禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli, APEC)是肠道外致病性大肠杆菌亚群中的一种，禽致病性大肠杆菌病是严重危害养禽业健康发展的重要细菌性传染病之一。研究表明，APEC致病性的强弱受细菌内部多种与毒力相关的因子(virulence factors, VFs)影响[1]。phoP/Q双组分系统与鞭毛T3SS被认为是大肠杆菌中重要的毒力因子，被认为与细菌毒力基因表达密不可分[2]。其中phoP/Q双组分系统是沙门菌和大肠杆菌等革兰阴性菌中的一个重要毒力调控单元[3]，而鞭毛是运动所必需的多蛋白复合物。在大多数革兰阴性菌中，phoP/Q双组分系统作为一种外在环境感受器而发挥作用，它能被多种物质(如Mg2+、Ca2+、防御素等)激活，进而调节靶基因转录水平，从而引起宿主细胞对环境的改变作出适应性的调整(如增强耐酸性的能力、参与上皮细胞侵袭和抗菌肽抗感染等)[4-5]，在病原菌毒力基因表达、抵御上皮细胞侵袭和抗菌肽(antimicrobial peptides, AMPs)抗感染等环节中发挥着关键的调控作用[6]。而Harari等[7]的研究也证明沙门菌55%基因的转录受phoP控制。
细菌鞭毛(用于趋化性的旋转细丝)与用于蛋白质间转移的注射装置是跨越革兰阴性细菌细胞膜的大型大分子复合物，它们拥有非常复杂的结构和分泌途径来确保细菌生存和传播[8]。虽然这两种细胞纳米机器装置在整体结构和功能方面明显不同，但在它们的核心都由蛋白质输出的保守装置Ⅲ型分泌系统(T3SS)组成(为区别这两者，分别将之命名为鞭毛T3SS和注射体T3SS)，它们分别使细菌的运动和发病机制成为可能。这些细胞纳米装置使用T3SS组装和起作用，通过专用的细胞质将输出的蛋白质通过膜运输输送到输出装置伴侣[9]，对细菌的毒力与致病性发挥关键作用。T3SS是细菌鞭毛的核心与基础，若探究与鞭毛之间联系，当以研究鞭毛T3SS为先。
本实验室前期研究结果显示，phoP/phoQ基因缺失后细菌运动性能力较原始株明显降低，而恢复株运动性能力达到原有水平。对鸡胚成纤维细胞黏附入侵能力，缺失株的数据也呈现明显下降，且检测细菌毒力基因表达水平变化时，发现鞭毛基因fliC等转录水平显著下降[10]。phoP/phoQ基因缺失株于透射电镜下未观察到鞭毛结构存在，也证明了phoP/phoQ对鞭毛基因的表达的确有一定影响。但对于phoP/phoQ调控鞭毛的具体原理目前还没有相关文献报道过，因此本试验通过检测phoP/Q缺失后鞭毛T3SS基因的表达差异及预测两者之间的通路，为进一步研究细菌毒力因子间的相互作用与双组分调控机制提供参考。
1 材料与方法 1.1 材料与试剂大肠杆菌O2血清型野生株AE17(实验室保存)，ΔphoP、ΔphoQ与ΔphoP/Q为AE17缺失株(由本实验室构建)。
本试验采用Agilent大肠杆菌8×15K芯片(Design ID:020097)，由上海伯豪生物技术有限公司完成。RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、qPCR试剂盒均采购于全式金公司。试验过程中所用引物均由上海生工生物工程公司合成。
1.2 目的基因检测根据NCBI公布APEC O2的序列，以Premier5.0设计10个鞭毛T3SS相关基因及7个双组分系统基因的引物。利用实验室分离的72株大肠杆菌野生株，选择其中39株菌来检测10个鞭毛T3SS相关基因和包括phoP、phoQ在内的7个双组分系统基因的分布情况。全部序列引物见表 1。
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表 1 基因鉴定所用引物序列 Table 1 Primer sequences for gene identification |
利用RNeasy mini kit试剂盒按照试验流程抽提试验组与对照组样品的总RNA，抽提样品经Agilent Bioanalyzer 2100电泳选用合格样品备用。运用试验所需配套试剂盒对样品总RNA中的mRNA进行放大和标记，并纯化标记后的cRNA。
1.3.2 芯片杂交按照Gene Expression Hybridization Kit试剂盒步骤要求，将试验所用试剂与杂交cRNA(每次用量为600 ng)混合加入滚动杂交炉中，反应条件为65 ℃，10 r·min-1，滚动杂交17 h，最后在洗缸中洗片。
1.3.3 芯片扫描与结果处理样品完成杂交后采用配套Agilent Microarray Scanner仪器进行扫描与数据处理，运行Feature Extraction software 10.7软件，对试验图像进行分析，提取每个数字信号，得到原始数据。将读取到的最终数据进行校正，消除试验环节对数据影响，根据试验要求筛选最终数据进行初步分析。
1.4 通路预测由NCBI公布APEC O2全序列绘制鞭毛T3SS基因座分布情况如图 1所示，基因座中共包含98个基因，其中有40个是鞭毛相关基因，且有28个基因是报道过的鞭毛T3SS的组成部分[11]。查阅相关文献并运用蛋白互作网络数据库STRING(https://string-db.org/)预测phoP/Q、鞭毛T3SS相关基因及基因座附近基因的关系。
