树突状细胞(dendritic cells,DCs)是一种专职抗原提呈细胞, 既可诱导天然免疫应答,又可诱导高特异性的获得性免疫反应[1]。禽类树突状细胞最早在肠黏膜的次级淋巴器官盲肠扁桃体中被发现[2],随后在禽的其他淋巴组织及表皮发现了3种主要类型的树突状细胞,即并指状树突状细胞、滤泡树突状细胞和表皮树突状细胞,能够识别不同的微生物并直接启动相关信号途径[3]。DCs的类型不同,不仅其形态存在一定差异,而且其功能也不完全相同,未成熟DCs有很强的抗原吞噬和处理能力,但其刺激T淋巴细胞的能力较弱,一旦通过病原相关分子模式(pathogen associated molecular pattern,PAMP)激活后,它们就会从非淋巴组织迁移到次级淋巴组织的T细胞区,在此过程中DCs逐渐成熟,表面高表达MHC Ⅱ类分子和共刺激分子,且抗原递呈能力及刺激T淋巴细胞能力增强[4]。虽然DCs在机体内分布广泛,但数量较少[5],难以与其他细胞分离纯化,严重影响了对DCs生物学特性及其与疾病关系的研究。故体外分离诱导是获得大量高纯度DCs的必要途径[6],目前哺乳动物DCs体外扩增技术比较成熟,但禽类DCs体外培养仅有零星报道,极大限制了对禽类DCs的进一步研究与应用。因此,本试验应用细胞培养技术,并经免疫组织化学、电子显微镜等技术分析鉴定,获得了大量高纯度的鸡骨髓源性DCs。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物2~8周龄雏鸡购自哈尔滨先锋孵化场。
1.1.2 主要试剂和仪器重组鸡GM-CSF(rc GM-CSF,Abcam公司),重组鸡IL-4(rc IL-4,Cloud-clone Crop公司),藻红蛋白(phycoerythrin,PE)标记的亚美尼亚仓鼠抗鼠CD11c抗体(N418 eBioscience公司),异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的鼠抗鸡MHCⅡ抗体(21-1A6英国Abcam公司),淋巴细胞分离液(天津灏洋公司),CCK-8溶液(碧云天生物有限公司),RPMI 1640培养液(美国Gibco公司),光学倒置显微镜(日本尼康公司),扫描电子显微镜(日本日立公司),流式细胞仪(美国BD公司)。
1.2 方法 1.2.1 鸡骨髓源树突状细胞的制备① 处死雏鸡后,快速截取股骨和胫骨,于75%酒精中浸泡5 min。②将上述鸡股骨和胫骨浸泡于含2%双抗的PBS中5 min。剪去两端骨骺,用PBS冲洗骨髓组织于平皿中,直至骨髓腔变白。③将骨髓悬液用200目尼龙网筛至另一平皿中,用注射器活塞适度挤压尼龙网上的骨髓组织。④过滤后的骨髓细胞悬液用PBS洗2次(1 500 r·min-1,按照1:1将骨髓细胞悬液缓缓移入已预先加有淋巴细胞分离液的玻璃离心管中,2 500 r·min-1离心25 min。⑤小心吸取中间白雾层细胞于另一离心管中,洗2~3次(1 500 r·min-1,10 min·次-1)。⑥用1 mL含10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、1%双抗、50 ng·mL-1 GM-CSF和25 ng·mL-1 IL-4的RPMI1640完全培养液重悬细胞,台盼蓝染色并计数,测定细胞活力大于95%后调整细胞浓度并铺板,细胞数量不小于3×106个·mL-1,置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。⑦每隔1 d换液50%,并补足GM-CSF和IL-4,于第7天加入脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)200 ng·mL-1,48 h后收集细胞。
