转化生长因子-β1 (transforming growth factor-β1, TGF-β1)是一种多功能多肽，参与调控细胞生长、分化和免疫调节，不同种属动物TGF-β1的同源性在99%以上，其在细胞表面的信号受体主要有Ⅰ型(transforming growth factor -β receptor Ⅰ, TGF-βR Ⅰ)和IⅠ型受体(TGF-βR Ⅱ)，TGF-β1与TGF-βR Ⅰ结合，募集TGF-βR Ⅱ，启动信号通路下游的磷酸化，进而将配体信号传递到细胞核以应对外界刺激[1]；TGF-βR Ⅰ又称为活化素受体样激酶5(activin receptor like kinase 5，ALK5)，ALK5是TGF-β信号通路的关键点，抑制ALK5对其调控的Smads(drosophila mothers against decapentaplegic protein)蛋白的磷酸化作用，即可阻断TGF-β向细胞核的转导[2]。TGF-β1以受体介导的方式通过调节Leydig细胞功能、生精细胞增殖和凋亡、血-睾屏障的开关等，对各种雄性动物生殖功能发挥重要的作用[3]。TGF-β1及其受体表达具有种属特异性，且不同发育阶段表达也不同，TGF-β1及其受体TGF-βRⅠ主要在成年小鼠睾丸内精子细胞变态期大量表达[4]。TGF-β1在大鼠睾丸通过TGF-βR Ⅰ信号调节，主要表达定位于精原细胞，尤其是在减数分裂后期表达明显[5]；闫永平等[6]研究表明，TGF-β1在12月龄羊驼睾丸中只表达于精原细胞，24月龄羊驼则表达于各级生精细胞。因此，TGF-β1及其受体在不同种属睾丸发育的特定阶段及生精功能调节过程中发挥重要作用。
藏绵羊是中国3大原始绵羊品种之一，主要生活在海拔4 500 m左右的高寒牧区。高原环境缺氧对雄性生育能力的抑制不可忽视，睾丸局部血液循环中氧含量较低，组织形态学发生适应性改变，可导致各种信号通路调节机制发生改变，生精功能也会受到影响[7]。低氧明显上调肺动脉内皮细胞中TGF-β1 mRNA和蛋白的表达[8]。高寒低氧环境中，TGF-β1及其Ⅰ型受体在牦牛睾丸表达随年龄不同差异明显，二者均在性成熟期显著增加，且在青年牦牛睾丸组织中繁殖期表达均低于繁殖间期，提示其与激素分泌关系密切[9]；成年藏绵羊睾丸间质结缔组织较为丰富，相比较于小尾寒羊，睾丸局部细胞外基质的分布更有利于维持Leydig细胞的合成能力[10]；人睾丸TGF-β1及其Ⅰ型受体主要定位于Leydig细胞，与Leydig细胞增殖关系密切[11]。高原型藏绵羊1.0岁左右性成熟，1.5~2.0岁开始配种，性成熟前后激素分泌等生理特征变化明显，为此，本研究采用免疫印迹、组织化学方法和图像分析技术对TGF-β1及其受体在性成熟前后藏绵羊睾丸的表达及分布特点进行比较分析，为进一步研究其在高原动物生殖生理功能及其适应性调节提供参考。
1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 试验动物试验动物来自甘肃天祝藏族自治县祁连乡养殖户，在同一群藏绵羊分不同组，经睾丸摘除手术收集样本，1.0、1.5、2.0岁睾丸各6对；新鲜睾丸处理成小块后分两部分，一部分液氮罐保存，用于免疫印迹杂交反应；另一部分经4%多聚甲醛溶液固定，用于组织化学染色。
1.1.2 主要药品试剂兔源多克隆抗羊抗体TGF-β1(bs-0086R)、TGF-βRⅠ兔抗鼠多克隆抗体(bs-0638R)及免疫组化染色试剂盒(SP-0023，美国ZYMED)；DAB显色试剂盒(ZLI-9018，北京中杉金桥生物技术有限公司)；APES防脱玻片(ZLI-9502，北京中杉金桥生物技术有限公司)；RIPA裂解液(碧云天生物技术研究所)；PVDF(聚偏二氟乙烯)膜(Millipore公司)；X光片(日本Fuji公司)。
