大豆抗原蛋白是大豆中的主要致敏因子，依据蛋白质沉降系数可将大豆抗原蛋白分为2S、7S、11S等，是大豆中最易引起过敏的蛋白质[1-2]，相对分子质量为140~180 ku，约占大豆总蛋白的10.0%~12.7%[3]。7S是沉降系数为7S的β-伴大豆球蛋白，由三个亚基(α′、α和β，相对分子质量分别为68、72和52 ku)组成的三聚体结构。β-伴大豆球蛋白主要引起仔猪、犊牛等幼龄动物，特别是断奶仔猪的过敏反应，主要表现为免疫功能紊乱和肠道损伤[4]。根据动物肠道吸收蛋白的规律，β-伴大豆球蛋白在小肠含量最高[5]。肠道不仅是消化、吸收营养物质的重要场所，也是机体的重要免疫屏障[6]。位于肠道第一层的肠上皮细胞，对隔离外界环境起着重要作用，小肠上皮细胞的增殖、迁移、分化、凋亡的动态平衡是肠屏障功能正常发挥的前提和基础[7]，IPEC-J2细胞是小肠的功能细胞，此细胞系来源于仔猪空肠上皮细胞。IPEC-J2是非转化的非致瘤性肠上皮细胞系，具有与体内活性相当的分化特征，适合用于体外模型[8]。
NO在炎症反应的发生和信号传导方面发挥重要作用，并且影响炎症反应的进程，如影响NF-κB信号转导通路，调节IκB的活性，影响组胺、5-羟色胺(5-HT)、白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)等炎症因子的表达[9-10]。大豆富含的L-精氨酸是一氧化氮(NO)[11]的前体，它在一氧化氮合成酶(NOS)催化L-精氨酸的过程中产生，并作为细胞炎症介质[12]。高浓度的iNOS可能与细胞表面的受体结合，最终激活NF-κB。转录因子NF-κB在免疫系统中发挥重要作用，并调节细胞因子、生长因子和效应酶的表达，与免疫中涉及的许多受体[13]的结合。它还调节超过500个参与炎症和免疫反应的基因的表达[14-15]。正常细胞中NF-κB家族因子以不活跃的二聚体形式存在，抑制IκB的活性，炎性细胞因子刺激细胞，导致IκB磷酸化，激活NF-κB，进而刺激促炎因子的释放[7]。PDTC现被用作NF-κB的强效抑制剂，它既能抵抗自由基的毒性作用，也能抑制促炎性细胞因子的生成[16]。Nω-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)，属于一种非特异性NOS抑制剂，能同时抑制nNOS、eNOS和iNOS的表达[17]。
笔者构建IPEC-J2细胞模型，拟通过ELISA、PCR和Western blot等方法在细胞及分子水平上研究不同浓度β-伴大豆球蛋白及iNOS和NF-κB抑制剂对IPEC-J2细胞存活率以及相关炎性因子、蛋白和mRNA表达量的影响，这为探索β-伴大豆球蛋白引发仔猪肠道过敏反应的分子机制提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 主要实验材料β-伴大豆球蛋白由中国农业大学食品工程学院提供(专利号：200410029589.4，中国)，再由安徽农业大学动物科技学院进一步提纯(β-伴大豆球蛋白纯度为91.3%)。IPEC-J2细胞购自武汉农业科学院细胞库，RPMI 1640培养基购自美国Thermo公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒购自Biosharp，β-actin(MG3)Mouse Monoclonal Antibody购自北京锐抗生物科技有限公司，HRP辣根酶标记山羊抗兔IgG二抗和山羊抗鼠二抗购自Biosharp，p-NF-κB抗体(Ser 536)购自Santa cruz，诱导型一氧化氮合酶蛋白(iNOS)和环氧化酶2蛋白(COX 2)抗体购自Novus，PDTC和L-NAME购自碧云天生物技术公司。IL-6、NO、5-HT、白细胞介素10(IL-10)、二胺氧化酶(DAO)ELISA试剂盒购自江苏酶标生物有限公司。
