37 ℃，5% CO2细胞培养箱中培养4~6 h。换液：弃掉上清培养基，加入2 mL DMEM/F12(含10%血清、1%双抗)。转染96 h后，取上清做Werstern blot蛋白检测。一抗为猪圆环病毒2型Cap蛋白的单克隆抗体(1:1 000倍稀释)，二抗为羊抗鼠的辣根过氧化物酶酶标抗体(1:2 000倍稀释)，最后用ECL显色液避光显色2 min，并在凝胶成像仪上拍照。
1.4.2 加压筛选单克隆首先要确定嘌呤霉素的加压浓度：在铺好的细胞六孔板中，按照每孔2、3、4、5、6、7、8 μg·mL-1加入嘌呤霉素，并设置对照，观察细胞生长状态，5 d之内导致所有细胞死亡的最小浓度就是进行加压筛选的最佳浓度，最终确定嘌呤霉素的最适浓度为5 μg·mL-1。加压筛选：在转染48 h后开始加压，从37 ℃培养箱中取出六孔板细胞，弃去上清培养基，加入2 mL DMEM/F12(含10%血清、1%双抗+5 μg·mL-1 puromycin)，加压7 d，期间观察细胞生长情况，若有漂起的死细胞时可更换培养基DMEM/F12(含10%血清、1%双抗+5 μg·mL-1 puromycin)。当加压至阴性对照细胞全部死亡时，弃去上清培养基，消化细胞后用DMEM/F12(含10%血清、1%双抗+5 μg·mL-1 puromycin+25 μmol·L-1 MSX)重新悬浮细胞，铺96孔板，计数，稀释细胞至1个·孔-1，每孔加入200 μL稀释后的细胞液。待96孔板中单个细胞的孔长满时，取上清，通过Western blot检测Cap蛋白表达情况，高表达的阳性克隆继续扩大培养。
1.5 细胞株悬浮培养驯化将细胞接种至30 mL培养基，终浓度为5×105个·mL-1。细胞培养瓶放置到37 ℃，5% CO2细胞培养箱中的轨道式振荡器上120 r·min-1培养过夜，每隔24 h用细胞计数仪检测细胞密度及活力。驯化期间，培养基中血清含量逐渐降低，在含有10%血清的培养基中培养的细胞称为第一代细胞；在含有5%血清的培养基中培养的细胞为第二代；依次倍减，直至第六代，培养基中不含血清。待第一代细胞存活率达到94%~97%时进行第二代培养，第二代培养得到的细胞存活率大于95%时进行第三代培养；第三至六代培养三次后得到的细胞存活率大于95%。7周后，细胞接种3 d后生长三代，密度达到1×106个·mL-1，同时细胞存活率达到95%，该细胞被认为已经适应悬浮培养。接种密度降低到3×105个·mL-1。
1.6 细胞摇瓶发酵从CO2恒温摇床取出细胞摇瓶，进行计数，稀释细胞至2.5×105~3.5×105个·mL-1接种于60 mL培养基中。细胞培养瓶放置到37 ℃，5% CO2恒温摇床中100 r·min-1培养过夜，每隔24 h计数细胞密度及活力，利用血糖仪检测糖浓度，当糖低于2.5 g·L-1的时候，添加葡萄糖到4 g·L-1；第4天补料：补充79.6 g·L-1 CD Efficient Feed CAGT，添加基础培养基的10%，第5天开始，将CO2培养箱温度调整至32 ℃，第9天，补充79.6 g·L-1 CD Efficient Feed CAGT，添加基础培养基的10%，第12天收获细胞上清，SDS PAGE检测蛋白的表达量。
1.7 蛋白纯化由于在目的基因上加入了His标签，可选用镍柱进行蛋白纯化，步骤如下，(1)平衡：取填料4 mL，用BufferA(20 mmol·L-1 NaH2PO4，500 mmol·L-1 NaCl，0.05% Tween 20，pH 7.4)平衡；(2)上样：收集细胞上清转移到空层析柱中，流穿细胞上清；(3)洗脱：用含250 mmol·L-1咪唑的BufferA洗脱，收集流出液；再用含500 mmol·L-1咪唑的BufferA二次洗脱，收集流出液。(4)透析换液：将含有目的蛋白的咪唑洗脱液倒入透析袋内，用1×PBS透析至少1 000倍，最后取80 μL，利用SDS-PAGE做检测。
1.8 疫苗制备与小鼠免疫将CHO-K1细胞表达的猪圆环病毒2型Cap蛋白加入到ISA 201 VG佐剂中，乳化。选4~6周龄SPF雌性BALB/c小鼠，分为2组，每组5只进行肌内注射，每只注射200 μL含50 μg目的蛋白的疫苗，同时设置对照组，注射PBS作为阴性对照，在第0、14、21天分别进行一次免疫、二次免疫和第三次免疫，并在每次免疫前取小鼠尾尖静脉血，-20 ℃保存，留作检测。
1.9 ELISA检测小鼠免疫后抗体效价包被：50 μL包被液中加入50 μL 104 TCID50·mL-1 PCV2细胞毒，包被酶标反应板，4 ℃过夜，第2天重复洗板3次，每次5 min；封闭：每孔加200 μL 5%脱脂奶粉-PBST，37 ℃封闭2 h后，重复洗板3次，每次4 min；加一抗：小鼠血清按1:100、1:200、1:400、1:800、1:1 600、1:3 200进行倍比稀释，100 μL·孔-1，同时做阴性血清对照，37 ℃封闭1 h后，洗板；加酶标二抗：用5%脱脂奶粉-PBST按照1:1 000倍稀释羊抗鼠IgG-HRP，100 μL·孔-1，37 ℃孵育1 h，洗板；显色：每孔加入100 μL TMB单组分显色液，37 ℃避光反应10 min。每孔加入100 μL终止液以终止显色反应，之后用酶标仪在450 nm波长下读取数值。