1.2 试验方法 1.2.1 Western blot分析睾丸组织提取总蛋白，称取100 mg液氮保存睾丸组织打碎后按比例加入含有PMSF的RIPA裂解液，用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解，低温14 000 r·min-1离心5 min，将上清移入另一管内，取溶液体积的1/2试剂溶解沉淀，室温放置30 min后，置于4 ℃，15 000 r·min-1离心20 min。吸取上清参照BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术研究所)测定蛋白浓度后分装，-70 ℃冻存备用。
按常规操作提取蛋白并上样，其常规程序：应用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白；制备5%的浓缩胶和12%的分离胶，取30 μg蛋白量上样于凝胶加样孔内进行电泳，将带有目的条带的凝胶湿转法进行电转；一抗TGF-β1 (1:1 000)，4 ℃过夜孵育后洗膜，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG作为第二抗体室温孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min，PVDF膜显色：化学发光底物A液与B液1:1混合，室温反应，吸干反应液，转印膜拍照分析。免疫印迹分析时TGF-βRⅠ (1:1 000)，β-actin为内参。
1.2.2 组织样本H.E染色及免疫组织化学染色睾丸组织样品切成1.0 cm×1.0 cm×0.6 cm大小，多聚甲醛固定20 h，流水冲洗24 h，常规梯度酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、制备切片，切片厚5 μm，苏木精-伊红(H.E)常规染色。
免疫组化SP法染色：石蜡切片厚4 μm，连续3片为一组贴于多聚赖氨酸处理好的载玻片上，常规梯度酒精脱蜡，枸橼酸酸盐热修复，30 g·L-1 H2O2水溶液封闭过氧化物酶10 min，正常山羊血清白蛋白孵育15 min后；每张切片滴加50 μL兔多克隆抗鼠TGF-β1-IgG (稀释度1:400)，37 ℃孵育2 h，PBS振洗后每张切片滴加50 μL生物素标记山羊抗兔IgG工作液，加50 μL辣根酶标记链霉卵白素工作液，37 ℃孵育滴加新鲜配制DAB显色液，常规脱水透明、封片。
TGF-βRⅠ免疫组化染色时一抗TGF-βRⅠ-IgG，其它操作步骤同1.2.1(TGF-β1)。阴性对照以0.01 mol·L-1 PBS代替一抗进行染色。
1.3 数据分析Western blot处理图片分析：首先选择Western blot表达条带，利用Image J 1.48分析其灰度曲线，并计算波峰下面积为条带密度值，以β-actin密度值为基数，不同年龄组TGF-β1及TGF-βRⅠ表达条带密度值与之相比较得到相对密度值，进而用SPSS 21.0统计软件进行统计学处理。数据均用“均值±标准差(Mean±SE)”表示，P < 0.05表示差异显著。
切片在NIKON ECLIPSE 80i显微摄像系统进行照相。免疫组织化学染色每组随机选取5张切片，每张切片随机选取6个不重复视野(400×)，用Image Pro Plus 6.0软件统计染色结果中每个视野下阳性信号强度均值与阳性面积计算表达平均吸光度；1组共计30个统计数据，结果计为“均值±标准差(Mean±SE)”，SPSS15.0软件统计分析，采用单因素方差分析同一因子在性成熟前后表达量差异，配对t检验，P < 0.05表示差异显著。
2 结果 2.1 藏绵羊睾丸组织TGF-β1及其受体TGF-βRⅠ的Western blot分析Western blot结果显示，TGF-β1在性成熟前后藏绵羊睾丸组织中均较弱表达，1.0岁时表达量最低，1.5岁时表达量略有增加(图 1A)。数据统计分析表明, 1.5岁时藏绵羊睾丸组织中TGF-βRⅠ表达量均显著高于1.0及2.0岁(P < 0.05)(图 1B)。