1.2.2 鸡骨髓源树突状细胞表面标志物检测细胞培养至第7天,将培养细胞分为两组,一组加入LPS(200 ng·mL-1),另一组加入相同体积培养液,继续培养48 h后,轻轻吹打收集细胞,用4 ℃预冷的PBS洗涤2次,100 μL PBS重悬细胞,按1:100稀释加入MHCⅡ-FITC和CD11c-PE抗体,4 ℃避光孵育30 min,PBS洗涤3次,于流式细胞仪上经表面标记(MHCⅡ和CD11c)检测成熟和未成熟DCs数量。
1.2.3 鸡骨髓源树突状细胞扫描电镜表面形态观察轻轻吹打并收集细胞,调整细胞浓度为1×106个·mL-1,然后接种在预先用聚左旋赖氨酸包被的盖玻片上,继续培养2 h。弃掉培养液,用预冷PBS洗3次,加入2.5%戊二醛固定,并置于4 ℃冰箱中固定1.5 h以上。接着用pH 7.2 PBS洗涤3次,10 min·次-1。乙醇脱水:分别用浓度为50%、70%、90%乙醇逐级脱水,每个梯度10 min,100%乙醇脱水2次,10 min·次-1。100%乙醇:叔丁醇(1:1)和纯叔丁醇各1次,15 min·次-1。最后将样品放入冷冻干燥仪进行干燥,用离子溅射镀膜仪在样品表面镀一层100~150 Å的金属膜,放入样品盒中待检。
1.2.4 不同细胞培养条件对鸡骨髓细胞活性和增殖能力的影响对细胞接种密度、牛血清浓度对鸡骨髓细胞培养的影响进行检测,设计两因素四水平的试验进行优化细胞培养条件(表 1)。将分离出的鸡骨髓细胞悬液接种于96孔细胞培养板,100 μL·孔-1,每组设3个复孔,均分别在不同条件下连续培养6 d,隔天换液50%,并补足GM-CSF和IL-4,于第6天加入10 μL CCK-8溶液,孵育3 h后,酶标仪检测450 nm处吸光度。
细胞表型MHCⅡ和CD11c检测数据使用FlowJo软件分析,CCK-8检测细胞活力及增殖能力实验数据用GraphPad prism 7处理,并绘制细胞生长曲线,细胞培养第6天CCK-8检测细胞活力及增殖能力试验数据应用SPSS 17.0软件分析。
2 结果 2.1 鸡骨髓源树突状细胞的体外诱导分化、培养和形态观察将由鸡股骨和胫骨分离获得的鸡骨髓细胞接种于24孔细胞培养板中,在GM-CSF和IL-4诱导下进行分化,每天于倒置显微镜下观察细胞形态变化,结果显示,细胞培养第1天,可见细胞均匀分布在细胞培养板底部,呈圆形(图 1a);第3天,细胞贴壁生长,形成多个大小不等形似葡萄串状的集落,细胞体积增大,形态不规则,多数呈椭圆形,少数细胞表面长出小毛刺状突起(图 1b);第6天,细胞集落数量减少,且聚集程度减小,细胞体积增大,部分细胞表面长出头发丝或小毛刺状突起(图 1c);第9天,经LPS刺激后DCs成熟,呈半贴壁或悬浮状态,细胞游离集落,呈单个生长(图 1d);扫描电镜观察显示,未成熟DCs多数呈椭圆形,细胞表面突起较短(图 1e),成熟DCs与未成熟DCs相比,其体积显著增大,形态不规则,细胞表面突起增多且伸长变粗,呈典型的DCs形态(图 1f)。
分别用PE-anti-mouse CD11c和FITC-mouse anti-chicken MHCⅡ标记细胞表面CD11c和MHCⅡ,流式细胞术检测显示,未经LPS刺激组,其表面CD11c和MHCⅡ表达量分别为75.5%和89%,而经LPS刺激组,其表面MHCⅡ表达量为97.1%,明显高于未成熟型DCs,CD11c表达量为73.6%,无明显变化(图 2)。
