2. 兰州大学草地农业科技学院, 兰州 730020
2. College of Pastoral Agricultural Science and Technology, Lanzhou University, Lanzhou 730020, China
骨骼肌的发育是一个高度组织化的严密过程，受到肌纤维、脂肪细胞和结缔组织(intramuscular connective tissue, IMCT)间的复杂相互调控作用[1]。其中，IMCT主要由胶原蛋白构成[2]，主要分布在肌外膜、肌束膜和肌内膜中，分别负责包裹和保护支持整块肌肉、一束肌纤维和单个肌纤维。IMCT是一个三维网络结构，它的形态和组成受到动物品种、性别、年龄、肌肉类型等因素的影响[3]。IMCT和相关的蛋白构成了肌肉的框架，包裹肌纤维、保持肌纤维的完整性，将肌肉和骨骼连接在一起，同时也调节肌肉的生长[4]。因而，肌肉中的胶原蛋白含量对肌肉的发育具有不可替代的作用。胶原蛋白在肌肉中主要以胶原纤维的形式存在于肌内膜和肌束膜中，保护与连接肌纤维和肌束，且Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白是哺乳动物中含量最多的胶原蛋白[5]。而由于胶原蛋白功能特性的原因，它的强度往往较高，影响肌肉的嫩度和品质。一般情况下，胶原蛋白的代谢更新速度比较慢，受到基质金属蛋白酶(MMPs)的影响，基质金属蛋白酶的活性受到基质金属蛋白酶抑制因子(IMTPs)的调节[6]。有研究表明，胶原蛋白、MMPs和赖氨酰氧化酶之间存在相互作用，它们是合成和降解IMCT的重要成分[7]。因而，胶原蛋白代谢更新相关的酶也是影响肌肉胶原蛋白的重要因素。Nishimura[1]指出，调控肌内结缔组织的发育在今后的肉品质研究中占有重要的地位。近年来，相关研究指出，日粮采食量对肌肉胶原蛋白产生显著性影响，通过前期限饲后期自由采食方式可以提高可溶性胶原蛋白的含量和肉品质[8]。也有研究试图通过合理利用饲料资源(酿酒葡萄渣、辣木青贮等)调控肌肉胶原蛋白含量，并改善肉品质[9-10]。而在育肥期，通过油脂提高日粮能量水平，促进羔羊的快速生长并调控肉品质，是一种常见的方法。然而，不同出生类型羔羊后期生长发育有所不同，日粮油脂添加对不同出生类型羔羊胶原蛋白特性的影响尚不明确。
本研究主要注重于研究日粮营养成分及不同出生类型羔羊的胶原蛋白相关特性，为进一步研究胶原蛋白与肌肉发育及肉品质调控的关系提供理论基础。
1 材料与方法 1.1 动物试验时间和地点动物试验在甘肃省民勤市中天羊业有限公司进行。预饲期7 d，正式期90 d。
1.2 试验设计试验采用2×2双因素处理设计，研究日粮脂肪含量(添加0%大豆油，CON日粮；添加2%大豆油，SBO日粮)和出生类型(双胞胎羔羊(TW)、三胞胎羔羊(TR))对湖羊背最长肌胶原蛋白相关特性及基因表达的影响。试验共选用64只湖羊公羔，其中双胞胎羔羊和三胞胎羔羊两种出生类型各32只。羔羊从出生至断奶，随母哺乳。60日龄断奶后，经过7 d适应期，分成4个处理组(TW-CON、TW-SBO、TR-CON和TR-SBO)，每个处理各16只，采用单栏饲养(长1.2 m×宽1.0 m×高1.0 m)，进行90 d育肥饲养试验。
1.3 试验饲粮试验羊的日粮配方参考NRC(NRC 2007)育肥羔羊的饲养标准和农业部肉羊饲养标准(中华人民共和国农业部2004)进行配制。日粮配方及营养成分见表 1。
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表 1 试验日粮组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the experimental diet (DM basis) |