2 结果 2.1 目的片段克隆以合成的OPTI-Cap为模板，PCR扩增目的条带，用1%的琼脂糖凝胶检测，结果如图 1所示，条带大小为660 bp，与理论值相符。
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M. DL2000 DNA相对分子质量标准；1~2. Cap目的片段；3.阴性对照 M. DL2000 DNA marker; 1-2. Production of Cap gene by PCR; 3. Negative control 图 1 Cap目的片段PCR扩增 Fig. 1 Amplification of Cap target fragment by PCR |
转化重组质粒，挑取12个单菌落做PCR鉴定，结果显示这12个单菌落均出现目的条带，为阳性克隆，如图 2所示。
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M. DL5000 DNA相对分子质量标准；1~12.单菌落PCR结果；13.阴性对照 M. DL5000 DNA marker; 1-12. PCR results of the single colonies; 13. Negative control 图 2 重组质粒菌液PCR鉴定 Fig. 2 PCR identification of bacterial solution |
重组质粒经HindⅢ和EcoRⅠ双酶切后，电泳显示两条带，分别为pEE12.4载体(8 262 bp)和目的条带(660 bp)，与预期大小一致，如图 3所示。测序结果显示Cap基因序列正确。
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M. DL10000 DNA相对分子质量标准；1~2. HindⅢ和EcoRⅠ双酶切产物 M. DL10000 DNA marker; 1-2. Recombinant plasmid pEE12.4-PCV2-Cap digested with HindⅢ and EcoRⅠ 图 3 重组质粒pEE12.4-PCV2-Cap的双酶切鉴定 Fig. 3 Identification of recombinant plasmid by double enzyme digestion |
质粒转入CHO-K1细胞，通过Western blot检测96 h PCV2-Cap蛋白表达。结果如图 4所示，在细胞培养上清中，能够检测到Cap蛋白的表达，蛋白条带大小约为26和29 ku，与理论值一致(29 ku条带是由蛋白发生糖基化修饰导致)。
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M.蛋白质相对分子质量标准；1.阴性对照；2.目的蛋白 M. Protein marker; 1. Negative control; 2. Cap protein 图 4 Cap蛋白表达检测 Fig. 4 Detection of Cap expression |
当96孔板孔内单克隆细胞间的汇合度达到60%时，取细胞培养上清，利用Western blot检测蛋白表达。图 5为代表性单克隆细胞株检测结果，1~7的单克隆细胞株均有Cap蛋白的表达，其中1B2株表达量最高。
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M.蛋白质相对分子质量标准；1. 6B4株；2. 6A2株；3. 5C7株；4. 4A3株；5. 1B2株；6. 2G7株；7. 2A6株；8. 2F4株；9.阴性对照 M. Protein marker; 1. 6B4 cell line; 2. 6A2 cell line; 3. 5C7 cell line; 4. 4A3 cell line; 5. 1B2 cell line; 6. 2G7 cell line; 7. 2A6 cell line; 8. 2F4 cell line; 9. Negative control 图 5 单克隆细胞株PCV2-Cap蛋白表达检测 Fig. 5 The expression of PCV2-Cap by monoclonal CHO-K1 cells in 96-hole plate by Western blot |
发酵1B2细胞株，每隔24 h检测细胞密度及活力，发酵周期为12 d。测得结果如图 6所示，证明此细胞株在发酵的过程中细胞活力和细胞密度都处于较高水平，活细胞密度不断增高，活细胞密度最高达到6×106个·mL-1，发酵结束时细胞活力保持在80%左右。
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图 6 1B2细胞株的细胞活力与活细胞密度 Fig. 6 Cell viability and living cell density of 1B2 cell line |
