产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic E. coli, ETEC)是引起新生和断奶仔猪腹泻(post-weaning diarrhea, PWD)的最重要的病原之一。国内约有35%的仔猪腹泻是由ETEC引起的，美国等国家新生仔猪腹泻中，由ETEC引起的占45%以上[1]。因此，ETEC感染给养猪业带来了巨大经济损失。疫苗接种仍是预防和控制仔猪感染ETEC及其他细菌性疾病一种安全有效的手段。ETEC等肠道致病菌黏附并定植于肠上皮细胞是它们致病的前提[2]，与此同时，在细菌与肠上皮细胞相互作用过程中，肠上皮细胞会通过模式识别受体感知这些病原微生物以及它们的代谢产物, 并将信号转化为宿主的免疫反应[3]。
猪肠上皮细胞系IPEC-J2分离于新生仔猪空肠中段，是研究宿主与ETEC等肠道病原菌互作的最佳试验材料之一[4]。大量的研究表明，ETEC感染会削弱肠上皮细胞的黏膜屏障功能，主要表现在抑制和降解黏蛋白，抗菌蛋白或者使相关紧密连接蛋白发生重新排列[5-14]。因此，为有效抵抗ETEC的入侵，肠上皮细胞一方面需分泌一系列的促炎细胞因子和趋化因子用以招募相关的白细胞和效应细胞到感染部位以清除细菌；另一方面需要及时的修复受损的肠黏膜屏障功能。
白细胞介素-17(IL-17)相关细胞因子主要诱导炎性因子的表达和诱发自身免疫病的炎症反应。该细胞因子家族包括6个成员，分别是IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E(也称IL-25)和IL-17F[15]。越来越多的证据表明，除诱导炎性反应外，IL-17A和IL-17F在宿主防御病原微生物(如细菌和真菌等)的感染中发挥着重要作用。该细胞因子在病原刺激后能通过诱导肠上皮细胞中相关紧密连接蛋白、黏蛋白和抗菌蛋白的表达而增强肠黏膜屏障功能[16-18]。与此类似，IL-17C及其受体IL-17RE主要表达于上皮细胞，在肠上皮细胞中也能诱导抗菌蛋白的表达[19-21]。因此，IL-17细胞因子家族在肠道细菌感染与肠黏膜免疫中发挥着重要的调控作用。
目前，关于IL-17细胞因子及其肠道免疫调节的研究集中于人及小鼠模型中。尽管前期研究表明ETEC感染能诱导猪肠道中IL-17A、IL-17B及IL-17F基因的表达[22-23]，但对于ETEC感染后猪肠上皮细胞是否直接参与IL-17细胞因子的合成及免疫功能调控机制却未见报道。因此，本试验以IPEC-J2为研究对象，首先通过RT-PCR、ELISA、免疫印迹及免疫荧光分析了ETEC感染后IL-17细胞因子各成员及肠上皮黏膜免疫相关基因(mucin-2、claudin-1、claudin-2、pBD-2)的表达变化，然后进一步研究了IL-17相关细胞因子对肠上皮黏膜免疫相关基因(mucin-2、claudin-1、claudin-2、pBD-2)的调控作用，初步阐明了IL-17细胞因子在抗细菌感染和肠道黏膜免疫中的作用机制。
1 材料与方法 1.1 试验菌株与细胞系猪肠上皮细胞系IPEC-J2购自广州吉妮欧生物公司，ETEC标准株C83901(O8:K87:F4ab, LT+)及大肠杆菌无毒株HB101分别购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心和中国普通微生物菌种保藏管理中心。细菌的培养参照之前报道的方法[23], 先将冻干菌株置于脑心浸出液(BHI，Oxoid，英国)琼脂平板中复苏，然后挑取单菌落细菌至LB培养基中继续培养。冰冻IPEC-J2细胞复苏后置于T75细胞培养瓶中进行培养，培养基选用DMEM杜氏改良Eagle培养基(DMEM/F12, 1：1, Thermo Fisher Scientific)，其中含5%新生胎牛血清(杭州四季青，中国)，2 mmoL·L-1 L-谷氨酰胺(Thermo Fisher Scientific，美国)，1×Insulin/Transferrin/Selenium (ITS, Sigma-Aldrich，加拿大), 100 U·mL-1盘尼西林(Thermo Fisher Scientific，美国)，100 μg·mL-1链霉素(Thermo Fisher Scientific，美国)和5 ng·mL-1人表皮生长因子(EGF, Thermo Fisher Scientific，美国)。细胞每隔24 h换液一次，培养至第5天时将细胞(5×105·孔-1)种植于提前加入细胞爬片的24孔细胞培养板(Corning，美国)中，于CO2细胞培养箱(Thermo 3110，德国)中继续培养。24 h后更换细胞培养液(培养液中不含胎牛血清)以诱导细胞的分化，细胞继续培养24 h后用于细胞感染试验和细胞因子刺激试验。
1.2 细胞感染试验细胞感染前，将诱导分化的细胞重置于上述的细胞培养液中(不含胎牛血清及抗生素)静置培养2 h。然后以细菌/细胞感染比100：1加入C83901或者HB101，对照组加入等量的PBS。细菌接种1 h后，用PBS洗涤3次以去除未黏附的细菌，接着置于细胞培养液(培养液中不含胎牛血清+50 μg·mL-1庆大霉素)中继续培养。分别在1、3 h后收获细胞及23 h后收获细胞及培养上清。细胞直接用TRIzol Reagent(Thermo Fisher Scientific，美国)或者RIPA蛋白裂解液(碧云天，中国)处理后用于RNA的分离和细胞蛋白提取，细胞上清冻存于-80 ℃用于细胞因子的ELISA检测。感染24 h后细胞爬片内的细胞首先用4%的多聚甲醛常温固定5 min，然后和相关抗体进行孵育和荧光染色。