试验开始前，圈舍使用强力消毒灵溶液进行全面消毒。在整个饲养期，每天分别在8:00、14:00和20:00饲喂TMR日粮。自由采食，自由饮水。
1.5 样品采集及测定指标和方法羔羊育肥90 d后屠宰，屠宰前禁食24 h，禁水12 h，采用清真屠宰方式。屠宰后取体积为1.0 cm×1.0 cm×1 cm的背最长肌组织样本，保存于4%甲醛固定溶液中用于后续切片制作，分析胶原纤维的分布和形态。取20 g肌肉样本置于-80 ℃保存，用于胶原蛋白常规指标的检测。另取10 g左右背最长肌分装于2个冻存管，于液氮中保存，用于后续的mRNA提取和基因表达分析。
1.5.1 肌肉胶原蛋白特性测定主要测定指标包括总胶原蛋白(TC)、可溶性胶原蛋白(SC)、胶原蛋白溶解率(CS)、Ⅰ型胶原蛋白(COLⅠ)和Ⅲ型胶原蛋白(COLⅢ)含量。以上指标按照上海蓝基生物科技有限公司的ELISA胶原蛋白测定试剂盒操作说明进行测定。
1.5.2 肌肉胶原形态分布观察取固定好的肌肉组织样本，通过修块-脱水-透明-浸蜡-包埋-修蜡块-切片-脱蜡、水化-Masson染色-透明封片-显微镜镜检，图像采集分析，获得胶原形态分布结果。
1.5.3 胞外基质胶原相关指标测定主要测定指标包括基质金属蛋白酶1(MMP-1)、基质金属蛋白酶13(MMP-13)、基质金属蛋白酶抑制剂1(TIMP-1)、蛋白多糖(DCN)、赖氨酰氧化酶(LOX)、吡啶诺林(PYD)。以上指标采用上海蓝基生物科技有限公司的ELISA试剂盒进行测定。
1.5.4 肌细胞发育及胶原相关基因表达水平测定样品RNA提取使用北京天根生化科技有限公司的试剂盒，按照操作说明进行。使用ABI7500荧光定量PCR仪SYBR Green染料法，以GAPDH基因作为内参(内参及引物由上海生工合成，序列见表 2)，测定肌肉发育相关基因(MYOD1、MYOG、MYF5)和胶原纤维发育相关基因(FGF2、FGFR1、FN1、TGFβ1、COL1A1、COL2A1、COL3A1、COL4A1和collagenalpha-1)的相对表达量。
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表 2 荧光定量PCR引物序列 Table 2 Primer sequence for qPCR |
荧光定量结果根据Ct值用2-△△Ct法计算各基因相对表达量。所有试验数据经过Excel 2010初步整理后，采用SPSS 22.0软件包中的一般线性模型(GLM)进行双因素方差分析(two-way ANOVA)。固定效应设置为“出生类型”、“日粮处理”，以及两者的互作“日粮处理×出生类型”，组间差异采用Turkey氏法进行多重比较。以P < 0.05作为判断差异显著的标准。
2 结果 2.1 日粮油脂和出生类型对羔羊胶原蛋白含量、溶解性及分布的影响由表 3可知，双羔湖羊肌肉的Ⅰ型胶原蛋白含量显著高于三羔湖羊(P < 0.05)，Ⅲ型胶原蛋白含量则表现出高于三羔的趋势(0.05 < P < 0.10)。日粮添加油脂有提高可溶性胶原蛋白含量的趋势(0.05 < P < 0.10)，但对胶原蛋白的溶解率无显著性影响(P >0.05)。可溶性胶原蛋白含量和Ⅰ型胶原蛋白含量均表现出受日粮和出生类型互作影响的趋势(0.05 < P < 0.10)。胶原蛋白总含量则不受日粮油脂添加和出生类型的影响(P >0.05)。