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图 1 APEC O2中鞭毛T3SS基因座分布情况 Fig. 1 Distribution of flagellar T3SS locus in APEC O2 |
笔者实验室前期对APEC O2的临床分离株AE17做过一些研究，在此基础上继续以AE17为研究对象。将野生株AE17和缺失株ΔphoP、ΔphoQ与ΔphoP/Q菌液1:100接种LB培养基，使其培养到对数生长期间的同一OD值。取AE17、ΔphoP、ΔphoQ与ΔphoP/Q的菌液各5 mL，分别加入1 mL Trizol(Invitrogen)裂解，然后按照EasyPure RNA Kit说明书的标准操作步骤提取其Total RNA，以超微量核酸蛋白分析仪测量并调整到同一浓度，并使用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。
取上一步提取的总RNA，按照说明书的要求，利用恒温水浴锅控制温度，与引物和RNase-free H2O混匀，先65 ℃孵育5 min，再冰浴2 min，接着加入试剂盒中Anchored Oligo组分42 ℃孵育15 min，最后85 ℃加热5 s以失活酶，得到的cDNA -80 ℃保存备用。先普通PCR验证qPCR引物的特异性(扩增产物长度应控制在100~200 bp)。将样品稀释至100~200 mg·L-1间的同一浓度，参照说明书具体反应程序。扩增程序采用二步法，荧光定量PCR验证基因变化数据是否与基因芯片数据一致。引物序列见表 2。
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表 2 荧光定量PCR所用引物序列 Table 2 Primer sequences for real-time PCR |
基因检测分布情况见表 3，结果表明大部分野生株都含有10个鞭毛T3SS基因与phoP/Q基因，除了少部分菌株缺失个别基因外基本都包含全部基因。而双组分基因(motA/B、rcsA/B、cheY/A)分布情况也大体相同，统计结果显示所有基因检出率均在90%以上。
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表 3 临床分离株中鞭毛T3SS、phoP/Q及三对双组分系统基因的检测情况 Table 3 Detection of flagella T3SS, phoP/Q and three pairs of two-component system genes in clinical isolates |
根据基因芯片数据结果分析(表 4)，以AE17株转录水平为对照，对比ΔphoP、ΔphoQ与ΔphoP/Q三组数据可得出结论，观察鞭毛T3SS基座的10个基因及5个双组分基因转录水平变化。结果表明，10个鞭毛T3SS相关基因转录水平呈现较大差异，其中phoP缺失后10个基因转录水平均出现上调且差异较大；phoQ缺失后有8个基因转录水平出现上调，其中fliF与fliM转录水平上调差异较大；phoP与phoQ双缺失后有8个基因出现上调，其中fliF与fliM基因转录水平上调差异较大。同时，phoP与phoQ缺失后，对motA、motB、rcsA转录水平影响较大。
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表 4 基因芯片中筛选鞭毛基座基因相关数据 Table 4 Screening of flagellar pedigree gene related data in gene chip |
如图 2所示，STRING数据库通过对蛋白质三维结构、基因邻域、蛋白质同源性、试验数据筛选、文献挖掘等方式来预测不同基因(蛋白)间的联系，并采用不同颜色线条来表示信息来源。从软件预测结果来看，鞭毛T3SS各蛋白间联系较为紧密，但并未发现有phoP/Q与鞭毛T3SS直接联系的证据存在，而phoP/Q与鞭毛T3SS各自与三对双组分基因(motA/B、rcsA/B、cheY/A)的关联众多。因此推测phoP/Q可能并未直接调控鞭毛T3SS的相关基因，而是间接通过鞭毛T3SS基因簇周围的三对双组分基因来调控鞭毛T3SS。而具体实际情况，还需要进一步试验加以论证。
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图 2 各基因(蛋白)关联度预测 Fig. 2 Prediction of the relevance of each gene (protein) |
将qRT-PCR所用引物先进行普通PCR验证，结果如图 3，引物特异性较高且产物大小均于100~200 bp左右且符合qRT-PCR要求。根据qRT-PCR数据结果分析，以AE17株表达量为对照，对比ΔphoP、ΔphoQ与ΔphoP/Q三组数据可得出结论，观察鞭毛T3SS基座的10个基因表达量变化。结果(图 4)表明，phoP缺失后5个基因表达下调，4个基因表达上调，其中flhA与fliF表达差异较大；phoQ缺失后有4个基因表达出现下调，6个基因表达上调，其中fliO与flhB基因表达差异较大；phoP与phoQ双缺失后有7个基因出现下调，3个基因表达上调，其中flhA表达差异较大。