1.3 细胞因子刺激试验将诱导分化的细胞重置于上述的细胞培养液中(不含胎牛血清及抗生素)静置培养2 h后，分别添加IL-17A(100 ng·mL-1, Kingfisher biotech, 美国)，IL-17C(20 ng·mL-1, MyBioSource，美国)或者等量PBS继续培养24 h。然后收集细胞并按照上述方法进行RNA及蛋白的分离提取，细胞爬片上的细胞首先用4%的多聚甲醛常温固定5 min，然后和相关抗体孵育并进行荧光染色。
1.4 qRT-PCR检测基因mRNA相对表达量 1.4.1 总RNA提取和反转录TRIzol法提取细菌感染2、4 h及细胞因子刺激24 h后IPEC-J2细胞总RNA，NanoDrop 2000超微量分光光度计(Thermo，德国)测定其浓度及纯度，选择OD260 nm/OD280 nm为1.8~2.0及OD260 nm/OD230 nm为1.9~2.1的RNA样品，经1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，选择完整性好的RNA，将1 μg总RNA按照反转录试剂盒(Invitrogen，美国)操作说明，用随机引物(Invitrogen，美国)，采用两步法合成第一链cDNA，-20 ℃冰箱保存。
1.4.2 引物设计与合成引物来源于文献或利用Primer Premier5.0设计，然后用NCBI中的BLAST检测引物特异性，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表 1)。
|
表 1 荧光定量PCR引物序列 Table 1 Primer sequences used for real-time PCR |
利用StepOnePlus real-time PCR system (Applied Biosystems，美国)进行qRT-PCR分析。qRT-PCR反应体系为20 μL：2× SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems，美国) 10 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 5 μL，加水补足至20 μL。每个样品设计3个重复。反应程序：95 ℃ 3 min；95 ℃15 s, 退火30 s，72 ℃延伸30 s，40个循环。以GAPDH和β-actin为内参基因，通过2-ΔΔCt法计算各目的基因的相对表达量。
1.5 免疫荧光染色将上述多聚甲醛固定后的细胞首先和相关一抗——生物素化的兔抗猪IL-17A(2.5 μg·mL-1, Kingfisher biotech，美国)或兔抗-mucin-2 (0.2 μg·mL-1, sc-15334，Santa Cruz Biotechnology，美国)，室温孵育1 h。PBS洗涤3次后将IL-17A及mucin-2孵育后的细胞分别置于异硫氰酸荧光素(FITC)标记的链霉亲和素(2.5 μg·mL-1, Biolegend, 英国)及德克萨斯红标记的羊抗兔二抗(5 μg·mL-1, Thermo Fisher Scientific，美国)室温孵育1 h。PBS洗涤后置于Hoechst (10 μg·mL-1, Sigma-Aldrich，加拿大)中核染5 min。将染色后的细胞爬片用蒸馏水洗涤后用含0.223 mol·L-1 1, 4-二氮杂二环的甘油(Sigma-Aldrich，加拿大)封片，然后荧光显微镜镜检(奥林巴斯BX43，日本)。
1.6 ELISA检测IL-17A、IL-17C将-80 ℃冻存的细胞上清放置室温后，用ELISA试剂盒(MyBioSource，美国)分别检测细菌感染24 h后细胞培养上清中IL-17A、IL-17C的表达水平，按说明书操作进行，每个标本测3个复孔，测定值为3个复孔的平均值。
1.7 免疫印迹方法检测蛋白的表达将RIPA蛋白裂解液处理后的细胞进行离心去除沉淀，经12% SDS-PAGE电泳(六一仪器厂)分离后在Bio-Rad系统转移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜，Bio-Rad)上，用5%的脱脂奶粉室温封闭1 h后，加入特异性抗体(抗猪IL-17A, 1：500, Kingfisher biotec，美国; 抗β-actin, 1：3 000, ab8227, Abcam, 美国; 抗猪β-defensin 2，1：1 000，CLOUD-CLONE CORP，美国; 抗claudin-1，1：250, 51-9000, Thermo Fisher Scientific，美国；抗claudin-2，1：250, 51-6100, Thermo Fisher Scientific, 美国)4 ℃孵育过夜。PBST洗涤3次，每次5 min。洗涤之后加入HRP标记的二抗(抗兔IgG，1：1 000，Santa-Cruz Biotechnology，美国)，室温孵育1 h，PBST洗涤3次，最后用ECL系统(Kodak Image Station化学发光检测仪器，美国)显色。