将鸡骨髓细胞悬液调整为3×105、1×105、1×104、1×103个·mL-1密度梯度, 分别接种于96孔细胞培养板,分别在含10%、12%、15%新生牛血清和10%胎牛血清的培养液中连续培养6 d,经CCK-8法检测第6天450 nm处吸光度,结果显示,根据Ⅲ型平方和可知细胞接种密度和血清浓度这两个因素对细胞活性的影响程度:细胞接种密度>血清浓度(表 2),通过均值分析上述两个因素各水平对细胞活力的影响程度:细胞接种密度, 3×105>1×105>1×104>1×103; 血清浓度, 10%胎牛血清>12%新生牛血清>15%新生牛血清>10%新生牛血清(表 3)。因此本试验中鸡骨髓细胞的最佳培养条件为96孔板中接种密度为3×105个·mL-1,血清浓度为10%胎牛血清。
将鸡骨髓细胞悬液调整为3×105个·mL-1接种于96孔细胞培养板中,在含10%胎牛血清的培养液中连续培养9 d,经CCK-8法检测鸡骨髓细胞在体外增殖分化的生长曲线,由图 3可知,细胞状态良好。
DCs是连接天然免疫和获得性免疫的一种抗原提呈细胞(antigen presenting cells,APC),在机体的免疫应答和免疫耐受中发挥双向调节作用。稳定状态下的DCs捕获抗原后,导致T淋巴细胞无应答,产生免疫耐受。DCs在受PAMP刺激成熟后,一方面,可通过Toll样受体(toll-like receptors,TLR)触发并调节先天性免疫;另一方面,激活T淋巴细胞,诱导机体产生获得性免疫[7]。目前,有关哺乳动物体外诱导培养DCs已有很大进展,但鸡DCs的体外诱导培养方法研究较少,尚未成熟,本研究在参考哺乳动物和鸡体外诱导培养增殖DCs技术的基础上[8-10],经大量试验,摸索并优化了实验条件,成功建立了鸡骨髓源性树突状细胞体外诱导培养方法。利用密度梯度法成功分离鸡骨髓细胞是诱导获得大量DCs的重要前提,在分离过程中,首先应严格注意无菌操作,其次,在保证无菌操作的基础上,还要保证细胞的活性和数量[11],75%酒精对细胞具有一定的毒性,将鸡股骨和胫骨从75%酒精取出之后一定要用PBS将其彻底冲洗干净,尽量避免细胞接触到酒精。
在体外诱导培养DCs过程中,GM-CSF是首个用于临床诱导造血祖细胞定向分化的细胞因子,目前诱导骨髓源性DCs多应用GM-CSF和IL-4或TNF-α协同培养,可获得大量DCs[12]。但GM-CSF和IL-4的使用浓度至关重要,故本试验经过多次反复摸索及优化,采用50 ng·mL-1 GM-CSF和25 ng·mL-1 IL-4协同诱导培养鸡DCs,经显微观察发现,细胞于培养期间,与何静怡[13]报道相比,本试验可形成更多且更大的集落。在扫描电镜下,该分离培养细胞呈典型树突状细胞形态特征。通过流式细胞仪进一步检测发现,未成熟鸡骨髓源性DCs,其表面高表达CD11c和MHCⅡ,经LPS刺激后,细胞表面MHCⅡ表达量显著升高,上述研究结果与Wu等[14]报道的基本一致,表明本试验培养、诱导的鸡的骨髓细胞在本试验条件下分化成了DCs,且具有较高纯度,迄今没有鸡CD11c抗体,故本试验采用鼠CD11c抗体,流式细胞仪检测表达量为75.5%,实际诱导分化的鸡骨髓源性DCs纯度可能高于75.5%[15]。
不同培养条件对鸡骨髓细胞体外分化增殖的影响,迄今未见报道,本试验对细胞接种密度、牛血清浓度对鸡骨髓细胞体外分化、增殖的影响进行了较系统细致的研究,结果发现细胞密度对细胞生长有一定影响,与哺乳动物相比,鸡骨髓细胞在铺板时所需密度较大[16],对血清要求也较高,本试验在鸡骨髓细胞接种浓度为3×105个·mL-1、含10%胎牛血清的细胞培养液的培养条件下,获得大量DCs,经形态和表面标志双重鉴定,其纯度较高。本研究为在细胞水平探讨鸡病中DCs的功能和作用奠定了基础。
4 结论经淋巴细胞分离液分离获得鸡骨髓细胞,调整细胞浓度为3×105个·(mL·孔)-1,在含50 ng·mL-1 GM-CSF、25 ng·mL-1 IL-4、1%双抗和10%胎牛血清的RPMI1640培养液培养条件下,可获得大量而纯度为75.5%以上的鸡骨髓源性树突状细胞。
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