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M. DNA相对分子质量标准; 0.阴性对照; 1~15.依次为fliM、flhA、fliR、fliG、fliQ、flhB、fliO、fliP、fliN、fliF、motA、motB、cheA、cheY、rcsA M. DNA molecular mass standard; 0. Negative control; 1-15. fliM, flhA, fliR, fliG, fliQ, flhB, fliO, fliP, fliN, fliF, motA, motB, cheA, cheY, rcsA 图 3 RT-PCR引物特异性检验 Fig. 3 RT-PCR primer specificity test |
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图 4 qRT-PCR鞭毛T3SS基因表达及双组分基因表达差异倍数对比 Fig. 4 RT-PCR Comparison of differential fold expression of flagellar T3SS gene and differential expression of two-component gene expression |
在大部分病原体中，鞭毛与双组分的结构一般比较保守。鞭毛蛋白有一个明显的特征性结构，此结构由非常保守的N末端和C末端组成，有研究指出沙门菌的鞭毛基因也有很高的保守性[12]。此外，有生物信息学分析也表明，革兰阴性菌中的phoP/Q双组分系统有高度同源性，仅个别碱基发生突变[13]。通过对NCBI上公布的禽大肠杆菌全序列blast比对发现，各血清型的APEC的鞭毛基因同源性较高、其碱基序列相似度均在90%以上。而在本试验中，鞭毛T3SS及双组分基因检出率较高，也间接验证APEC中鞭毛与双组分的保守性。
鞭毛包括鞭毛T3SS的核心在于跨膜和胞质部分，包括形成输出装置的五种(而最近发现在鞭毛输出装置的存在第六种蛋白质，FliO，在注射体中没有同源物，在鞭毛装配期间调节FliP[14]，鞭毛系统其他5个蛋白为FlhA、FlhB、FliP、FliQ和FliP)蛋白质和内膜(IM)中的周围MS环(内膜)(沙门菌鞭毛基底体的MS环是由61个61 ku蛋白FliF的约26个亚基组成的完整膜结构[15])，以及L环(外膜)，P环(肽聚糖层)和C环(细胞质)[16-17]。而在鼠伤寒沙门菌和大肠杆菌中，也证实了MS环中有fliF，而C环中有fliG、fliM和fliN[18]。这10个组成部分是鞭毛T3SS乃至整个鞭毛系统重要基底和合成的基础。本试验的研究结果发现，phoP/Q缺失后flhA、fliF、fliO与flhB表达量急剧变化，其中flhA和fliF呈现下调受phoP影响较大，fliO和flhB呈现下调受phoQ影响较大。证明了phoP/Q的确能调控鞭毛T3SS核心组件的大部分基因。
在一些文献报道和软件预测结果中显示，phoP/Q与鞭毛T3SS基因簇周围的三对双组分基因(motA/B、rcsA/B、cheY/A)有直接联系。如Hague等[19]于菊欧文菌中研究发现，将phoP和phoQ突变后，motA和motB的表达都大大降低；而在激活phoP/phoQ系统的低镁培养基中，SlyA突变体中motA与motB的表达也下降。在沙门菌研究中发现，PhoP-PhoQ和RcsC-YojN-RcsB磷酸化之间存在密切联系，仅在RcsC-YojN-RcsB信号传导途径被去抑制时才显示出来[20]。关于三对双组分系统(motA/B、rcsA/B、cheY/A)与鞭毛T3SS间联系，有研究显示，由motA、motB复合物组成的定子元件锚定在细胞壁上，延伸通过细胞膜，并与鞭毛C环中的fliG相互作用，motA的细胞质环经历质子驱动的构象变化，驱动鞭毛旋转[21]。而cheA或cheB信号传导途径控制趋化性行为和鞭毛驱动的运动性，并且在生物膜的形成和细胞外多糖(EPS)的产生中起重要作用。此外，cheA缺失突变体在竞争性吸附和定殖方面存在缺陷[22]。而在本次试验结果显示，phoP/Q的缺失不仅影响了鞭毛T3SS基因表达变化，也对双组分的一些基因(主要是motA、motB与cheY)产生影响，这也验证了软件预测与部分文献报道的结果(phoP/Q通过调控三组双组分系统而间接影响鞭毛T3SS)。phoP/Q、鞭毛T3SS与鞭毛T3SS周围双组分系统这三者间的具体调控机制还需进一步研究。本研究对揭示细菌的活动与致病机制有重大意义，为进一步研究揭示细菌的活动与致病机制提供了新的切入点与研究方向。
4 结论初步探讨APEC中phoP/Q、鞭毛T3SS与鞭毛T3SS周围双组分系统这三者间的联系，总结分析phoP/Q是革兰阴性菌中能影响细菌中众多毒力因子的重要调控因子，而鞭毛T3SS是细菌跨膜的重要器官对细菌运动、侵袭、分泌都有主导作用，这两者在大多数细菌中有较高同源性，通过生物信息学预测发现phoP/Q可能通过调控鞭毛T3SS基因座附近的双组分系统来间接调控鞭毛T3SS，通过基因芯片筛选与荧光定量PCR检测发现phoP/Q缺失能使鞭毛T3SS核心组件的大部分基因表达差异显著，同时也影响了双组分中motA、motB与cheY的表达。
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