1.8 数据分析应用SPSS 22软件进行Mann-Whitney U检验(独立样本)和Friedman′s测试(相关变量)，所有数据以“x±sx”形式表示，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。
2 结果 2.1 IL-17细胞因子基因的转录qRT-PCR结果显示，除IL-17D外，IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17E及IL-17F mRNA均在猪肠上皮细胞IPEC-J2中被检测到。尽管大肠杆菌C83901感染使IL-17各基因的转录量增高，但显著性差异仅在IL-17A、IL-17C及IL-17E中被检测到。同时，此3个基因在感染后4 h均高于感染后2 h的表达量。而非致病性大肠杆菌HB101感染后对IL-17各细胞因子在IPEC-J2细胞中的转录均无显著影响。
|
*表示差异显著(P＜0.05)。下图同 * means significant difference between the treatments (P < 0.05). The same as below 图 1 大肠杆菌感染后IL-17细胞因子mRNA差异转录 Fig. 1 Differential transcription of IL-17 mRNA in IPEC-J2 cells after E. coli infection |
由于C83901感染后IL-17A及IL-17C的基因转录都上调，笔者进一步用ELISA方法检测了细胞培养液中两种细胞因子的含量。结果显示，C83901感染组中IL-17C的含量极显著高于对照组(图 2A)。与qRT-PCR结果类似，HB101感染对IL-17C并无显著影响(图 2A)。与此同时，细胞培养上清中并未检测到IL-17A。利用免疫荧光及免疫印迹方法均检测到了IL-17A蛋白(图 2B、C)。推测C83901感染后IPEC-J2细胞中产生的IL-17A很有可能迅速和其受体结合。在静息状态的IPEC-J2细胞中，笔者分别检测了各IL-17细胞因子相关受体mRNA的转录水平。由图 2D可知，IPEC-J2细胞中IL-17A的受体IL-17RA的基因转录丰度最高，其次是IL-17C的受体IL-17RE。
|
A. ELISA法测定不同大肠杆菌感染24 h后IPEC-J2细胞中IL-17C的表达情况；B.免疫荧光检测大肠杆菌感染24 h后IPEC-J2细胞中IL-17A的表达(200×)；C.免疫印迹法测定不同大肠杆菌感染24 h后IPEC-J2细胞中IL-17A的表达情况；D.静息状态下IPEC-J2细胞中IL-17各受体mRNA转录差异。**表示差异极显著(P＜0.01)，比例尺=50 μm，下图同 A. IL-17C expression analysis in IPEC-J2 cells in 24 h post infection with different E. coli by ELISA; B. Immunohistochemical analysis of IL-17A in IPEC-J2 cells in 24 h post infection with different E. coli (200×); C. Western blotting assay for IL-17A in IPEC-J2 cells in 24 h post infection with different E. coli; D. Differential mRNA transcription level of IL-17 receptors in IPEC-J2 cells in homeostatic condition. ** means significant difference between the treatments (P < 0.01), scale bar=50 μm, the same as below 图 2 大肠杆菌感染后IL-17细胞因子蛋白及相关受体的差异表达 Fig. 2 Differential expression of IL-17 cytokines and related receptors in IPEC-J2 cells after E. coli infection |
qRT-PCR检测结果显示，大肠杆菌C83901感染24 h后显著上调了肠黏膜免疫相关基因pBD-2、mucin-2和紧密连接蛋白基因claudin-1、claudin-2的转录(图 3)。由于在人及小鼠相关上皮细胞模型中IL-17细胞因子被报道能通过调控相关促炎因子、趋化因子及抗菌蛋白进而增强黏膜免疫功能[19-21]，因此进一步研究了IL-17A及IL-17C在肠上皮细胞IPEC-J2中对上述4种黏膜免疫相关基因的调控作用。
|
