畜牧兽医学报  2019, Vol. 50 Issue (4): 893-900. DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2019.04.023    PDF    
检测纽布病毒的Real-time RT-PCR方法的建立与应用
郭紫晶1, 何琪富1, 汤承1,2, 张斌1,2, 岳华1,2     
1. 西南民族大学生命科学与技术学院, 成都 610041;
2. 国家民委青藏高原动物疫病防控创新团队, 成都 610041
摘要:纽布病毒(nebovirus,NeV)是国内新发的犊牛腹泻病原,本试验目的是建立检测NeV的real-time RT-PCR方法。根据国内NeV流行株的聚合酶基因(RdRp)序列设计引物,通过反应条件和体系优化,成功建立基于TB Green检测NeV的real-time RT-PCR方法。结果显示:该方法在2.9×101~2.9×109 copies·μL-1之间呈现良好的线性关系,线性相关系数R2=0.999 4,扩增效率为98%;该方法只特异性检出NeV,不检出常见无关病原;最低检测下限为29 copies·μL-1;批内和批间的变异系数分别为0.89%~1.89%和0.83%~1.15%;该方法对临床样本的检出率高于文献报道的三种检测方法(P < 0.05)。对2018年8-11月采自新疆和辽宁的135份奶犊牛腹泻样本中NeV的检出率为67.41%,场阳性率为100%(15/15)。所建方法的特异性和稳定性好、灵敏度高,为NeV的检测和流行病学调查提供了有力的手段。
关键词nebovirus    实时荧光定量RT-PCR    犊牛腹泻    检测    
Establishment and Application of a Real-time RT-PCR Assay for Detecting Bovine Nebovirus
GUO Zijing1, HE Qifu1, TANG Cheng1,2, ZHANG Bin1,2, YUE Hua1,2     
1. College of Life Science and Technology, Southwest Minzu University, Chengdu 610041, China;
2. Innovation Team for Animal Epidemic Diseases Prevention and Control on Qinghai-Tibet Plateau, State Ethnic Affairs Commission, Chengdu 610041, China
Abstract: Nebovirus (NeV) is an emerging causative agent of calf diarrhea in China, the aim of the study was to establish a real-time RT-PCR assay for detecting NeV. The TB Green real-time RT-PCR assay was successfully established through designing primers targeted to RdRp fragment of NeV strains in China and optimizing the reaction conditions and system. The Real-time RT-PCR assay showed a good linear relationship between 2.9×101 and 2.9×109 copies·μL-1, linear correlation coefficient R2=0.999 4, and amplification efficiency was 98%. This method only specifically detected NeV, and did not detect other unrelated pathogens; the minimum detection limit was 29 copies·μL-1; the intra-and inter-coefficients of variation were 0.89%-1.89% and 0.83%-1.15%, respectively; comparing to other three reported RT-PCR assays, the assay in this study has a significant high detection rate for NeV in clinical samples (P < 0.05). In 135 diarrhea samples of dairy cows from Xinjiang and Liaoing regions from August to November 2018, the NeV detection rate was 67.41%, and the farms positive rate was 100% (15/15). The assay for detecting NeV established in this study has a good specificity and stability, which provide an effective means for detection and epidemiological investigation of NeV.
Key words: nebovirus     real-time RT-PCR     calf diarrhea     detection    

杯状病毒(Caliciviruses)是人和动物的重要病原[1]。杆状病毒科(Caliciviridae)包括诺如病毒属(Norovirus)、札幌病毒属(Sapovirus)、水疱疹病毒属(Vesivirus)、兔病毒属(Lagovirus)和纽布病毒属(Nebovirus),其中纽布病毒(nebovirus, NeV)和牛诺如病毒(bovine norovirus, BNoV)是确定的犊牛腹泻病原[2-3]。纽布病毒属是国际分类委员会(ICTV)于2010年所确定的新病毒属,目前该属仅有一个病毒种,Newbury-1 virus(https://talk.ictvonline.org/)。NeV已在包括我国在内的12个国家检出[2, 4-13]。尽管目前尚无NeV的分离培养体系,但在排除了其他病毒的含NeV腹泻粪便无菌处理后感染新生无菌小牛,可引起肠道损伤(尤其在十二指肠和空肠最严重)和严重腹泻,从粪便中获得较高含量的病毒[2, 14-15];并且病原流行病学资料也表明该病毒与犊牛腹泻紧密相关[4, 16-17]。因此,NeV已是一种公认的致犊牛腹泻病毒。最近本实验室首次证实NeV在国内的存在,是国内犊牛腹泻的新发病毒[8];并对采集自四川、辽宁、山东、河南、陕西等省13个奶牛场的168份犊牛腹泻粪便样本进行了检测,结果显示NeV的平均检出率为41.8%,场阳性率92.3%(12/13),个别地区检出率高达66.7%,表明该病毒已在上述地区奶牛中广泛流行[17],值得进一步关注。

