2. 辽宁省动物疫病预防控制中心, 沈阳 110164
, WU Yunpu1,2, JIA Yunhui1, YANG Shiman1, HE Likun2, CHEN Yan1, ZHOU Chenyang2, YANG Huanliang1, QIAO Chuanling1
, CHEN Hualan1
2. Liaoning Provincial Center for Animal Disease Control and Prevention, Shenyang 110164, China
猪流感(swine influenza, SI)是由猪流感病毒(swine influenza virus, SIV)引起的一种急性、高度接触性呼吸道传染病。由于猪呼吸道上皮细胞存在SA-α-2, 6-Gal和SA-α-2, 3-Gal两种受体，因此，猪既可感染人流感病毒，又可感染禽流感病毒，一直以来被认为是流感病毒的“混合器”[1]。一些新亚型病毒的产生都与猪有密不可分的联系[2-3]。此外，SIV造成对人的零星感染病例也时有发生[4-5]。因此，加强对SIV的主动监测及开展病原分子流行病学及病毒致病性的研究对兽医和人类公共卫生安全具有重要的科学意义。
目前SIV主要流行的有H1N1、H1N2和H3N2三种亚型[6]，也有从猪体内分离到H3N1、H4N6、H5N1和H9N2等亚型病毒的报道[7-9]。H1N1亚型病毒又被划分为经典型、类禽型、类人型等不同的基因型[10]。H1N2亚型SIV于1978年首次出现于日本，其NA基因来自于H3N2亚型人流感病毒，其余7个基因均来自于经典型H1N1 SIV，为一株二重配病毒[11]。之后，H1N2亚型SIV在欧洲、北美和亚洲多个国家的猪群中先后出现，病毒的基因来源复杂、多样[12-14]。我国于2004年首次分离到H1N2亚型SIV，该毒株与日本毒株具有相似的基因型[15]；随后在不同省份猪群中又先后监测到H1N2病毒，基因型呈现多样性[16-17]。近年来，尤其是在2009年造成人流感大流行的2009/H1N1病毒由人传播至猪群以后，不同亚型、不同基因型SIV之间发生重组而产生新重配型H1N2病毒的情况愈加频繁[18-19]。
笔者实验室于2016年12月份在辽宁省开展SI的流行病学调查，结果发现H1亚型SIV的血清学抗体阳性率普遍较高，同时开展了病原学的监测。本文重点对分离的一株H1N2病毒进行了全基因序列的测定和遗传演化分析，并以BALB/c小鼠为模型动物，评估病毒的致病性，为我国SIV的分子流行病学提供新数据，有助于更好地防控动物流感的发生与流行。
1 材料与方法 1.1 样品采集2016年12月，从辽宁省的某屠宰场采集650份猪鼻拭子，样品贮存于磷酸盐缓冲液(含青霉素和链霉素各2 000 U·mL-1)中，置-70 ℃条件下保存。
1.2 病毒的分离与鉴定将样品按照国家标准(GB/T 27536-2011)[20]的方法处理后，经尿囊腔接种于10日龄鸡胚，孵化至72 h，收获尿囊液、测定其HA效价，第1代HA阴性的样品需继续盲传一代，阳性样品进一步纯化、增殖后，应用已建立的RT-PCR方法进行亚型鉴定[21]。
1.3 全基因序列测定与分析 1.3.1 引物SIV的反转录通用引物Uni-12(5′-AGCAAAAGCAGG-3′)、参照文献[22]所设计的8个基因片段的扩增和测序引物均由上海Invitrogen生命技术有限公司合成。
1.3.2 RT-PCR扩增按照RNA提取试剂盒说明书提取病毒RNA，在反转录酶M-MLV的作用下合成cDNA，利用各个基因片段的特异性扩增引物进行PCR扩增，反应步骤：95 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s(其中NA Ⅰ节段53 ℃、PB2 Ⅱ节段56 ℃)，72 ℃延伸2 min，35个循环；72 ℃延伸7 min。扩增片段分别经DNA Gel Extraction Kit纯化、回收。
1.3.3 序列测定分别采用各基因片段的测序引物、按照BigDye Terminator 3.1试剂盒说明书的要求进行测序反应，由Applied Biosystems 3500xL完成序列测定。
1.3.4 核苷酸同源性与遗传进化分析利用DNAStar的SeqMan程序进行序列拼接，应用MegAlign程序进行同源性分析；在NCBI中检索同源序列，采用MEGA7.0，应用Neighbour-joining算法，Bootstrap值设置为1 000，进行进化分析并绘制进化树；在IRD数据库中，应用Global H1 Clade分类法，下载我国大陆分离的H1N2亚型SIV各个基因片段序列(截止时间2018年11月30日)，结合本研究测定的FX575序列，对H1N2毒株的基因型进行系统分析。
