塞内卡病毒A(Senecavirus A)是小的、无囊膜、单股正链RNA病毒,属于小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)塞内卡病毒属(Senecavirus)的唯一成员[1]。它的基因组全长为7.2 kb,包括5′非编码区和3′非编码区以及一个开放阅读框组成[1]。病毒基因组含有7 280个核苷酸,其中包括了5′端非编码区、3′非编码区以及一个开放阅读框组成。开放阅读框含有6 543个核苷酸,编码2 181个氨基酸的多聚蛋白,可以被病毒和细胞蛋白酶体切割成12个成熟的蛋白,从5′到3′依次为L protein (L)-1A-1B-1C-1D-2A-2B-2C-3A-3B-3C-3D[2]。SVA的5′非编码区序列中含有内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site,IRES),其结构与小RNA病毒的IRES差异较大,但与黄病毒科中猪瘟病毒(CSFV)的IRES元件(Ⅳ型IRES)的二级结构类似[3]。2002年SVA首次在细胞培养基中被发现,被认为可能是通过胎牛血清或猪胰蛋白酶引入的人类胎儿成视网膜细胞的细胞培养物中的污染物[4]。猪作为SVA的易感动物,感染SVA后,鼻吻或口腔黏膜(任何皮肤黏膜交界处)会出现完整或破裂的小泡,或可见跛行,冠状带和蹄壁周围发红或热烫,出现溃疡性病变[5-6]。2007年,加拿大报道了首例SVA阳性病例[7],这表明SVA可能与特发性水疱病有关。2010年美国的研究报道就证明了这一结论,并首次描述了SVA引起的病变情况[6]。2014年年底,美国和加拿大以外的巴西首次报道了SVA[8]。自2015年以来,SVA开始在更多的国家和地区的不同年龄组的猪群中迅速传播,而巴西就至少有7个地区暴发了SVA[9-11]。美国和加拿大报道的SVA感染仅在能产生水疱病的成年猪中检测到,然而巴西首次报道了仔猪感染SVA的临床表现,并且发现新生仔猪的发病率高于成年猪。同时,SVA感染可导致新生仔猪急性死亡,这表明SVA向毒性更强的表型进化[9-11]。2015年,中国广东省也首次报道了成年猪和新生仔猪感染SVA的案例[12]。2016年被认为是SVA流行病学在中国的一个转折点。在2016年之前分离的SVA毒株与加拿大和巴西分离的毒株具有更高的核苷酸相似性[13]。然而在2016年之后再次引起暴发的SVA毒株却与美国流行毒株具有极高的相似性[14],并且2017年新分离的毒株与以往毒株相比有明显的遗传距离,这表明SVA的进化是持续的、快速的[13]。到目前为止,已经在美国、加拿大、中国、哥伦比亚、泰国报道了SVA感染猪的案例[10, 15-18]。而中国的广东、湖北、福建、河南、河北、黑龙江等14个省份均发现了SVA的流行分布[13-14, 19]。因此,我们应该加强对猪水疱性疾病发病率的监测和调查,了解目前SVA在不同国家和地区的传播和进化情况。
细胞凋亡(apoptosis)最初由Kerr等于1972年提出,指在一定生理和病理情况下,机体为维持内环境稳定通过基因调控而使细胞发生有序的主动性死亡[20-22]。细胞凋亡的经典信号转导途径主要分为外源途径(死亡受体途径)和内源途径(线粒体途径)[23-26]。病毒感染引起的细胞凋亡可能是宿主为了抵御病原体复制和扩散的重要的第一道防御机制,然而很多病毒已经可以利用细胞的促凋亡机制来形成和扩散感染性病毒粒子。在病毒感染早期,有些病毒可以通过表达死亡受体同源蛋白靶向死亡受体,或者影响死亡诱导信号复合体(DISC)的形成及功能,从而抑制细胞凋亡;而在病毒感染后期,病毒又可以通过调节死亡受体或配体的表达、调节Caspase的激活,或者调节促凋亡/抗凋亡蛋白的表达和功能,从而促进细胞凋亡,扩散子代病毒[27-28]。SVA作为一种新病原,在致病性研究方面,目前已经发现炭疽毒素受体1(anthraxtoxin receptor 1)是它的其中一个细胞受体[29],SVA能通过剪切接头蛋白线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS)、包含TIR结构域的接头蛋白(TRIF)和TRAF家族成员相关NF-κB激活剂(TANK)而抑制Ⅰ型干扰素的产生[30],同时发现SVA 3CPro蛋白酶能通过降解IRF3和IRF7或者作为去泛素化酶抑制维甲酸诱导基因Ⅰ(RIG-Ⅰ)、TANK结合激酶1(TBK1)、肿瘤坏死因子受体相关因子3(TRAF3)的表达而抑制Ⅰ型干扰素通路[31-32],其中宿主蛋白RIG-Ⅰ负责在SVA感染猪源细胞中激活Ⅰ型干扰素通路发挥抑制病毒复制的作用[33]。