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表 3 日粮添加油脂和出生类型对羔羊肌肉胶原蛋白含量和溶解性的影响(冻干粉基础) Table 3 Effects of dietary oil supplementation and birth types on collagen content and solubility in muscle of lamb (freeze-dried basis) |
图 1显示了日粮油脂和出生类型对胶原蛋白分布的影响。Masson染色是常用的观察肌肉胶原蛋白分布的染色方法，其中红色为肌纤维，蓝色为胶原蛋白，蓝色网状结构之间的白色区域为肌内脂肪，胶原蛋白多分布于肌肉血管周围。图 1表明，TW-CON和TR-CON两组肌束间的蓝色区域胶原蛋白网络较TW-SBO和TR-SBO组更为致密，蓝色较深，而TW-SBO和TR-SBO组蓝色胶原分布呈丝状，结构不规则，说明日粮油脂有破坏胶原蛋白结构的效果。
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图 1 背最长肌切片图(Masson染色50×) Fig. 1 Representative histopathological micrographs of LD muscle (Masson dyeing, 50×) |
由表 4可知，MMP-13含量因日粮中油脂添加而显著下降(P < 0.05)，而TIMP-1和PYD则表现出受日粮油脂添加和出生类型交互作用的显著影响(P < 0.05)。日粮油脂和出生类型对MMP-1、DCN和LOX含量无显著性影响(P >0.05)。
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表 4 日粮添加油脂和出生类型对羔羊肌肉胶原蛋白代谢更新相关指标的影响 Table 4 Effects of dietary oil supplementation and birth types on the collagen metabolism and turnover related indicators in muscle of lamb |
由表 5可知，双羔羔羊肌肉MYOD1基因的表达水平显著高于三羔羔羊(P < 0.05)，而日粮油脂水平和出生类型对MYOG和MYF5基因表达水平均无显著影响(P>0.05)，且无显著的互作效应(P>0.05)。而日粮添加油脂显著降低了胶原纤维发育相关基因FN1的表达水平(P < 0.05)，三羔COL2A1基因表达水平有高于双羔的趋势(0.05 < P < 0.10)；COL3A1随日粮油脂的添加其表达水平较未添加组上升了54.25%，且三羔的表达水平较双羔提高了55.99%，日粮和出生类型交互作用表现出对其具有显著影响的趋势(0.05 < P < 0.10)。日粮和出生类型交互作用对FGF2基因的表达水平也表现出具有显著影响的趋势(0.05 < P < 0.10)。其他与胶原纤维发育相关的基因未表现出受日粮油脂添加和出生类型的显著影响(P>0.05)。
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表 5 日粮添加油脂和出生类型对羔羊肌肉和胶原纤维发育相关基因表达的影响 Table 5 Effects of dietary oil supplementation and birth types on the expression of muscle and collagen fiber development related genes in lamb |