1.3.5 病毒的分子特征分析依据上述测定的分离毒株各基因片段核苷酸序列推导其编码的相应氨基酸序列，对HA、NA、PB2和M2等蛋白进行关键氨基酸位点的分析。
1.4 小鼠的感染试验将16只6周龄雌性BALB/c小鼠随机分成2组，每组8只，其中一组为病毒感染组，采用滴鼻途径接种50 μL(病毒含量为106EID50)的病毒，另一组为空白对照组，同样方式接种50 μL无菌PBS。感染前1 d及感染后14 d内每天称量小鼠的体重，并记录小鼠的发病与死亡情况，体重下降比例超过25%即视为死亡。感染后第3天，每组随机剖杀3只小鼠，采集其脑、鼻甲、肺、脾、肾等组织，匀浆处理后取适当稀释度接种非免疫鸡胚，进行病毒滴定，按照Reed-Muench法确定病毒含量。感染后第14天，采集剩余小鼠的血液，分离血清，采用受体破坏酶(RDE)的方法对血清进行处理以去除哺乳动物血清中的非特异性血凝抑制因子，利用血凝抑制(HI)方法测定试验小鼠抗体转阳情况。
2 结果 2.1 病毒的分离鉴定所有样品经接种鸡胚、盲传两代后，共有3份样品的接胚尿囊液具有HA活性，利用RT-PCR对HA和NA基因进行亚型鉴定，确定2株病毒为H1N1、1株病毒为H1N2。后续试验用到的H1N2亚型SIV命名为A/swine/Liaoning/FX575/2016 (H1N2)(简称FX575)。
2.2 8个基因片段的序列测定与同源性分析提取病毒RNA，经RT-PCR扩增，获得预期大小的目的条带，胶回收、纯化各片段进行测序。将测得各个基因片段的序列进行拼接，并利用NCBI中的BLAST工具查找与分离毒株8个基因片段核苷酸序列同源性最高的毒株，结果发现HA基因与分离自我国的EA H1N1 SIV A/swine/Hong Kong/434/2006(H1N1)相似性最高，核苷酸相似性为100%，NA基因与H1N2病毒A/swine/Guangxi/325/2012(H1N2)的核苷酸相似性最高，为99.8%，PB2、PB1、PA、NP、M和NS 6个内部基因片段分别与分离自我国的2009/H1N1 SIV毒株A/swine/Heilongjiang/44/2009核苷酸相似性最高，达98.4%~99.2%。
2.3 遗传进化分析为进一步阐明分离毒株FX575的各基因片段的遗传演化关系，与GenBank中不同宿主、不同基因型的H1N1和H1N2毒株的相应序列进行比对，绘制进化树。结果HA基因进化树共分为4个大的分支，分别是经典型猪H1N1(CS H1N1)、人H1N1(Human H1N1)、禽H1N1(Avian H1N1)、欧亚类禽型H1N1(EA H1N1)，FX575位于EA H1N1分支，该分支包括了近年来分离自我国猪群的以及零星出现人感染的EA H1N1毒株(图 1A)。NA进化树可见，H1N2 SIV依据其NA基因的来源不同可分为北美型H1N2(North American H1N2，亦称为TR H1N2)和欧洲型H1N2(European H1N2)两个主要分支，FX575位于North American H1N2分支，与我国近年来分离的H1N2亚型SIV亲缘关系较近(图 1B)；以PB2基因的序列绘制进化树(图 1C)，结果显示：FX575位于2009/H1N1分支；PB1等其余5个内部基因也分别与2009/H1N1有着最高的同源性，进化树中该分离毒株位于2009/H1N1分支(图略)。
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图 1 毒株FX575的HA(A)、NA(B)和PB2(C)基因与参考序列构建的基因进化树 Fig. 1 Phylogenetic relationship of HA(A), NA(B), and PB2(C) gene of FX575 with reference sequences |