图 3 大肠杆菌感染后24 h IPEC-J2细胞中肠黏膜防御相关基因的转录 Fig. 3 The mRNA transcription profile of several genes relevant to intestinal mucosal host defense in IPEC-J2 cells 24 h post different E. coli infection |
IPEC-J2细胞在静息状态下IL-17RA及IL-17RE均表现出较高的表达水平(mRNA水平，图 2D)，暗示IL-17A及IL-17C在IPEC-J2细胞中有着重要的生物学作用。因此，笔者直接在IPEC-J2细胞中添加IL-17A或IL-17C后检测了肠黏膜免疫相关基因的转录情况。由图 4可知，IL-17A的添加均显著上调了pBD-2及mucin-2基因的转录。同时，IL-17A刺激也在一定程度上增强了IL-17C在IPEC-J2细胞中的转录。
|
*表示差异显著(P＜0.05), IPEC-J2细胞经IL-17A(100 ng·mL-1)或IL-17C(40 ng·mL-1)刺激24 h * means significant difference between the treatments (P < 0.05), IPEC-J2 cells were stimulated with IL-17A (100 ng·mL-1) or IL-17C (40 ng·mL-1) for 24 h 图 4 IL-17A及IL-17C促进IPEC-J2细胞中肠黏膜免疫相关基因的表达 Fig. 4 IL-17A and IL-17C stimulated the expression of intestinal mucosal host defense genes in IPEC-J2 cells |
同IL-17A类似, IPEC-J2细胞中添加IL-17C也促进了pBD-2的转录。IL-17C对pBD-2的促进作用略强于IL-17A。除此之外，IL-17C的添加也显著上调了紧密连接蛋白claudin-1和claudin-2在IPEC-J2细胞中的转录。
为进一步验证IL-17A及IL-17C对肠黏膜免疫相关基因的调控作用，笔者利用免疫荧光及免疫印迹方法检测了相关蛋白的表达。与对照组相比，IL-17A添加组中mucin-2的表达显著升高(图 5A)。免疫印迹结果表明，IL-17C添加后pBD-2，claudin-1和claudin-2蛋白表达显著增多(图 5B)，与C83901感染后的结果一致(图 3)。
|
A.IL-17A刺激24 h后IPEC-J2细胞中mucin-2免疫荧光染色分析(200×)；B.免疫印迹法测定不同大肠杆菌感染或IL-17C刺激24 h后IPEC-J2细胞中pBD-2、claudin-1和claudin-2的表达情况 A. Immunohistochemical analysis of mucin-2 in IPEC-J2 cells 24 h post IL-17A stimulation; B. Differential expression level of pBD-2, claudin-1 and claudin-2 in IPEC-J2 cells 24 h post different E. coli infection or IL-17C stimulation 图 5 IL-17A、IL-17C促进IPEC-J2细胞相关防御蛋白的表达 Fig. 5 IL-17A and IL-17C induced the protein expression of host defense genes in IPEC-J2 cells |
越来越多的证据表明IL-17细胞因子家族在抗微生物感染中发挥着重要作用。其中，最重要的原因在于这些细胞因子能够激发相关促炎因子、趋化因子和抗菌蛋白的表达进而用以修复或者增强黏膜免疫功能。然而，这些研究几乎全部集中于人及小鼠模型中。笔者前期以猪为模型，探索了IL-17A、IL-17B及IL-17F在ETEC感染后的免疫调节作用[23]。本研究首次分析了IL-17细胞因子家族在ETEC感染后猪肠上皮细胞IPEC-J2中的表达情况和免疫功能。除IL-17D外，IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17E及IL-17F编码基因均在该细胞系中被检测到。有研究表明，IL-17D的表达有一定的选择性，例如仅在骨骼肌、脑等组织中大量表达[29]。因此，IL-17D可能在肠上皮细胞中不表达或低表达。IL-17B及IL-17F在ETEC感染后的IPEC-J2细胞中仅轻微上调，其在猪肠上皮细胞中的调控机制及功能有待进一步研究。
IL-17A、IL-17C及IL-17E mRNA在ETEC感染后表达显著增加。由于目前仅存在猪IL-17A及IL-17C相关蛋白和抗体，笔者仅对IL-17A及IL-17C的表达在蛋白水平进行了分析。结果发现，ETEC感染能显著提高IL-17A及IL-17C在IPEC-J2细胞中的表达。尽管IL-17A在ETEC感染后的IPEC-J2细胞中显著上调，ELISA方法并没有在对应的细胞培养上清中检测到该细胞因子。考虑到在IPEC-J2细胞中IL-17A的受体IL-17RA高丰度表达，推测导致细胞培养上清中未检出IL-17A的原因可能是IL-17A生成后迅速与其受体IL-17RA结合。