然而SVA感染与宿主细胞凋亡的关系尚未阐明,本试验通过Annexin V-FITC/PI双染检测出SVA结构蛋白VP1可诱导细胞凋亡,并通过Western blotting和实时定量PCR实验检测出SVA-VP1能够对外源途径及内源途径关键凋亡分子有影响,证实了SVA-VP1能够引起细胞发生凋亡,为深入研究SVA诱导细胞凋亡的分子机制奠定基础。
1 材料与方法 1.1 材料SVA毒株(CH-GD-2017-1;GenBank: MF189000.1)、猪肾传代细胞(PK-15细胞)由本实验室提供,SVA各蛋白真核质粒由本实验室构建并保存。MEM培养基、青霉素和链霉素溶液、0.25%胰酶溶液(GIBICO);胎牛血清(BI);PBS(Hyclone);脂质体转染试剂LipofectamineTM3000(Invitrogen);ECL显色剂(Thermo Scientific);NP-40裂解液、PMSF(Beyotime);硝酸纤维素膜(NC)(0.45 μm)(Merck-Millipore);PageRuler Prestained Protein Ladder(Thermo);鼠抗Flag单抗、鼠抗β-actin单抗、兔抗Bax多抗、羊抗Caspase3多抗、羊抗Caspase8多抗、HRP标记兔抗山羊IgG二抗和HRP标记山羊抗鼠IgG二抗(Santa Cruz Biotechnology);Annexin V-FITC/Pl凋亡检测试剂盒(Molecular Biology & Chemistry);Trizol试剂、PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)(TaKaRa);Hoechst-33258染色试剂盒(Beyotime);1×71型倒置荧光显微镜(Olympus);流式细胞分析仪(BD);实时荧光定量PCR仪(Bio-Rad公司)。
1.2 方法 1.2.1 Western blotting将PK-15细胞铺于60 mm细胞皿中,待细胞长至70%时,按照LipofectamineTM3000说明书进行转染。细胞样品用NP-40裂解液裂解,并在使用前数分钟内加入PMSF,使PMSF的最终浓度为1 mol·L-1;充分裂解后,加入4×loading buffer,100 ℃煮10 min,12 000 r·min-1离心10 min,将样品进行SDS-PAGE电泳,80 V跑30 min,待蛋白样品跑出浓缩胶进入分离胶后,将电压调至120 V,直至电泳结束;转移至NC膜上,200 mA转膜2 h;用5%脱脂奶粉室温封闭2 h;孵育一抗(1:500),4 ℃过夜;TBST洗3次,每次10 min;孵育二抗(1:5 000),室温孵育2 h;TBST洗3次,每次10 min;用高分辨图像采集系统进行ECL显影并保存。
1.2.2 显微镜观察将PK-15细胞接种于含10%新生牛血清的MEM培养液中,在含5%CO2的细胞培养箱中37 ℃恒温培养,待细胞生长至90%时,用无血清MEM清洗两次后,用SVA感染复数(MOI)为1时感染细胞,于2%新生牛血清的MEM培养液中37 ℃恒温培养48 h后,在显微镜下观察细胞形态。
1.2.3 流式细胞术将PK-15细胞接种于六孔板中,在含5% CO2的细胞培养箱中37 ℃恒温培养,待细胞生长至70%时,按照LipofectamineTM3000说明书转染质粒。转染24 h后,将细胞板内培养液吸至对应的15 mL离心管内,PBS润洗一次;加入不含EDTA的胰蛋白酶消化,待细胞消化后,加入新鲜培养基终止消化,吸入对应离心管。4 ℃ 2 000 r·min-1离心10 min,弃上清。加入2 mL PBS润洗,4 ℃ 2 000 r·min-1离心10 min,弃上清。小心将细胞重悬于500 μL Binding Buffer中,先加入Annexin V-FITC 1 μL,避光静置15 min后,加入0.5 μL PI,轻轻混匀,避光静置5 min,300目滤膜过滤后流式细胞仪检测。