近年来，关于胶原蛋白与肉品质关系的研究越来越多，主要因为胶原蛋白反映了肌肉的基础硬度，且由胶原蛋白部分决定的肉的硬度是在加工储存过程中不易改变的。但是由于影响肌肉嫩度的肌肉内部特性因素很多[11]，所以有时胶原蛋白也不能较准确的反映肌肉的嫩度。通常认为，胶原蛋白总含量只能反映生肉的硬度，并不能反映熟肉的硬度[12-13]，而胶原蛋白的溶解性可以较好的反映熟肉嫩度[14]。本试验发现，日粮中添加油脂有提高湖羊羔羊肌肉可溶性胶原蛋白含量的趋势，但未显著影响胶原蛋白的溶解性。肉牛上的研究结果指出，精料饲喂水平能够增加达到屠宰体重时(约17月龄)胶原蛋白的含量和溶解性[15]，而随着日龄的增加胶原蛋白溶解性逐渐下降[16]，这与本试验结果有一定的差异。可能是由于本试验屠宰时试验羊还处于羔羊阶段，肌肉仍在发育，肌纤维增粗，肌纤维表面的胶原蛋白不断更新，此时的胶原蛋白相对“不成熟”，溶解性较高，肌内脂肪对它的破坏作用未达到显著程度；另一方面，摄入能量提高，可以使动物肌内脂肪含量上升破坏胶原蛋白结构，增加胶原蛋白的溶解性，并改善肌肉的嫩度[15]。
试验结果还发现，双羔湖羊肌内Ⅰ型胶原蛋白含量显著高于三羔湖羊。Cho等[17]研究发现，随着月龄的增长(4~9月份)，牛肌肉中的Ⅰ型胶原蛋白含量随之增加，说明随着胴体逐渐成熟，肌肉Ⅰ型胶原蛋白含量会逐渐增多。研究表明，随着单胎产羔数的提高，同胎次羔羊之间对母体营养的竞争会影响它们在母体中的发育，羔羊出生体重和成活率随着单胎产羔数的增加而显著下降，多胞胎羔羊生长速度慢，出栏时间长[18-19]。因而，双羔比三羔出生类型的羔羊发育快，成熟度高，引起其Ⅰ型胶原蛋白含量增加。
Masson三色染色可观察肌肉胶原分布，本研究结果显示，双羔羔羊肌内血管较为粗大，日粮油脂使双羔和三羔羔羊肌内胶原蛋白分布更加分散且不规则。但日粮油脂没有改变羔羊肌肉胶原蛋白的溶解性，只改变了羔羊肌内胶原蛋白的表观形态和位置，这可能是因为幼龄动物肌内胶原蛋白本就代谢活跃，溶解性较高，受油脂影响小。
3.2 日粮油脂和出生类型对细胞外基质胶原更新与代谢的影响MMPs大致可以分为以下几种：胶原酶(MMP-1、MMP-8和MMP-13等)、明胶酶(MMP-2和MMP-9等)、基质降解酶(MMP-3、MMP-7和MMP-10等)等。其中，MMP-1和MMP-13负责降解Ⅰ型胶原蛋白[20]，且MMPs的活性受到TIMPs的调节。有研究表明，日粮油脂可以降低狗和兔子体内MMP-2和MMP-9的表达水平，提高TIMP-2的表达水平[21]。本试验中，日粮油脂降低了胞外基质中MMP-13的含量，且Ⅰ型胶原蛋白的含量也表现出受到了日粮油脂和出生类型双重作用的趋势，因而油脂的添加对降低肌肉Ⅰ型胶原蛋白含量有一定的促进作用。而TIMP-1受到日粮油脂和出生类型交互作用的影响，表现为三羔低于双羔，添加油脂组低于未添加处理组，表明日粮油脂的补充和羔羊出生类型均会对TIMP-1产生影响。前人报道指出，TIMP-1对除MMP-1、MMP-3、MMP-5和MMP-19之外的其他MMPs具有较强的抑制作用[22]，而本试验结果并未发现TIMP-1与MMP-13存在明显的负相关关系，这可能是由于交互作用掩盖了影响。由于存在显著的交互作用，推测油脂对不同出生类型羔羊MMPs与TIMPs的影响存在差异，二者均参与对MMPs和TIMPs的调控，但MMPs与TIMPs之间的互作效应还需要进一步研究。
PYD是肌肉中胶原纤维间的一种稳定成熟的共价交联，其含量越高，胶原蛋白的强度越大。本试验中，日粮油脂和出生类型有互作效应，其中出生类型也表现出显著影响，三羔PYD含量较双羔高9.32%，这可能是由于双羔羔羊的Ⅰ型胶原蛋白含量高，而Ⅰ型胶原蛋白较不成熟且共价交联少[23]，造成双羔PYD含量较低。从肌肉发育角度看，双胞胎羔羊肌肉生长发育相对较快，肌纤维增大速度快。肌纤维发育增大时，其表面的结缔组织就需要降解和重新合成以适应不断增长的肌纤维，所以双胞胎羔羊肌纤维表面的胶原代谢更新迅速，胶原更新速度快时，胶原纤维间的成熟交联PYD的含量就会减少[24]。