对下载的67株H1N2病毒及本研究分离毒株FX575的序列进行了分析，发现国内H1N2亚型SIV截至目前已出现了16个基因型(图 2)。病毒的HA基因来源分为CS H1N1、TR H1N2、Human H1N1、2009/H1N1和EA H1N1病毒；NA基因则来源于Human H3N2、TR H1N2和Swine H3N2病毒；6个内部基因(PB2、PB1、PA、NP、M和NS)同时来源于一种基因型的病毒较为普遍；表明毒株的基因来源呈现多样性。在分析的这68株病毒中，含有2009/H1N1基因的39株H1N2病毒就存在9个基因型，表现出2009/H1N1病毒极易与猪群中流行的病毒之间发生二重配和三重配的情况。本研究中，FX575的HA基因来源于EA H1N1、NA基因来源于TR H1N2、6个内部基因均来源于2009/H1N1病毒，与之前分离的3株H1N2病毒同为一个基因型。
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图 2 H1N2 SIV国内分离株的基因型分析 Fig. 2 Genotypic analysis of H1N2 SIVs isolated from mainland China |
毒株FX575的HA基因编码566个氨基酸，由HA1和HA2两部分组成，裂解位点处氨基酸组成为PSIQSR↓G，具有低致病性流感病毒的分子特征。选取不同基因型分支的H1N1流感病毒及与毒株FX575 HA基因相似性最高的HA序列作为参考，对毒株FX575的HA1蛋白上潜在糖基化位点、受体结合位点和抗原位点进行了分析，结果发现FX575的HA1蛋白上携带了3个潜在糖基化位点，分别位于21、33、276位(采用H3编码定位)(图 3)。参考Caton等[23]确定的H1N1流感病毒HA1蛋白5个抗原位点区域(Sa、Sb、Ca1、Ca2和Cb)，分析结果表明分离毒株FX575与毒株A/swine/Hong Kong/434/2006(H1N1)的所有抗原位点完全一致；与早期分离的EA H1N1毒株A/swine/Belgium/WVL1/1979(H1N1)相比较，抗原位点差异主要存在于Sb区域(188、189、198位)、Ca1区域(172位)和Ca2区域(141和225位)，其余抗原位点均较为保守(图 3)。受体结合位点分析发现FX575的HA1蛋白的190、225和226位的氨基酸分别为D、E、Q。通过分析毒株FX575的PB2蛋白，发现该毒株627和701位的氨基酸分别为E、D，这两个位点均没有发生能导致病毒致病性增强的相关氨基酸突变；但是其存在271A且590/591位为S/R的分子特征。此外，FX575 NA蛋白存在V215I、S331R突变，M2蛋白上存在S31N突变，提示该毒株可能对神经氨酸酶抑制剂类药物及金刚烷胺类药物具有一定的耐受[24-25]。
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糖基化位点用纵向实线方框表示；抗原位点均用纵向虚线方框表示；受体结合位点用菱形表示；裂解位点用横向粗实线方框表示 Lengthwise solid line boxes are potential glycosylation sites, lengthwise dotted boxes are antigenic sites, receptor-binding sites are shown as open diamonds, horizontal solid line box is cleavage site 图 3 分离株FX575与参考毒株HA1蛋白的氨基酸比较 Fig. 3 Amino acid analysis of HA1 protein of FX575 and reference strains |
病毒FX575感染小鼠的第2天，其体重出现下降，最大下降比例出现在感染后第7天，整个观察期内小鼠体重的下降比例为20.87%；在感染后第7天，其中有1只小鼠体重下降的比例超过25%，判为死亡。而接种PBS的对照组，小鼠体重在观察期内均缓慢升高(图 4A)。
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图 4 病毒FX575感染小鼠的体重变化(A)与脏器内病毒含量的测定(B) Fig. 4 The body weight changes (A) and viral titer in organs (B) of mice infected with FX575 |
FX575感染小鼠第3天时，对试验小鼠的脑、鼻甲、肺、肾和脾中的病毒含量进行滴定，结果在病毒感染组小鼠的脑、肾和脾内均未滴定到病毒，而肺和鼻甲中的病毒含量较高，滴度分别为4.82、4.20 log10EID50·mL-1，而接种PBS的小鼠其相应脏器的病毒滴定结果均为阴性(图 4B)。试验观察期结束时，对小鼠的血清抗体利用HI方法测定其抗体水平，结果FX575感染小鼠的血清学抗体全部转阳，效价均在1:320以上。