分析GenBank数据库中已有的6个NeV基因组(包括本实验室克隆的两个中国毒株)表明,该病毒的基因组全长为7 453~7 454 bp,由两个开放阅读框架(ORFs)组成。ORF1的长度为2 210个氨基酸,依次编码2C解旋酶/NTP酶、3C蛋白酶、3D RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)和主要衣壳蛋白(VP1);ORF2位于基因组的3′末端,编码次要衣壳蛋白(VP2)[2, 11, 18]。RdRp在杯状病毒的复制中起关键作用,其3′端相对保守,常作为分子检测靶点[19]。目前NeV的分子检测方法包括1种SYBR Green real-time RT-PCR[20]、1种巢氏RT-PCR[21]和2种常规RT-PCR[5, 22],上述检测方法的引物均靶向RdRp基因的3′端。本实验室前期克隆国内5个省的24个NeV毒株RdRp基因3′端序列,与国外所有NeV毒株RdRp基因的3′端序列相似性为75.8%~90.0%,且在遗传树共同聚为独立的一大枝,显示独特的进化趋势[17-18];序列分析发现,国内毒株RdRp序列3′端序列在上述几种方法的引物扩增位点有不同程度的点突变,有可能会影响这些方法的扩增效率。因此,本试验目的是建立检测NeV的TB Green real-time RT-PCR方法,为国内NeV的检测提供更加准确的方法。

1 材料与方法 1.1 病毒(菌)株核酸和临床样本

NeV Bo/LZB-1/17/CH毒株、牛轮状病毒(bovine rotavirus virus,BRV)、牛冠状病毒(bovine coronavirus, BCoV)、牛病毒性腹泻/黏膜病病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)Swun0603、牛诺如病毒(bovine norovirus,BNoV)、牛肠道病毒(bovine enterovirus,BEV)Swun0510、牛库布病毒(bovine kobuvirus,BKV)、牛源K99大肠杆菌分离株Swun4025、牛源都柏林沙门菌Swun3736、牛源产气荚膜梭菌Swun2930、牛源空肠弯曲杆菌Swun1639、牛源艾美尔球虫、牛源安氏隐孢子虫的核酸样本均由本实验室保存。

用于检测方法比较的样本:45份奶犊牛腹泻粪便样本,由本实验室保存,其中18份样本于2018年1月采自辽宁省3个奶牛养殖场;27份样本于2018年3月采自河南省3个奶牛养殖场。

用于NeV病原学调查的样本:135份,均为3月龄以内奶犊牛腹泻粪便,其中86份样本于2018年8—9月采集自新疆维吾尔自治区10个奶牛场;49份样本于2018年9—11月采集自辽宁省5个奶牛场。

所有样本于-80 ℃保存。

1.2 主要试剂及仪器

TrizolTM Reagent、PrimeScriptTM、克隆载体pMD19-T、EmeraldAmp PCR Master Mix (2× Premix)、TB Green Premix Ex Taq Ⅱ等购于TaKaRa公司; 大肠杆菌感受态细胞DH5α、质粒提取试剂盒购于宝生物工程(大连)股份有限公司;DNA Marker购于赛默飞公司;AXY prepTM DNA胶回收试剂盒购于Axygen公司;荧光定量PCR仪(BIOER, 中国);紫外分光光度计Cary50Probe(Vatian公司,美国);凝胶成像系统Doc2000(Bio-Rad公司,美国);高速冷冻离心机TGL-16(蜀科公司,中国)。

1.3 引物的设计与合成

利用MEGA 7.0软件分析比对GenBank中我国登录的全部24条NeV RdRp基因序列(GenBank accession No.:MG599036.1, MH718886~MH718908)和其他所有NeV RdRp基因序列,采用Primer Premier 5.0软件设计一对引物,引物信息见表 1。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

表 1 四种RT-PCR方法的引物信息 Table 1 Primers information for four kinds of RT-PCR assays
1.4 核酸提取