3.3 日粮油脂和出生类型对肌细胞及胶原纤维发育相关基因表达的影响目前关于营养与肌肉发育关系的研究多集中于家畜肌纤维和脂肪细胞发育方面[25-26]，而对于肌内结缔组织发育的研究较少。结缔组织主要是由肌肉内成纤维细胞合成的胶原蛋白构成，结缔组织形成过程也叫纤维化。由于结缔组织的形成与肌纤维生长之间存在密切联系，所以在肌肉发育过程中对二者同时进行研究很有必要，因而我们测定了肌纤维发育和胶原纤维发育相关基因的表达。
成肌决定因子MYOD1属于生肌调节因子，MYOD基因可促使静止期的肌卫星细胞向成肌细胞转化，还能把许多种类型细胞(如成纤维细胞、脂肪细胞等)转化为成肌细胞，并可促进成肌细胞进一步融合分化为成熟的肌纤维[27]。本试验中，双羔羔羊肌肉中MYOD1的表达水平高于三羔羔羊，可能是由于妊娠期双羔羔羊从母体获得的营养水平相对要优于三羔羔羊，并在出生后仍表现出长期作用效应，提高肌肉发育相关基因表达水平，最终造成双羔羔羊的肌纤维发育情况要好于三羔羔羊[28-29]。
纤维发生会促进胶原蛋白的合成和交联结构的形成，这个过程主要受到TGF-β信号通路的调控[30-31]，最终介导纤维连接蛋白FN1和Ⅰ型胶原蛋白的表达[32]。然而，在本试验中，TGF-β并没有受到日粮的影响，这可能是日粮油脂的添加作用于TGF-β信号通路上游区域相关基因，尚需进一步研究。Duarte等[33]认为，与安格斯肉牛相比，日本和牛的肌肉FN1基因表达水平更高，且肌肉中的胶原蛋白含量更高，溶解性更低。所以FN1会促进肌肉组织纤维化，对肉品质产生不利影响。本试验中，FN1的表达水平因日粮中油脂的添加而降低，进而有可能降低肌肉结缔组织强度，这与Nishimura[1]的观点相一致。本试验结果还表明，FGF2受到日粮和出生类型的交互作用。研究报道，FGF2对肌肉发育过程有重要作用，可以促进肌肉蛋白补偿生长。在妊娠期，三羔羔羊相对于双羔羔羊处于生长受限状态，因而出生后会表现出一定的补偿生长效应，因而，三羔羔羊中FGF2的表达水平相对高于双羔羔羊，在一定程度上促进肌肉发育；油脂的添加提高日粮能量水平，与补偿作用效果相反，相对的降低了FGF2的表达水平[34]。而COL3A1基因表达水平受日粮和出生类型的影响与Ⅲ型胶原蛋白含量相反，这可能是由于在试验期内，日粮和出生类型的补偿作用存在时间效应，不足以达到正常水平。
综上所述，笔者推测，出生类型和日粮油脂影响结缔组织的部分潜在作用机制为：双羔肌肉的MYOD1基因的表达水平高于三羔，所以肌纤维发育速度快，肌纤维表面的结缔组织更新也快，同时双羔羔羊肌内的成熟交联PYD含量低于三羔羔羊，Ⅰ型胶原蛋白含量高于三羔羔羊；添加油脂不会通过影响MYOD1基因进而影响胶原蛋白水平，但降低了控制肌肉纤维化基因FN1的表达，也影响了肌肉胶原蛋白代谢相关的MMP-13和TIMP-1的含量，最终表现为日粮油脂增加使肌内胶原蛋白的形态分布变得分散，肌肉纤维化程度降低。但是日粮油脂和出生类型之间的交互作用机制尚不清楚，需要进一步研究。
4 结论 4.1双羔湖羊背最长肌Ⅰ型胶原蛋白含量高于三羔，且MYOD1基因的表达水平也高于三羔羔羊，因而双羔羔羊肌纤维发育速度优于三羔。
4.2日粮添加油脂有提高可溶性胶原蛋白含量的趋势，但不影响胶原蛋白的溶解率；显著降低了羔羊肌内MMP-13含量以及FN1基因的表达水平，影响了胶原蛋白的分布。
4.3日粮油脂添加和出生类型互作显著影响肌肉中TIMP-1和PYD含量。可溶性胶原蛋白含量和Ⅰ型胶原蛋白含量有受到日粮油脂添加和出生类型互作影响的趋势。
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