3 讨论作为流感病毒发生基因重组的重要场所，猪在流感病毒的生态分布中发挥着重要作用。之前在辽宁省开展的SI流行病学监测曾先后分离到EA H1N1和2009/H1N1的SIV[10, 26]，这也给不同基因型流感病毒之间的基因重组提供了可能，笔者对分离的一株H1N2亚型SIV FX575进行了全基因序列测定，并与GenBank中的参考序列进行了比对分析，结果发现毒株FX575在基因组成上与2011、2012年分离自我国其他省份的H1N2 SIV相似，均为三重配型病毒[19, 27]。其HA基因与分离自我国香港的一株EA H1N1 SIV核苷酸同源性最高，NA基因与一株H1N2 SIV同源性最高，PB2、PB1、PA、NP、M和NS 6个内部基因分别与2009/H1N1毒株具有最高的同源性，表明该分离毒株是由EA H1N1、TR H1N2和2009/H1N1三种不同基因型的病毒发生重配而形成的新基因型SIV。自分离到第一株H1N2亚型SIV以来，截至目前我国大陆分离的H1N2亚型病毒已经出现了16个基因型，尤其是2009/H1N1病毒传播至猪群之后，更是加剧了重配病毒在猪群中出现的频率，且重配的方式愈加多样化[27-29]，有关本研究所分离的这种基因型的H1N2 SIV是否已经在猪群中适应而具有一定的流行优势，需要持续地开展SI病原学监测。
流感病毒的致病力是由病毒的HA、PB2等多个蛋白共同决定的，目前已鉴定出一系列与致病力相关的关键氨基酸位点[30]。已有研究发现HA蛋白190D、225E和226Q对病毒结合SA-α-2, 6-Gal受体的能力非常重要[30-31]，同时225E能够增强EA H1N1 SIV在豚鼠中的传播能力[32]。本研究中，毒株FX575的HA蛋白同时具有这几个氨基酸的分子特征。此外，HA蛋白受体结合位点附近糖基化的改变也可影响病毒受体结合特性、增强病毒对哺乳动物的致病性。FX575的HA1蛋白上糖基化位点的分析结果表明，其95位糖基化位点出现缺失。PB2蛋白的T271A、E627K和D701N的氨基酸突变对流感病毒的宿主范围及致病力有着重要决定作用[30, 33]。此外，有研究发现PB2蛋白590/591(S/R)多态性有助于2009/H1N1病毒克服宿主因素的限制而增强病毒的复制能力[34]，笔者对毒株FX575的PB2蛋白分析发现，该毒株没有发生E627K和D701N突变，但是存在271A、590S和591R。关于该毒株HA蛋白及PB2蛋白的这些分子特征对病毒的致病性影响如何，有待于进一步的研究。
SIV对猪的致病性表现为高发病率、低死亡率，除了构成对养殖业的危害，更多的关注点是基于该类病毒对人的公共卫生安全所呈现的潜在威胁。当前我们国家对于SI的防控还没有广泛地使用疫苗，而猪场从业人员在工作过程中与猪群有着较为密切的接触，已有研究报道这部分人群已被检测到较高的SI血清学抗体阳性率[35-36]。因此，在本研究中，笔者以小鼠为感染模型初步评估了分离毒株的致病性，结果发现FX575能够引起感染小鼠的体重明显下降，导致部分小鼠死亡，病毒可在小鼠的鼻甲与肺高滴度复制，提示该分离毒株呈现中等致病力特征。与以前报道的单纯型EA H1N1 SIV对小鼠的致病性相比，FX575毒株的致病力有所增强，笔者推测是由于该分离毒株在基因型上为一株重配型的H1N2病毒，同时携带有2009/H1N1病毒的PB2等6个内部基因。国内外研究报道以及笔者实验室多年来的SIV监测数据表明2009/H1N1病毒在引起全球人流感的大流行之后传播到猪群，尽管没造成SI的大面积流行，但它为新的重配型病毒的产生不断地输送着各种基因片段，尤其是含有2009/H1N1病毒6个内部基因的重配型病毒已经相对稳定地流行于猪群中[27]。已有研究结果表明2009/H1N1病毒内部基因能够大大提高其他一些亚型流感病毒对哺乳动物的致病性或者增强病毒的水平传播能力[37-38]。因此，针对本研究分离的这种基因型的H1N2病毒，实验室将进一步深入研究其致病性及其在哺乳动物之间的传播特性。
4 结论通过开展SI病原的分子流行病学研究，表明我国猪群中流行的EA H1N1、2009/H1N1等不同基因型的SIV通过重组导致了基因三重配病毒的出现，新的重组病毒呈现了对小鼠的中等致病力特征，提示我们需加强对SI的主动监测，做好SIV的致病性风险评估，为流感的综合防控提供理论依据。
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