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1.1.0岁；2.1.5岁；3.2.0岁。*.P < 0.05表示不同岁龄组间差异显著。图 3同 1.1.0-year-old; 2.1.5-year-old; 3.2.0-year-old.*.P < 0.05, means the significant difference between the expression of TGF-βRⅠin different ages accordingly.The same as Fig. 3 图 1 TGF-β1和TGF-βRⅠ在性成熟前后藏绵羊睾丸中免疫印迹表达(A)及灰度值分析(B) Fig. 1 The Western blotting expression(A) and gray value analysis(B)of TGF-β1 and TGF-βRⅠ in testis of Tibetan sheep before and after sexual mature |
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图 3 TGF-β1和TGF-βRⅠ在性成熟前后藏绵羊睾丸中平均吸光度值 Fig. 3 The average absorbance value of TGF-β1 and TGF-βR Ⅰ in Tibetan sheep testis before and after puberty sexual mature |
1.0岁藏绵羊生精小管发育良好，上皮有3~5层生精细胞，精原细胞及1~2层初级精母细胞分层明显；Sertoli细胞数量较多；间质组织内Leydig细胞分散分布，个别管腔偶见精子细胞(图 2A)。1.5岁时生精小管直径明显增加，生精上皮层数增加为6~8层复层上皮，腔面有成熟精子镶嵌在Sertoli细胞顶端；间质组织间血管、淋巴管及结缔组织增多，Leydig细胞分布明显(图 2B)。2.0岁藏绵羊生精小管管径较1.5岁无明显增加，有6~8层生精上皮细胞，各层细胞分层明显，游离面分布有大量精子，间质结构清楚(图 2C)。
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Lc.淋巴管; Ley. Leydig细胞；Ps.初级精母细胞；Sc. Sertoli细胞；SV.小血管；Sp.精原细胞；ST.生精小管 Lc. Lymphatic capillary; Ley. Leydig cells; Ps. Primary spermatocyte; Sc. Sertoli cells; SV.Small blood vessel; Sp. Spermatogenium; ST. Seminiferious tubule 图 2 TGF-β1及其受体TGF-βRⅠ在性成熟前后藏绵羊睾丸组织的表达 Fig. 2 TGF-β1 and TGF-βRⅠ expression in Tibetan sheep testis before and after sexual mature |
免疫组织化学分析表明，TGF-β1在1.0岁藏绵羊主要表达于Leydig细胞及小血管内皮细胞，Sertoli细胞及各级生精细胞未见明显表达(图 2D)；1.5岁藏绵羊睾丸组织中TGF-β1于Leydig细胞和淋巴管内皮细胞弱表达，各级生精细胞及Sertoli细胞中等阳性表达(图 2E)；TGF-β1在2.0岁藏绵羊Leydig细胞和血管内皮细胞未见明显表达，只在生精上皮弱表达(图 2F)。与此相比较，性成熟前后藏绵羊睾丸组织中TGF-βRⅠ表达较TGF-β1阳性信号增强，1.0岁藏绵羊睾丸组织中，TGF-βRⅠ主要均匀表达于生精上皮，Leydig细胞及肌样细胞未见明显表达(图 2G)。