1.2 试验设计本试验采用随机分组设计，取对数生长期的IPEC-J2细胞，以1×105个·mL-1的密度接种于6孔细胞培养板。置于37 ℃、5% CO2饱和湿度下培养至细胞贴壁，分为六组：A(对照组)、B(1 mg·mL-1 β-伴大豆球蛋白组)、C(5 mg·mL-1 β-伴大豆球蛋白组)、D(10 mg·mL-1 β-伴大豆球蛋白组)、E(5 mg·mL-1 β-伴大豆球蛋白+PDTC组)、F(5 mg·mL-1 β-伴大豆球蛋白+L-NAME组)，在A~F各组中分别添加0、1、5、10、5、5 mg·mL-1 β-伴大豆球蛋白，并且在E和F组分别添加1 μmol·L-1 PDTC和L-NAME，每个浓度组均设置3个重复(预试验发现D组存活率过低，C组适中，因此选用C组作为对照组添加抑制剂)。
1.3 CCK-8法检测IPEC-J2细胞存活率在各组IPEC-J2细胞中添加不同浓度的β-伴大豆球蛋白和抑制剂后继续培养8、16、24 h，之后再向每孔中加入10 μL CCK-8试剂，放入细胞培养箱中继续培养，直至出现明显的颜色反应。在酶标仪450 nm波长下读取OD值，计算细胞存活率。
1.4 倒置生物显微镜观察7S对IPEC-J2细胞形态的影响取处于对数生长期的IPEC-J2细胞，接种细胞培养瓶中，置于37 ℃、5% CO2饱和湿度下培养至细胞贴壁，在各组IPEC-J2细胞中添加不同浓度的7S和抑制剂后继续培养24 h，用倒置生物显微镜，观察细胞形态和数量的变化。
1.5 ELISA法检测IPEC-J2细胞5-HT、IL-6、IL-10、NO和DAO的含量IPEC-J2细胞经过不同浓度7S β-伴大豆球蛋白和相应抑制剂处理培养24 h后，收集细胞，1 000 r·min-1转速下离心5 min，用PBS洗涤3次。之后向每个样品中加入500 μL含0.1%Triton X-100的0.1 mol·L-1 Tris-HCl (pH=7.4)，将样品放入冰水中进行超声裂解。将细胞裂解液以1 000 g·min-1离心10 min，收取上清液，按照ELISA试剂盒说明书中详细操作步骤进行测定，计算5-HT、IL-6、IL-10、NO和DAO的含量。
1.6 Western blot法检测p-NF-κB p65、iNOS、COX-2蛋白表达量IPEC-J2细胞经过不同浓度7S β-伴大豆球蛋白和相应抑制剂处理培养24 h后，收集细胞，加入混有蛋白酶抑制剂以及蛋白磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液，漩涡振荡器混合均匀，置于冰上20 min使细胞充分裂解。之后14 000 g离心10 min，收集上清液。按照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书进行操作，并根据标准曲线算出蛋白浓度。将提取的蛋白质样品煮沸5 min，在SDS-PAGE凝胶中电泳，然后转移到PVDF膜。用牛血清白蛋白(BSA)在室温下封闭膜4 h后，放入一抗在4 ℃孵育过夜。将膜洗涤三次，并用二抗在室温下水平振荡孵育45 min，洗膜后放入凝胶成像系统(Bio-Rad)中成像。
1.7 qPCR法检测NF-κB p65、iNOS、IKKβ、IKKα和COX-2 mRNA相对转录量IPEC-J2细胞经过不同浓度7S β-伴大豆球蛋白和相应抑制剂处理培养24 h后，收集细胞，用Trizol法提取RNA，用紫外分光光度计在260 nm测定吸光度值，进行RNA纯度检测。qRT-PCR反应体系为20 μL：cDNA 2 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，PCR Master Mix(2 ×) 10 μL，dd H2O 6 μL。目的基因及β-actin内参引物序列见表 1，引物由生工生物工程股份有限公司根据GenBank设计合成。
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表 1 基因引物参数 Table 1 Primer parameters of the genes |
本试验数据均以“x±sx”表示，利用SPSS17.0统计软件进行单因素方差分析。运用GraphPad Prism 7.0数据软件进行柱状图的绘制。Western blot结果采用Quantity One软件进行灰度值分析。