将临床粪便样本与PBS(1:5)充分混匀,-80 ℃冰箱中反复冻融3次,3 000 r·min-1离心10 min,上清液12 000 r·min-1离心30 min,按照Trizol Reagent说明书提取上清液总RNA,并按照反转录试剂盒说明书合成cDNA,-20 ℃保存备用;采用酚-氯仿法提取DNA,-20 ℃保存备用。

1.5 阳性标准品的制备

以NeV Bo/LZB-1/17/CH毒株cDNA为模板,根据自行设计的引物NeVF/R进行RT-PCR扩增。反应体系:EmeraldAmp PCR Master Mix 12.5 μL,NeVF和NeVR各1.0 μL,模板1.5 μL,ddH2O补足至25 μL;反应条件:94 ℃ 2 min;94 ℃ 30 s、51 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s,共35个循环,72 ℃ 5 min。反应结束后,产物用4.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定,用DNA胶回收试剂盒回收目的片段,将其克隆至pMD19-T,转化DH5α,克隆接入含氨苄青霉素的LB液体培养基中,37 ℃培养8 h,用质粒提取试剂盒提取重组质粒,送生工生物有限公司测序,测序结果正确的重组质粒作为阳性标准品。用紫外分光光度计测定上述阳性标准品的浓度,并按照以下公式换算为拷贝数,拷贝数=质粒浓度×10-9×6.02×1023/(660×质粒总长度)。

1.6 反应体系及条件的优化

采用20 μL体系(TB Green Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL,NeV阳性标准品1.5 μL,上、下游引物各1 μL,ddH2O补足至20 μL)对退火温度从45~55 ℃进行8个梯度的优化,以最小Ct值、最大产物荧光值、特异性单峰等为优化判断标准;再以最佳退火温度对浓度为10 μmol·μL-1的引物用量(0.5~1.5 μL)进行8个梯度的优化,建立基于TB Green检测NeV核酸的real-time RT-PCR方法。

1.7 熔解曲线分析和标准曲线的建立

将NeV阳性标准品10倍递增稀释,用建立的real-time RT-PCR方法分别对10-1~10-10递增稀释的标准品进行检测,分析其溶解曲线,确定线性范围,以起始模板浓度的对数为横坐标,以循环中的Ct 值为纵坐标,建立标准曲线。

1.8 特异性评价

用建立的real-time RT-PCR方法对“1.1”中待检病原的核酸样本进行检测,并设置等量RNase Free ddH2O代替模板作为阴性对照,以评价该方法的特异性。

1.9 敏感性测定

以101~1010稀释度的标准品为模板,同时设置等量RNase Free ddH2O代替模板作为阴性对照,进行real-time RT-PCR扩增,每个浓度做3个重复。

1.10 稳定性评价

分别取等量的3份不同拷贝(2.9×104、2.9×105和2.9×106 copies·μL-1)的重组质粒进行real-time RT-PCR扩增,每份样品做3个重复,以进行批内重复性试验;取以上3份样品,在同一反应条件下进行3次独立的real-time RT-PCR扩增,以进行批间重复性试验。

1.11 四种RT-PCR对临床样本中NeV核酸检出率的比较

采用所建立的real-time RT-PCR方法和常用于检测NeV的3种RT-PCR方法分别对45份奶犊牛腹泻粪便样本(“1.1”中用于检测方法比较的样本)进行检测,比较其检出率,引物信息见表 1,全部的阳性PCR产物全部送公司测序。

1.12 临床样本的检测

利用本试验建立的方法对135份奶犊牛腹泻粪便样本(“1.1”中用于NeV病原学调查的样本)进行NeV的病原检测。从检出为阳性的样本中随机挑选20%进行测序。

2 结果 2.1 引物的特异性

用自行设计的引物从NeV Bo/LZB-1/17/CH毒株cDNA中扩增出约90 bp片段(图 1),测序结果证明目的片段长度为90 bp,大小与预期结果相符,与GenBank中NeV聚合酶基因的相似性为100%,为NeV聚合酶基因的特异序列。

M.DNA相对分子质量标准;+.阳性样品;-.阴性对照 M.Gene ruler ultra low range DNA ladder; +.NeV positive sample; -.Negative control 图 1 引物扩增片段电泳鉴定 Fig. 1 Gel electrophoresis of amplification fragment by specific primers
2.2 优化的real-time RT-PCR反应体系及条件

优化的20 μL反应体系:TB Green Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL,上、下游引物各1.0 μL,模板1.5 μL,用ddH2O补齐到20 μL。反应条件:95 ℃ 1 min;95 ℃ 15 s、51 ℃ 30 s,共40个循环;熔解段95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min、95 ℃,15 s,1个循环,反应结束。