进一步研究发现IPEC-J2细胞能通过上调IL-17A的表达进而促进黏膜免疫相关基因pBD-2、mucin-2的表达。人源ETEC通过降解mucin-2和mucin-3等黏蛋白，从而使该细菌有效黏附于肠上皮细胞并加速肠毒素释放后对肠细胞的毒性作用[9-10]。因此，ETEC感染后产生的IL-17A有利于修复肠道黏膜用以抵抗细菌毒性。同时，本研究中IL-17A在猪肠上皮细胞中对IL-17C的促进作用与先前在人肠上皮细胞中的研究结果一致[30]。IPEC-J2细胞中高表达的IL-17A受体IL-17RA也表明该细胞因子可以通过自分泌或者旁分泌发挥生物学效应。
IL-17C及其受体IL-17RE主要表达于上皮细胞，例如，气管、肠道及皮肤组织[19, 21]。本研究结果显示，肠上皮细胞IPEC-J2细胞中IL-17C的表达有利于提高黏膜免疫相关基因pBD-2、mucin-2、claudin-1和claudin-2的表达，与前人在其他上皮细胞中的研究结果一致[19-20, 31-33]。这些防御素、黏蛋白及紧密连接蛋白在维持肠道黏膜免疫和抵抗细菌感染中发挥着重要的作用。因此，ETEC感染后IL-17A及IL-17C的主要功能可能是通过上调肠道黏膜免疫相关基因的表达来修复受损的黏膜及其黏膜免疫。
IL-17E基因在ETEC感染后的IPEC-J2细胞中也显著增加。现有的文献表明，IL-17E主要表达于Th2细胞并促进Th2型细胞免疫反应和IgE表达[18, 34]，而肠上皮细胞产生的IL-17E有利于限制Th17炎性反应[35-36]。
4 结论多种IL-17细胞因子均在猪肠上皮细胞IPEC-J2中表达。ETEC感染后，IL-17A、IL-17C及IL-17E在IPEC-J2中显著上调。前两者主要通过自分泌和旁分泌调控黏膜免疫相关基因pBD-2、mucin-2、claudin-1和claudin-2在IPEC-J2中的表达，进而增强黏膜免疫反应以抵御ETEC的致病。IL-17E可能有利于控制ETEC感染早期的炎性反应，具体功能有待后续研究。
| [1] |
张秀媛, 袁万哲, 孙继国. 产肠毒素性大肠杆菌主要毒力因子及其疫苗的研究进展[J]. 畜牧与兽医, 2014, 46(5): 112–116.
ZHANG X Y, YUAN W Z, SUN J G. Research progress on main virulence factors and vaccines of enterotoxigenic Escherichia coli[J]. Animal Husbandry & Veterinary Medicine, 2014, 46(5): 112–116. (in Chinese) |
| [2] | GYLES C L, PRESCOTT J F, SONGER G, et al. Pathogenesis of bacterial infections in animals]. 4th ed[M]. Ames, Iowa: Wiley-Blackwell,, 2010. |
| [3] | PETERSON L W, ARTIS D. Review. Intestinal epithelial cells:regulators of barrier function and immune homeostasis[J]. Nat Rev Immunol, 2014, 14(3): 141–153. |
| [4] | BROSNAHAN A J, BROWN D R. Porcine IPEC-J2 intestinal epithelial cells in microbiological investigations[J]. Vet Microbiol, 2012, 156(3-4): 229–237. DOI: 10.1016/j.vetmic.2011.10.017 |
| [5] | ZHOU C L, LIU Z Z, JIANG J C, et al. Differential gene expression profiling of porcine epithelial cells infected with three enterotoxigenic Escherichia coli strains[J]. BMC Genomics, 2012, 13: 330. DOI: 10.1186/1471-2164-13-330 |
| [6] | GAO Y, HAN F, HUANG X, et al. Changes in gut microbial populations, intestinal morphology, expression of tight junction proteins, and cytokine production between two pig breeds after challenge with Escherichia coli K88:a comparative study[J]. J Anim Sci, 2013, 91(12): 5614–5625. DOI: 10.2527/jas.2013-6528 |