2 结果 2.1 7S β-伴大豆球蛋白对IPEC-J2细胞存活率的影响由图 1可知，各组IPEC-J2细胞活性差异在24 h时最显著，细胞的存活率随着7S β-伴大豆球蛋白浓度的增加而降低，与A组相比B组细胞存活率无显著差异(P＞0.05)，C、D组细胞存活率极显著降低(P＜0.01)。与C组相比，E、F组细胞存活率显著增加(P＜0.05)。
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A.对照组; B. 1 mg·mL-1 β-伴大豆球蛋白; C. 5 mg·mL-1 β-伴大豆球蛋白; D. 10 mg·mL-1 β-伴大豆球蛋白; E. 5 mg·mL-1 β-伴大豆球蛋白+ 1 μmol·L-1 PDTC; F. 5 mg·mL-1 β-伴大豆球蛋白+1 μmol·L-1 L-NAME A. Control group; B. 1 mg·mL-1 β-conglycinin; C. 5 mg·mL-1 β-conglycinin; D. 10 mg·mL-1 β-conglycinin; E. 5 mg·mL-1 β-conglycinin + 1 μmol·L-1 PDTC; F. 5 mg·mL-1 β-conglycinin + 1 μmol·L-1 L-NAME 图 1 7S β-伴大豆球蛋白对IPEC-J2细胞活性的影响 Fig. 1 Effects of 7S β-conglycinin on IPEC-J2 cell activity |
由图 2可知，A组细胞多为不规则多边形，轮廓清晰，贴壁状态良好。B组细胞贴壁细胞数量减少，C、D组大量细胞脱落，细胞形态异常。与C组相比，E、F组贴壁不完全的细胞较少，脱落细胞较少。
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A.对照组; B. 1 mg·mL-1 β-伴大豆球蛋白; C. 5 mg·mL-1 β-伴大豆球蛋白; D. 10 mg·mL-1 β-伴大豆球蛋白; E. 5 mg·mL-1 β-伴大豆球蛋白+ 1 μmol·L-1 PDTC; F. 5 mg·mL-1 β-伴大豆球蛋白+1 μmol·L-1 L-NAME A. Control group; B. 1 mg·mL-1 β-conglycinin; C. 5 mg·mL-1 β-conglycinin; D. 10 mg·mL-1 β-conglycinin; E. 5 mg·mL-1 β-conglycinin + 1 μmol·L-1 PDTC; F. 5 mg·mL-1 β-conglycinin + 1 μmol·L-1 L-NAME 图 2 7S β-伴大豆球蛋白对IPEC-J2细胞生长状态的影响(400×) Fig. 2 Effects of 7S β-conglycinin on growth state in IPEC-J2 cells (400×) |
由图 3可知，与A组相比，B组NO、IL-6和DAO含量显著或极显著增高(P＜0.05或P＜0.01)，IL-10含量极显著降低(P＜0.01)；C、D组5-HT、NO、IL-6、DAO含量极显著增高(P＜0.01)，IL-10含量极显著降低(P＜0.01)。与C组相比，E、F组5-HT、NO、IL-6、DAO含量显著或极显著降低(P＜0.05或P＜0.01)，IL-10含量极显著增高(P＜0.01)。
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A.对照组; B. 1 mg·mL-1 β-伴大豆球蛋白; C. 5 mg·mL-1 β-伴大豆球蛋白; D. 10 mg·mL-1 β-伴大豆球蛋白; E. 5 mg·mL-1 β-伴大豆球蛋白+ 1 μmol·L-1 PDTC; F. 5 mg·mL-1 β-伴大豆球蛋白+1 μmol·L-1 L-NAME。