2.3 标准曲线及熔解曲线

紫外分光光度计测得阳性标准品的浓度为86 ng·μL-1,换算出其拷贝数为2.9×1010 copies·μL-1。参照上述优化后的反应条件进行反应,建立的方法在阳性模板浓度为2.9×101~2.9×109 copies·μL-1之间呈现良好的线性关系(图 2),标准曲线为y=-3.367x+39.604,相关系数R2值为0.999 4,扩增效率为98%。说明该方法线性关系良好、扩增效率好。熔解曲线结果显示,PCR产物在(86±3) ℃均出现单一波峰,无引物二聚体和非特异扩增峰(图 3)。

图 2 NeV real-time RT-PCR方法的标准曲线 Fig. 2 Standard curve of real-time RT-PCR for nebovirus
图 3 NeV real-time RT-PCR检测方法的熔解曲线 Fig. 3 Melting curve of real-time RT-PCR for nebovirus
2.4 方法的特异性

用所建方法对NeV、BRV、BCoV、BVDV、BNoV、BEV、BKV、牛源K99大肠杆菌、牛源都柏林沙门菌、牛源产气荚膜梭菌、牛源空肠弯曲杆菌、牛源艾美尔球虫、牛源安氏隐孢子虫的核酸样本进行检测。检测结果表明,该方法仅对NeV具有良好的扩增曲线,其他无关病原均为阴性(图 4)。

1. NeV标准品模板;2~13.BRV、BCoV、BVDV、BNoV、BEV、BKV、Swun4025、Swun3736、Swun2930、Swun1639、牛源艾美尔球虫、牛源安氏隐孢子虫;N.阴性对照 1. Nebovirus positive samples; 2-13. BRV, BCoV, BVDV, BNoV, BEV, BKV, Swun4025, Swun3736, Swun2930, Swun1639, Eimeria, Cryptosporidium; N. Negative control 图 4 Real-time RT-PCR的特异性 Fig. 4 The specificity test of the real-time RT-PCR
2.5 方法的敏感性

将标准阳性质粒(2.9×1010 copies·μL-1)作10递增稀释,以101~1010稀释度的标准品为模板,同时设置等量RNase Free ddH2O代替模板作为阴性对照进行real-time RT-PCR扩增。稀释度为101~109均具有特异性扩增曲线,因此计算出该方法所能检出的最低拷贝数为29 copies·μL-1(图 5)。

1~10.2.9×109~2.9×100 copies·μL-1;N.阴性对照 1-10. 2.9×109~2.9×100 copies·μL-1; N. Negative control 图 5 Real-time RT-PCR的敏感性 Fig. 5 The sensitivity test of the real-time RT-PCR
2.6 方法的稳定性

所建立的方法的批内变异系数CV为0.89%~ 1.89%,批间变异系数为0.83%~1.15%(表 2),表明该方法具有良好的稳定性。

表 2 Real-time RT-PCR的稳定性(n=3) Table 2 Stable test of the real-time PCR (n=3)
2.7 四种方法对临床样本的检出率

4种检测方法对45份奶犊牛腹泻样本中NeV的检测结果见表 3,所建方法的检出率明显高于其他3种方法(P<0.05),本方法检出的全部阳性样本经测序证实均为NeV的目的基因片段,且检出的阳性样本包括了其他3种方法所检出的所有阳性样本。

表 3 四种方法检出率 Table 3 The detection rate of four kinds of RT-PCR assay
2.8 临床样本中NeV的检出率

用建立的real-time RT-PCR方法对135份奶犊牛腹泻粪便样本进行检测,NeV的检出率为67.41%,场阳性率为100% (15/15),检测结果见表 4。对随机挑选的18份阳性样本(20%)进行测序,证实均为NeV目的基因片段,证明所建方法的准确性。部分临床腹泻粪便样本的检测结果见图 6

表 4 临床样本中NeV的检测结果 Table 4 The detection result of nebovirus in clinical samples
图 6 部分临床样本的检测结果 Fig. 6 The detection result of partial clinical samples
3 讨论