在1.5岁藏绵羊睾丸组织中，TGF-βRⅠ在生精上皮表达明显，尤以圆形精细胞为强阳性表达，Sertoli及Leydig细胞为较强阳性表达(图 2H)，2.0岁龄藏绵羊睾丸组织中TGF-βRⅠ明显表达于生精上皮，Leydig细胞及毛细淋巴管亦见阳性表达，但表达弱于1.5岁(图 2I)。各组阴性对照无表达(图 2J~2L)。统计结果表明，藏绵羊在1.5岁睾丸组织TGF-β1表达较1.0及2.0岁高，但差异不显著(P>0.05)；1.5岁时较1.0和2.0岁TGF-βRⅠ表达显著升高(P < 0.05)(图 3)。
3 讨论TGF-β1是TGF超家族的一员，为多效性细胞因子，对不同动物的生殖功能产生多方面的影响[3]。Teerds等[12]研究发现，TGF-β1在性成熟后大鼠睾丸表达高于性成熟前。Mullaney等[13]研究表明TGF-β1基因在青春前期、青春期中期的大鼠睾丸的表达随年龄增加而上升，青春期后期表达下降，认为其可作为调节因子参与生精过程。体外研究证明，TGF-β1通过抑制粗线期精母细胞分化形成圆形精子的信号通路参与精子成熟过程[14]。与此相一致，本研究中，藏绵羊从1.0岁性成熟前期到1.5岁性成熟期睾丸组织TGF-β1表达增加，而在性成熟后2.0岁表达下降，且睾丸组织特点表明藏绵羊1.5岁生精上皮发育良好，2.0岁时精子大量生成，提示在性成熟TGF-β1表达降低有利于生精细胞的发育。侯武刚等[4]研究表明TGF-β1及其受体TGF-βRⅠ在成年小鼠睾丸内主要在精子细胞变态期大量表达。睾丸Sertoli细胞是决定精原干细胞(spermatogonial stem cells，SSCs)分化命运的关键细胞，TGF-β1表达于性成熟前小鼠和猪睾丸组织的Sertoli细胞，认为TGF-β1通过调节Sertoli细胞间连接，参与血-睾屏障的开关，进而调节精子发生[4, 15]。资料表明，TGF-β1基因在性成熟前期大鼠睾丸Sertoli细胞表达量增加，而在性成熟后下降，提示其参与性成熟前后Sertoli细胞功能变化[13]。本研究中，TGF-β1在1.5岁藏绵羊睾丸各级生精细胞及Sertoli细胞阳性表达，其他年龄段未见明显表达，提示性成熟前后TGF-β1及其受体通过调节Sertoli细胞在精子生成过程中发挥作用。
TGF-β1在睾丸的表达具有独特的激素依赖性。Zhang等[16]对人睾丸内TGF-β1免疫组化定位研究发现其定位于Leydig细胞，提示它们与Leydig细胞的功能有关。TGF-β1可抑制成人睾丸间质干细胞分化，进而抑制激素分泌[17-18]。TGF-β1在性成熟初期35日龄小鼠Leydig细胞无明显表达，在50日龄性成熟小鼠Leydig细胞阳性表达，而在75日龄小鼠则无明显表达，认为TGF-β1与小鼠睾丸不同发育阶段的激素合成功能关系密切[19]。本研究中TGF-β1在1.5岁藏绵羊睾丸组织中主要表达于Leydig细胞提示其主要与性成熟期Leydig细胞功能密切相关。Fawcett等[20]研究发现绵羊的睾丸淋巴含有相当数量的睾丸酮，淋巴作为特殊的激素携带者可能发挥重要作用。睾丸Leydig细胞处于细胞外液、血液、淋巴三者联系的枢纽位置，浸没在含有巨噬细胞的淋巴液中，有利于Leydig细胞分泌的雄激素进入血液和淋巴[21]；低氧诱导淋巴管内皮细胞TGF-β1 mRNA的表达上调，淋巴管局部TGF-β1的分泌增加，影响其受体表达且与低氧刺激诱导的异质性相关[22]。因此，本研究中TGF-β1在1.5岁藏绵羊睾丸淋巴管的表达可能与这一时期睾丸局部睾丸酮分泌相关，而同时淋巴管TGF-βRⅠ的表达也增加，可能是低氧环境中藏绵羊睾丸淋巴管壁内皮细胞分泌TGF-β1的能力增强，有助于睾丸局部免疫调节，其机理有待于进一步研究。