与对照组相比，*.P＜0.05；**. P＜0.01；与C组相比，#.P＜0.05；##. P＜0.01(下图同) A. Control group; B. 1 mg·mL-1 β-conglycinin; C. 5 mg·mL-1 β-conglycinin; D. 10 mg·mL-1 β-conglycinin; E. 5 mg·mL-1 β-conglycinin + 1 μmol·L-1 PDTC; F. 5 mg·mL-1 β-conglycinin + 1 μmol·L-1 L-NAME. Compared with control group, *.P < 0.05;**. P < 0.01; Compared with group C, #.P < 0.05;##. P < 0.01 (The same as below) 图 3 7S β-伴大豆球蛋白对IPEC-J2细胞5-HT、NO、IL-6、IL-10和DAO含量的影响 Fig. 3 Effects of 7S β-conglycinin on 5-HT, NO, IL-6, IL-10 and DAO contents in IPEC-J2 cells |
如图 4所示，与A组相比，B组iNOS蛋白表达量显著增高，C、D组p-NF-κB p65、iNOS和COX-2蛋白表达量显著或极显著增高(P＜0.05或P＜0.01)。与C组相比，E组p-NF-κB p65和COX-2蛋白表达量极显著降低(P＜0.01)，F组p-NF-κB p65、iNOS和COX-2蛋白表达量显著或极显著降低(P＜0.05或P＜0.01)。
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A.对照组; B. 1 mg·mL-1 β-伴大豆球蛋白; C. 5 mg·mL-1 β-伴大豆球蛋白; D. 10 mg·mL-1 β-伴大豆球蛋白; E. 5 mg·mL-1 β-伴大豆球蛋白+ 1 μmol·L-1 PDTC; F. 5 mg·mL-1 β-伴大豆球蛋白+1 μmol·L-1 L-NAME A. Control group; B. 1 mg·mL-1 β-conglycinin; C. 5 mg·mL-1 β-conglycinin; D. 10 mg·mL-1 β-conglycinin; E. 5 mg·mL-1 β-conglycinin + 1 μmol·L-1 PDTC; F. 5 mg·mL-1 β-conglycinin + 1 μmol·L-1 L-NAME 图 4 7S β-伴大豆球蛋白对IPEC-J2细胞p-NF-κB p65、iNOS和COX-2蛋白表达量的影响 Fig. 4 Effects of 7S β-conglycinin on the expression of p-NF-κB p65, iNOS and COX-2 proteins in IPEC-J2 cells |
如图 5所示，与A组相比，B组NF-κB p65、iNOS、COX-2 mRNA相对转录量显著或极显著增高(P＜0.05或P＜0.01)，C、D组NF-κB p65、iNOS、COX-2 mRNA相对转录量极显著增高(P＜0.01)。与C组相比，E、F组NF-κB p65、iNOS、COX-2 mRNA相对转录量极显著降低(P＜0.01)。
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A.对照组; B. 1 mg·mL-1 β-伴大豆球蛋白; C. 5 mg·mL-1 β-伴大豆球蛋白; D. 10 mg·mL-1 β-伴大豆球蛋白; E. 5 mg·mL-1 β-伴大豆球蛋白+ 1 μmol·L-1 PDTC; F. 5 mg·mL-1 β-伴大豆球蛋白+1 μmol·L-1 L-NAME A. Control group; B. 1 mg·mL-1 β-conglycinin; C. 5 mg·mL-1 β-conglycinin; D. 10 mg·mL-1 β-conglycinin; E. 5 mg·mL-1 β-conglycinin + 1 μmol·L-1 PDTC; F. 5 mg·mL-1 β-conglycinin + 1 μmol·L-1 L-NAME 图 5 7S β-伴大豆球蛋白对IPEC-J2细胞NF-κB p65、iNOS、IKKβ、IKKα和COX-2 mRNA的影响 Fig. 5 Effects of 7S β-conglycinin on the relative transcription of NF-κB p65, iNOS, IKKβ, IKKα and COX-2 mRNA in IPEC-J2 cells |