1.2.4 Annexin V-FITC/PI荧光染色将细胞接种于30 mm小皿中,待细胞长至70%,转染pCMV-VP1-Flag表达质粒,转染72 h后,收取细胞,PBS洗三遍,每皿加入400 μL Binding Buffer。再加入5 μL Annexin V-FITC与10 μL Propidium Iodide,混匀,避光室温孵育10 min,然后于荧光显微镜下观察。
1.2.5 Hoechst-33258荧光染色将PK-15接种于30 mm小皿中,待细胞长至70%,转染pCMV-VP1-Flag表达质粒,转染72 h后,PBS洗一遍,加入500 μL固定液,固定10 min;PBS洗3遍,加入500 μL Hoechst-33258染色液,避光染色5 min;PBS洗3遍,滴入抗荧光猝灭封片剂,荧光显微镜下观察。
1.2.6 RNA的提取及反转录将PK-15接种于六孔板中,待细胞长至70%,分别转染pCMV-Flag和pCMV-VP1-Flag表达质粒,转染48 h后收取细胞,用Trizol裂解法提取总RNA,并去基因组后反转录为cDNA模板用于实时定量PCR。去基因组反应(10 μL体系):取2 μL 5×gDNA Eraser Buffer、1 μL gDNA Eraser、1 μL Total RNA和6 μL RNase Free water,轻轻混匀,42 ℃反应2 min,4 ℃保存。反转录反应(20 μL体系):取上述反应液10 μL,依次加入1 μL Prime script enzyme mix、4 μL RT Prime mix、4 μL 5× Prime script Buffer和1 μL RNase Free water,37 ℃反应15 min,85 ℃热击5 s,4 ℃保存。PCR扩增反应(20 μL体系):取SYBRII mix 10 μL,10 μmol·L-1上、下游引物各0.4 μL,cDNA 1 μL,加水补足至20 μL。反应程序:95 ℃ 2 min;95 ℃ 10 s,60 ℃ 34 s,共40个循环。定量引物序列见表 1,引物序列由宝生物工程(大连)有限公司合成。
SVA感染PK-15细胞48 h后,通过荧光显微镜观察细胞生长状态。从图 1可看出,与正常细胞相比,感染SVA后细胞出现皱缩,细胞数量减少,有明显的细胞病变。
SVA蛋白重组质粒及空载体pCMV-Flag分别转染PK-15细胞,36 h后收样,利用Flag单抗进行Western blotting检测发现,SVA蛋白质粒在PK-15细胞中正常表达(图 2)。
在正常细胞中,磷脂酰丝氨酸(PS)位于细胞膜内侧,当细胞发生早期凋亡时,PS可从细胞膜内侧翻转到细胞膜表面,Annexin V能与PS特异性结合,将Annexin V进行FITC(荧光素)标记,可观察到凋亡早期细胞显现绿色荧光。碘化丙啶(PI)是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,但在凋亡中晚期和坏死细胞中,PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。将SVA蛋白质粒及空载体pCMV-Flag分别转染于PK-15细胞中,36 h后收取细胞,通过Annexin V-FITC/PI流式双染检测各质粒转染后诱导PK-15细胞的凋亡率。与对照相比,转染VP1质粒后,第四象限早期凋亡数与第二象限晚期凋亡数总和明显增加(图 3A)。图 3B是流式统计结果。以上结果说明SVA-VP1能够诱导PK-15细胞发生显著性细胞凋亡(P < 0.05)。
通过荧光显微镜观察发现,分别转染SVA各蛋白质粒和pCMV-Flag,48 h后,Annexin-V-FITC/PI双染细胞,发现转染VP1后细胞出现大量的绿色荧光,同时细胞核红染,说明SVA-VP1可使细胞发生早期和晚期细胞凋亡(图 4)。同时进行Hoechst-33258染色发现,转染VP1后,细胞核呈现出致密浓染,可观察到凋亡小体。而对照组中,大多细胞核形态无明显变化且呈正常蓝色(图 5)。