| [7] | NGENDAHAYO MUKIZA C, DUBREUIL J D. Escherichia coli heat-stable toxin b impairs intestinal epithelial barrier function by altering tight junction proteins[J]. Infect Immun, 2013, 81(8): 2819–2827. DOI: 10.1128/IAI.00455-13 |
| [8] | NASSOUR H, DUBREUIL J D. Escherichia coli STb enterotoxin dislodges claudin-1 from epithelial tight junctions[J]. PLoS One, 2014, 9(11): e113273. DOI: 10.1371/journal.pone.0113273 |
| [9] | KUMAR P, LUO Q W, VICKERS T J, et al. EatA, an immunogenic protective antigen of enterotoxigenic Escherichia coli, degrades intestinal mucin[J]. Infect Immun, 2014, 82(2): 500–508. DOI: 10.1128/IAI.01078-13 |
| [10] | LUO Q W, KUMAR P, VICKERS T J, et al. Enterotoxigenic Escherichia coli secretes a highly conserved mucin-degrading metalloprotease to effectively engage intestinal epithelial cells[J]. Infect Immun, 2014, 82(2): 509–521. DOI: 10.1128/IAI.01106-13 |
| [11] | ZHOU M, ZHU J, YU H, et al. Investigation into in vitro and in vivo models using intestinal epithelial IPEC-J2 cells and Caenorhabditis elegans for selecting probiotic candidates to control porcine enterotoxigenic Escherichia coli[J]. J Appl Microbiol, 2014, 117(1): 217–226. |
| [12] | SPITZER F, SPEISER S, VAHJEN W, et al. Effect of different feed ingredients and additives on IPEC-J2 cells challenged with an enterotoxigenic Escherichia coli strain[J]. Cytotechnology, 2016, 68(4): 1463–1471. DOI: 10.1007/s10616-015-9905-6 |
| [13] | KARIMI S, JONSSON H, LUNDH T, et al. Lactobacillus reuteri strains protect epithelial barrier integrity of IPEC-J2 monolayers from the detrimental effect of enterotoxigenic Escherichia coli[J]. Physiol Rep, 2018, 6(2): e13514. DOI: 10.14814/phy2.13514 |
| [14] | KERN M, GÜNZEL D, ASCHENBACH J R, et al. Altered cytokine expression and barrier properties after in vitro infection of porcine epithelial cells with enterotoxigenic Escherichia coli and probiotic Enterococcus faecium[J]. Mediators Inflamm, 2017, 2017: 2748192. |
| [15] | SONG X Y, HE X, LI X X, et al. The roles and functional mechanisms of interleukin-17 family cytokines in mucosal immunity[J]. Cell Mol Immunol, 2016, 13(4): 418–431. DOI: 10.1038/cmi.2015.105 |
| [16] | LEE J S, TATO C M, JOYCE-SHAIKH B, et al. Interleukin-23-independent IL-17 production regulates intestinal epithelial permeability[J]. Immunity, 2015, 43(4): 727–738. DOI: 10.1016/j.immuni.2015.09.003 |