犊牛腹泻是临床上一类最常见的疾病,给养牛业造成了严重损失。犊牛腹泻病因复杂,其中病毒感染是引起腹泻的重要原因[23]。研究表明,除了BCoV、BRV、BVDV等常见致犊牛腹泻病毒以外[24-27],NeV、BNoV和Torovirus等新发病毒在犊牛腹泻中也受到越来越多的关注[17, 24, 28-29]。NeV是2010年国际分类委员会(ICTV)新确定的病毒属,目前该病毒已在包括我国在内的12个国家检出[2, 4-13],在美国的中西部和土耳其等地的犊牛腹泻样本中检出率较高,已经成为该地区犊牛腹泻的重要病原[5, 16]。本实验室前期证明NeV在国内的存在,是国内犊牛腹泻的新发病毒[8];并且该病毒已经在四川省、辽宁省、山东省、河南省、陕西省的奶牛中广泛流行,可能是该地区奶牛腹泻的重要病原[17]。因此,进一步加强对奶牛NeV的检测对犊牛腹泻的防控有重要意义。

准确的诊断是疫病科学防控的前提,特异、灵敏的检测方法对疫病的诊断和流行病学调查有重要意义。目前,常用的NeV RT-PCR检测方法的靶基因均为RdRp,尽管RdRp基因在杯状病毒科成员中相对保守,但是也存在遗传多样性[10-11, 28],并表现出一定的地域特征[12, 17]。笔者根据本实验室前期克隆的国内5个省的24个NeV流行毒株3′端RdRp基因序列,成功建立了基于TB Green的检测NeV real-time RT-PCR方法。该方法特异性和稳定性好,灵敏性高,与国外文献报道的三种常用检测NeV病毒的RT-PCR方法相比,大大提高了临床样本中NeV的检出率,这对保障NeV检测结果的准确性有重要意义。进一步分析发现,文献报道的SYBR Green real-time RT-PCR方法[20]的上游引物(20个碱基)扩增位点在国内NeV毒株序列的第7、13、16、17、19位可发生突变(T→C、T→C、C→T、A→G、A→T),其中第7位和第19位的碱基(T→C、A→T)在我国所有24个NeV毒株发生共同突变,第16位碱基(C→T)在其中的20个NeV毒株发生共同突变;该方法的下游引物扩增位点在我国NeV毒株序列第3、16、20位发生突变(A→G、G→A、A→T);这些碱基突变很可能会影响扩增效率,从而导致该方法对临床样本的检出率低于本试验中建立的方法,甚至低于国外报道的巢氏RT-PCR[21]。而本试验建立的方法与常用的巢氏RT-PCR[21]及普通RT-PCR[22]相比,该方法灵敏度(29 copies·μL-1)高于文献报道的巢氏RT-PCR(1.1×102 copies·μL-1)及普通RT-PCR方法(1.1×105 copies·μL-1)的灵敏度,且这两种检测方法的引物扩增位点在国内NeV毒株序列上也有不同程度的碱基突变,这可能是这两种方法对临床样本的检出率低于本试验所建方法的原因。

新疆作为我国主要的奶牛产区之一,NeV的存在及流行情况仍不清楚。用本试验中建立的real-time RT-PCR方法对2018年8月新疆维吾尔自治区10个奶牛养殖场的86份奶牛腹泻样本进行检测,NeV的检出率为65.12%,场阳性率100%,证明该病毒已在新疆奶牛中广泛流行。笔者先前对2018年1月采集自辽宁省3个农场18份奶牛腹泻样本进行检测,NeV的检出率为66.67%[17]。此次又对重新采自辽宁省5个养殖场的49份奶牛腹泻样本进行检测,NeV的检出率为71.42%,两次检测结果相似,表明辽宁省NeV的感染率很高。这一结果对上述2个省区的犊牛腹泻防控提供了重要参考。近年来我国犊牛腹泻严重、难以控制,这可能与病原的种类增加、新发病原感染率高、混合感染严重等有关[17, 30-31]。结合笔者实验室先前的调查结果,表明NeV已在我国新疆、四川、辽宁、山东、河南、陕西等省的奶牛中广泛流行,可能是这些地区奶牛腹泻的重要病原,应该将其纳入常规的病原诊断中。

4 结论

成功建立基于TB Green的检测NeV real-time RT-PCR方法,特异性和重复性好,灵敏性高,对临床样本中NeV的检出率明显高于国外文献报道的三种常用RT-PCR方法,为NeV的检测和流行病学调查提供了新的技术手段;新疆和辽宁省的奶牛腹泻粪便样本中NeV阳性率很高;结合我们前期调查结果表明,NeV作为一个国内牛新发病毒,已经在部分省区流行,可能是一个重要的犊牛腹泻病毒,需要引起高度关注。

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