TGF-β1通过TGF-βRⅠ的介导，调节TGF-β1信号通路中相关蛋白的差异表达或者磷酸化激活不同的靶基因，从而对细胞外刺激产生合适的反应[3]。Caussanel等[15]研究表明TGF-β1表达于性成熟前期猪睾丸Leydig细胞和精原细胞，性成熟后表达于Sertoli细胞及各级生精细胞；TGF-βRⅠ在生精细胞减数分裂和精子形成期间表达尤为明显。成年狗睾丸中TGF-βRⅠ(ALK5)主要定位于生精细胞及Sertoli细胞，且在圆形精细胞强阳性表达[23]，也有研究表明，TGF-βRⅠ主要在青春前期牛Sertoli细胞中的表达，认为其主要通过作用于Sertoli细胞之间的连接，进而在生精细胞的迁移过程中发挥作用[24]。本研究中TGF-β1与TGF-βRⅠ在性成熟前后藏绵羊睾丸的表达位置基本相似，但TGF-βRⅠ在生精上皮的阳性信号更为明显，且在1.5岁时Sertoli细胞及圆形精细胞阶段强阳性表达，这表明在性成熟期TGF-β1/TGF-βRⅠ信号通路调控藏绵羊生精上皮的发育。体外研究表明TGF-β1/ALKs信号通路与人胚胎干细胞多能化的维持以及定向分化密切相关[25]，本研究结果与在小鼠、猪及狗的睾丸生精上皮表达相一致[4, 15, 23]，TGF-β1/TGF-βRⅠ主要在精子细胞变形后期表达尤为明显，提示TGF-βRⅠ信号通路参与藏绵羊生精细胞的定向分化，相比较于其他年龄段在1.5岁藏绵羊睾丸阳性信号更强，可能与此时期生精上皮分化能力增强有关。
成年动物睾丸Leydig细胞发育成熟，可分泌睾丸酮、促黄体生成素受体(LHR)、17α-羟化酶和3β-羟类固醇脱氢酶(3β-HSD)等Leydig细胞的标志物，性成熟前后随着Leydig细胞不断发育，睾酮的生物合成逐渐增加，促进睾酮降解的相关酶含量逐渐降低[26]。研究表明，TGF-β1及其受体表达定位于人睾丸Leydig细胞，TGF-β1通过TGF-βRⅠ的典型信号通路来参与Leydig细胞增殖分化及抑制激素合成[16, 18]，免疫组化研究表明，TGF-βRⅠ定位于成年羊驼睾丸Leydig细胞，通过对Leydig细胞的作用参与调节精子发生[27]。本研究中各年龄段藏绵羊睾丸组织TGF-βRⅠ及TGF-β1阳性表达以Leydig细胞变化最为明显，表明TGF-β1/TGF-βRⅠ信号通路随着性成熟发育参与调解Leydig细胞生物合成能力。TGF-βRⅠ蛋白在正常男性睾丸Leydig细胞染色较TGF-β1强[16]；高原地区，3月龄~8岁牦牛TGF-βRⅠ在睾丸组织的表达均高于TGF-β1，幼龄期到性成熟前期持续增加，性成熟后表达量先增加后降低，认为TGF-β1及其受体在精子发生过程中部分凋亡具有重要的调节作用[9]。与此相一致，本研究中各年龄段藏绵羊睾丸组织TGF-βRⅠ较TGF-β1阳性表达信号强，且二者随性成熟呈现先上升后下降的变化趋势。有资料表明，TGF-β1与TGF-βRⅠ在正常男性及弱精子症患者的Leydig细胞表达无明显差异，认为TGF-β1调节睾酮分泌可能不通过TGF-β1/TGF-βRⅠ信号通路，而与TGF-β1的其他调节通路相关[11]。亦有研究发现，低氧时TGF-βRⅠ信号通路相关调节因子Smad及磷酸化的Smad上调，肺组织局部组织胶原蛋白沉积，纤维结缔组织增加[28]；而高原地区，2岁成年藏绵羊睾丸间质结缔组织较同年龄小尾寒羊更为丰富[10]。因此，高原低氧环境中，性成熟前后藏绵羊睾丸组织中TGF-βRⅠ表达增加或与Leydig细胞哪些相关标志物的合成变化相关，或者与局部结缔组织增加相关有待于进一步研究。
4 结论高原地区藏绵羊睾丸组织局部TGF-β1及TGF-βRⅠ的阳性表达随着性成熟出现先上升后下降的变化趋势，提示性成熟前后TGF-β1及其受体通过调节Sertoli细胞在精子生成过程中发挥作用；TGF-βRⅠ较TGF-β1阳性表达信号强，尤以在Leydig细胞的变化表达更为明显，表明其可能参与调解Leydig细胞生物合成能力，其机理有待于进一步研究证实，本研究可为深入探索高原动物性成熟前后生精调控机理提供参考。
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