| [17] | MAXWELL J R, ZHANG Y, BROWN W A, et al. Differential roles for interleukin-23 and interleukin-17 in intestinal immunoregulation[J]. Immunity, 2015, 43(4): 739–750. DOI: 10.1016/j.immuni.2015.08.019 |
| [18] | IWAKURA Y, ISHIGAME H, SAIJO S, et al. Functional specialization of interleukin-17 family members[J]. Immunity, 2011, 34(2): 149–162. DOI: 10.1016/j.immuni.2011.02.012 |
| [19] | RAMIREZ-CARROZZI V, SAMBANDAM A, LUIS E, et al. IL-17C regulates the innate immune function of epithelial cells in an autocrine manner[J]. Nat Immunol, 2011, 12(12): 1159–1166. DOI: 10.1038/ni.2156 |
| [20] | SONG X Y, ZHU S, SHI P Q, et al. IL-17RE is the functional receptor for IL-17C and mediates mucosal immunity to infection with intestinal pathogens[J]. Nat Immunol, 2011, 12(12): 1151–1158. DOI: 10.1038/ni.2155 |
| [21] | HUANG J L, MENG S H, HONG S J, et al. IL-17C is required for lethal inflammation during systemic fungal infection[J]. Cell Mol Immunol, 2016, 13(4): 474–483. DOI: 10.1038/cmi.2015.56 |
| [22] | LOOS M, GEENS M, SCHAUVLIEGE S, et al. Role of heat-stable enterotoxins in the induction of early immune responses in piglets after infection with enterotoxigenic Escherichia coli[J]. PLoS One, 2012, 7(7): e41041. DOI: 10.1371/journal.pone.0041041 |
| [23] | LUO Y, VAN NGUYEN U, DE LA FE RODRIGUEZ P Y, et al. F4+ ETEC infection and oral immunization with F4 fimbriae elicits an IL-17-dominated immune response[J]. Vet Res, 2015, 46: 121. DOI: 10.1186/s13567-015-0264-2 |
| [24] | JIAO W, MA Q, LV X, et al. Gene expression and tissue distribution of β-defensins in Chinese Min pigs and Landrace pigs[J]. Czech J Anim Sci, 2017, 62(4): 178–183. DOI: 10.17221/CJAS |
| [25] | PASTERNAK J A, AIYER V I A, HAMONIC G, et al. Molecular and physiological effects on the small intestine of weaner pigs following feeding with deoxynivalenol-contaminated feed[J]. Toxins (Basel), 2018, 10(1): 40. DOI: 10.3390/toxins10010040 |
| [26] | BRUEL T, GUIBON R, MELO S, et al. Epithelial induction of porcine suppressor of cytokine signaling 2(SOCS2) gene expression in response to Entamoeba histolytica[J]. Dev Comp Immunol, 2010, 34(5): 562–571. |