死亡受体途径主要通过切割起始凋亡蛋白Caspase8,激活下游效应凋亡蛋白Caspase3引起细胞凋亡。而当细胞受到内部凋亡刺激时,通过引起Bcl2家族蛋白Bax的激活及转位而引起线粒体膜电位的下降,最终致使细胞凋亡。由图 6所示,在分别转染pCMV-Flag和pCMV-VP1-Flag 48 h后,通过Western blotting检测发现,VP1能促进凋亡蛋白Bax上调,并且能使起始凋亡蛋白酶Pro-caspase3和Pro-caspase8发生剪切,形成有酶活性的Caspase3和Caspase8。通过实时定量PCR检测发现,与对照相比,VP1使凋亡蛋白Caspase3、Caspase8和Bax的mRNA水平均显著升高(P < 0.05),说明SVA-VP1通过外源途径和内源途径诱导PK-15细胞发生凋亡。
病毒感染诱导的细胞凋亡可能是一种限制病毒传播的重要防御机制,但是病毒作为一类严格寄生于宿主细胞的病原体,它的增殖和生存需要宿主细胞保持一定的活性,在病毒还未装配成熟期间,过早的细胞凋亡会使释放的病毒被机体内的免疫系统及时清除,因此很多病毒,包括小核糖核酸病毒,在感染细胞的过程中会通过某种机制来抑制细胞死亡以达到病毒在宿主细胞最佳的生存状态[34]。相反,当病毒完成子代病毒装配后,会利用宿主细胞的促凋亡机制使细胞发生崩解,释放出子代病毒,进而达到持续性感染的目的[35-36]。有研究报道,小核糖核酸病毒可通过影响Caspase的激活、干扰钙离子信号通路、阻断dsRNA传感器或者破坏核质传递等来破坏细胞凋亡途径[37-41],或者通过与宿主蛋白发生相互作用激活细胞的凋亡通路。而在这些过程中,病毒蛋白发挥着重要的功能。例如柯萨奇病毒B3(CVB3)、脊髓灰质炎病毒(PV)和人类鼻病毒(HRV)会通过表达2B蛋白导致细胞和线粒体之间的Ca2+通量的下降,最终阻断了内在的Ca2+诱导细胞凋亡信号[42-43]。口蹄疫病毒(FMDV)2C蛋白能通过与Nmi蛋白相互作用从而诱导BHK-21细胞发生凋亡[44]。同时FMDV也可以通过结构蛋白VP1激活AKT凋亡信号通路从而诱导BHK-21细胞凋亡[45]。SVA作为小核糖核酸病毒科的一类新病原,它感染宿主细胞后与宿主细胞凋亡之间的关系还尚未阐明。因此,本研究旨在揭示SVA感染PK-15后对细胞凋亡的影响。
本研究首先通过显微镜观察发现SVA感染细胞后能够引起细胞产生明显病变。因此在Western blotting验证SVA各蛋白质粒正常表达后,通过流式细胞术及Annexin V-FITC/PI双染试验发现,SVA-VP1能够诱导细胞发生显著性凋亡。在细胞凋亡早期,PS可从细胞膜内侧翻转至细胞膜表面,荧光染料Annexin-V-FITC与PS高亲和力特异性结合后,荧光显微镜下可见早期凋亡细胞上分布着点状的绿色荧光。而在晚期凋亡和死亡细胞中,PI能透过细胞膜与DNA结合发出红色荧光。因此根据各荧光强度可区分早期和晚期凋亡细胞或坏死细胞。当细胞发生调亡时,染色质发生皱缩,经过Hoechst-33258染色后,凋亡的细胞核呈致密浓染。本文通过荧光显微镜观察转染了VP1质粒的PK-15发现,与对照相比,VP1可诱导PK-15细胞发生早期和晚期的细胞凋亡。同时,本研究还初步检测了SVA-VP1诱导细胞凋亡依赖的信号通路。通过Western blotting和实时定量PCR检测发现,VP1能够促进凋亡关键调控分子Caspase3、Caspase8和Bax的表达。以上研究结果表明,SVA感染PK-15细胞后,可通过病毒自身蛋白VP1同时激活外源凋亡途径和内源凋亡途径,促进细胞发生凋亡并释放成熟的子代病毒粒子以维持病毒自身的复制与持续性感染。病毒可以通过各种方式来逃避宿主的免疫系统,通过自身的蛋白诱导细胞发生凋亡可能也是它的一种逃避机制。所以,关于SVA-VP1是如何调控凋亡分子及相关凋亡通路来诱导细胞发生凋亡将是我们下一步的研究方向。
4 结论首先通过荧光显微镜观察及流式细胞术检测发现SVA感染PK-15细胞后,可诱导细胞发生凋亡;其次通过流式细胞术筛选发现SVA结构蛋白VP1具有诱导凋亡功能,同时通过AnnexinV-FITC/PI和Hoechst-33258染色观察平行验证了这一结论;最后又通过Western blotting和RT-PCR试验检测发现VP1能促进相关促凋亡蛋白的表达。本研究表明SVA感染PK-15细胞后可通过自身结构蛋白VP1激活外源凋亡途径和内源凋亡途径,从而诱导细胞凋亡,这为探索SVA-VP1诱导凋亡的分子机制及SVA感染的致病机制提供一定的理论依据。
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