取发酵过程中第7、9、11天的细胞上清，SDS PAGE检测Cap分泌表达水平，图 7中每孔上样量为10 μL，其中P代表Cap蛋白阳性对照(蛋白含量为3 μg)。
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M.蛋白质相对分子质量标准；P. Cap蛋白阳性对照 M. Protein marker; P. Positive control 图 7 发酵上清中PCV2-Cap蛋白表达水平检测 Fig. 7 Detection of PCV2-Cap protein expression in fermentation supernatant |
收集细胞发酵液，利用镍柱进行蛋白纯化，纯化之后SDS-PAGE检测结果如图 8所示，采用BCA法测定蛋白浓度，蛋白得率约为370 mg·L-1；采用HPLC方法检测纯度，纯度可达到85%，说明纯化后的蛋白具有较高的纯度。
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M.蛋白质相对分子质量标准；1.PCV2-Cap蛋白 M. Protein marker; 1. Cap protein 图 8 Cap蛋白纯化 Fig. 8 Cap protein purification |
表 1展示了小鼠血清在不同稀释倍数下的抗体效价水平，可以看出小鼠在28 d的时候能够达到1:1 600，抗体水平较高。
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表 1 小鼠血清ELISA检测 Table 1 ELISA result of antiserum after immunization |
从图 9可以看出，免疫重组蛋白的小鼠在免疫后14 d检测到抗体，在28 d抗体水平达到峰值，且试验组与对照组的差异显著(P < 0.05)，证明在CHO-K1细胞系上表达的Cap重组蛋白具备良好的免疫原性。
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图 9 ELISA检测小鼠血清中抗体水平 Fig. 9 Antibody titer detection in mouse serum by ELISA |
猪圆环病毒存在于我国的大小猪场，且患病猪的死亡率可达10%左右，是阻碍我国养猪业发展的重要病原之一[18]。在研究人员的不懈努力下，我国PCV2疫苗整体呈现出良好的发展趋势，相继已有不同种类的疫苗上市，包括普莱柯生物工程有限公司生产的PCV2灭活疫苗“圆健”，青岛易邦生产的亚单位疫苗“易圆净”和武汉中博利用杆状病毒蛋白表达系统生产的基因工程疫苗等。诸多PCV2疫苗虽然能在一定程度上防控猪圆环病毒的传播，降低感染猪群的发病率，然而并不能完全阻断或者控制PCV2的感染[19]，并且存在着疫苗的稳定性和安全性等问题，由此可见，猪圆环病毒疫苗市场充满着机遇和挑战。
经过几十年的发展，CHO细胞已经成为生物药物重要的表达和生产系统[20]。与其他的细胞系相比，CHO细胞系具有能够在无血清培养基中悬浮生长，抵抗大多数人类致病病毒的感染，生产的产品安全性高的优点，而且CHO属于哺乳动物细胞系，可以进行蛋白翻译后的加工修饰[21]。在本试验中，为了使Cap蛋白能够分泌到胞外，提高蛋白的表达水平，(1)根据CHO细胞的偏好性对PCV2-Cap的基因序列进行了优化；(2)在Cap蛋白的氨基端，含有41个氨基酸残基，被称为核定位序列(NLS)[22]，与病毒的感染和复制密切相关，但NLS具有一个鲜明的特征就是富含精氨酸，带有正电荷，导致蛋白疏水性强，为了使目的蛋白分泌到胞外，截取了Cap蛋白的NLS核定位序列；(3)设计多个信号肽序列，构建质粒后同时做瞬转，检测携带不同信号肽的重组质粒转染CHO-K1细胞后PCV2-Cap蛋白的分泌情况，最终选取其中一条能够使目的蛋白高效分泌的信号肽。通过上述基因水平上的修饰，PCV2-Cap蛋白的表达量得到有效提高，而且蛋白分泌至细胞外，杂蛋白少，易于纯化，从而降低了成本。在后期的发酵过程中，笔者还优化了细胞生长所需的培养基，提高了细胞的密度、活力，进一步提高了蛋白的表达量。据了解，目前还没有利用CHO细胞蛋白表达体系来制备猪圆环亚单位疫苗的相关报道出现，本研究率先建立了表达PCV2-Cap蛋白的CHO-K1悬浮稳转细胞系，且蛋白具有良好的免疫原性，能分泌到胞外，易于纯化，适于工业化生产，为猪圆环病毒亚单位疫苗的制备提供了新思路，有利于推动猪圆环病毒亚单位疫苗的产业化发展。
4 结论通过构建真核表达质粒pEE12.4-PCV2-Cap，转染CHO-K1细胞，经加压筛选得到高表达的单克隆细胞株，并对这些细胞株进行一系列驯化以及发酵，纯化后的蛋白经过Western blot以及ELISA检测，证明此蛋白具有良好的免疫原性，成功建立表达PCV2-Cap蛋白的CHO悬浮稳转细胞系。
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