| [27] | VON DER HARDT K, KANDLER M A, FINK L, et al. High frequency oscillatory ventilation suppresses inflammatory response in lung tissue andmicrodissected alveolar macrophages in surfactant depleted piglets[J]. Pediatr Res, 2004, 55(2): 339–346. DOI: 10.1203/01.PDR.0000106802.55721.8A |
| [28] | MELKEBEEK V, SONCK E, VERDONCK F, et al. Optimized FaeG expression and a thermolabile enterotoxin DNA adjuvant enhance priming of an intestinal immune response by an FaeG DNA vaccine in pigs[J]. Clin Vaccine Immunol, 2007, 14(1): 28–35. DOI: 10.1128/CVI.00268-06 |
| [29] | STARNES T, BROXMEYER H E, ROBERTSON M J, et al. Cutting edge:IL-17D, a novel member of the IL-17 family, stimulates cytokine production and inhibits hemopoiesis[J]. J Immunol, 2002, 169(2): 642–646. |
| [30] | FRIEDRICH M, DIEGELMANN J, SCHAUBER J, et al. Intestinal neuroendocrine cells and goblet cells are mediators of IL-17A-amplified epithelial IL-17C production in human inflammatory bowel disease[J]. Mucosal Immunol, 2015, 8(4): 943–958. DOI: 10.1038/mi.2014.124 |
| [31] | IM E, JUNG J, RHEE S H. Toll-like receptor 5 engagement induces interleukin-17C expression in intestinal epithelial cells[J]. J Interf Cytok Res, 2012, 32(12): 583–591. DOI: 10.1089/jir.2012.0053 |
| [32] | PFEIFER P, VOSS M, WONNENBERG B, et al. IL-17C is a mediator of respiratory epithelial innate immune response[J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 2013, 48(4): 415–421. |
| [33] | KUSAGAYA H, FUJISAWA T, YAMANAKA K, et al. Toll-like receptor-mediated airway IL-17C enhances epithelial host defense in an autocrine/paracrine manner[J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 2014, 50(1): 30–39. |
| [34] | REYNOLDS J M, ANGKASEKWINAI P, DONG C. IL-17 family member cytokines:regulation and function in innate immunity[J]. Cytok Growth Factor Rev, 2010, 21(6): 413–423. DOI: 10.1016/j.cytogfr.2010.10.002 |
| [35] | ZAPH C, DU Y R, SAENZ S A, et al. Commensal-dependent expression of IL-25 regulates the IL-23-IL-17 axis in the intestine[J]. J Exp Med, 2008, 205(10): 2191–2198. DOI: 10.1084/jem.20080720 |
| [36] | SAWA S, LOCHNER M, SATOH-TAKAYAMA N, et al. RORγt+ innate lymphoid cells regulate intestinal homeostasis by integrating negative signals from the symbiotic microbiota[J]. Nat Immunol, 2011, 12(4): 320–326. DOI: 10.1038/ni.2002 |