研究发现，β-伴大豆球蛋白通过抑制肠细胞的生长，破坏细胞骨架，诱导仔猪细胞凋亡而引起肠道损伤[18]。Zhao等[19]使用IPEC-J2模型评估β-伴大豆球蛋白诱导的上皮渗透性、完整性、代谢活性及紧密连接(TJ)分布和表达的变化，发现β-伴大豆球蛋白能抑制IPEC-J2细胞增殖，并且促进IPEC-J2细胞凋亡，随着β-伴大豆球蛋白浓度的增加，紧密连接occludin和ZO-1 mRNA表达下降。本试验发现，IPEC-J2细胞的存活率及贴壁细胞数量随着β-伴大豆球蛋白浓度的增加而降低。Chen等[12]评估了不同浓度β-伴大豆球蛋白(0~1 500 μg·mL-1)和培养时间(48或72 h)对猪小肠上皮细胞增殖和蛋白质组的影响，发现β-伴大豆球蛋白通过抑制肠细胞生长直接诱导肠损伤，破坏细胞骨架并导致仔猪肠道细胞凋亡。王俊[20]研究发现，随着β-伴大豆球蛋白及其酶解肽浓度的升高，IPEC-J2细胞总数量明显减少，细胞表现为不规则形态且轮廓不清，随着时间的增加，细胞出现凋亡。与本试验通过倒置显微镜观察到IPEC-J2细胞的形态学变化相符合。试验发现添加5 mg·mL-1 β-伴大豆球蛋白和1 μmol·L-1 NF-κB(PDTC)或iNOS(L-NAME)抑制剂的细胞存活率及贴壁细胞数量高于仅添加5 mg·mL-1 β-伴大豆球蛋白的细胞，说明PDTC和L-NAME可抑制β-伴大豆球蛋白对细胞的损伤。
ELISA结果显示细胞中NO、IL-6和DAO含量随添加的β-伴大豆球蛋白浓度增大而增高。曹程鸣等[21]通过体内试验发现，大豆抗原蛋白降低仔猪肠道绒毛长度，增加断奶仔猪血浆DAO水平，Wu等[22-23]通过给断奶仔猪饲喂β-伴大豆球蛋白，发现β-伴大豆球蛋白诱导过敏反应，破坏断奶仔猪的肠黏膜免疫屏障，增加肠道通透性和促进断奶仔猪的sIgA合成，增加仔猪血清IL-6和5-HT等炎性因子水平，引起仔猪体液和细胞免疫应答，与本试验结果相符合。ELISA结果显示IL-10含量随β-伴大豆球蛋白浓度增大而降低，与刘欣[24]用大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白灌胃小鼠得到的结果一致。
张建中和卢建军[25]研究发现，大豆抗原蛋白对断奶仔猪肠道造成损伤的原因可能与其提高了肠道黏膜NF-κB的活性，引起细胞因子过度表达，导致肠道炎症反应有关。本试验发现β-伴大豆球蛋白刺激IPEC-J2细胞p-NF-κB p65、iNOS和COX-2蛋白表达和NF-κB p65、iNOS、COX-2、IKKα和IKKβ mRNA的相对表达，在5 mg·mL-1 β-伴大豆球蛋白的基础上，添加1 μmol·L-1 NF-κB(PDTC)或iNOS(L-NAME)抑制剂后β-伴大豆球蛋白的作用受到抑制，说明β-伴大豆球蛋白通过NF-κB信号通路引起细胞损伤。前期研究发现NF-κB可上调促炎基因并增强炎症活性[14]，导致炎症介质的产生[15, 26-27]，与本试验结果相符合。王新等[28]研究发现给大鼠胃内注射L-NAME抑制剂能使肝硬化大鼠胃肠道中各型NOS的表达减少，这说明L-NAME抑制剂能干预调节NOS的表达。周艳梅[16]研究发现PDTC既能抵抗自由基的毒性作用，也能抑制促炎性细胞因子的生成，与本研究结果相符合。
4 结论β-伴大豆球蛋白通过NF-κB信号通路促进炎性细胞因子NO、5-HT、IL-6和DAO的分泌、降低IL-10的分泌、增加p-NF-κB p65、iNOS和COX-2的蛋白表达及NF-κB p65、IKKβ、iNOS、IKKα和COX-2 mRNA的相对表达引起IPEC-J2细胞损伤，添加PDTC和L-NAME后抑制了β-伴大豆球蛋白对细胞的致敏作用。
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