2. 畜禽智能化清洁生产河南省工程实验室, 新乡 453003;
3. 新乡学院, 新乡 453003
2. Henan Higher Education Discipline Intelligent Cleaner Production of Livestock, Xinxiang 453003, China;
3. Xinxiang University, Xinxiang 453003, China
传统畜禽养殖过程中，为了促进畜禽生长，预防疾病发生，常在畜禽饲料中添加抗生素。在饲料中添加适量的抗生素，对促进畜禽生长，改善畜禽健康具有一定的作用，但长期使用会导致抗生素残留、细菌耐药性、环境污染等一系列问题[1]。随着人们对抗生素作为饲料添加剂带来的危害的认识逐步深入，限抗减抗已成为共识。因此，寻找合适的抗生素饲料的替代品是目前亟待解决的问题。发酵饲料具有较好的适口性，能够维持肠道微生态平衡，降低腹泻率和死亡率，提高畜产品品质，是国家提倡的高效环保型饲料，是饲料业发展的趋势[2-5]。由于发酵饲料成分比较复杂，在我国尚没有一个完善的发酵饲料品质评定体系[6]。当前人们普遍认为活的益生菌含量是评定发酵饲料品质的一项重要指标[7]。目前检测发酵饲料益生菌含量的标准方法是平板计数法。平板计数法虽然准确，但是操作过程比较繁琐，用时较长。为了建立一种更加快速简便的方法，本研究以乳酸菌为研究对象，建立乳酸菌含量与Ct值的标准曲线，通过q-PCR检测样品Ct值，计算样品中的乳酸菌含量。用叠氮溴乙锭(ethidium bromide monoazide，EMA)来消除死菌DNA扩增造成的误差[8-10]。其基本原理为EMA是一种核酸染料，能够透过死菌细胞膜, 但不能透过活菌细胞膜。在曝光条件下与死菌DNA发生共价结合，没有结合的EMA则被光解，从而在扩增过程中抑制死菌DNA的扩增，提高检测结果的准确性，为以后发酵饲料品质评定和品质监测提供一定的技术支持。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株所用乳酸菌菌株为鼠李糖乳酸菌，通过煮沸10 min即得到灭活的细菌悬液。
1.1.2 试剂EMA购自美国Omega Bio-Tek公司；MRS琼脂培养基、MRS肉汤培养基购自青岛科园海博生物技术有限公司；细菌DNA提取试剂盒、SYBR® Premix Ex TaqTM Ⅱ购自TaKaRa。
1.2 方法 1.2.1 引物的设计根据Lopez等[11]的报道设计针对乳酸菌16S RNA的引物，上游引物5′-TCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGA-3′，下游引物5′-TCGAATTAAACCACATGCTCCA-3′，扩增长度408 kb。
1.2.2 DNA模板的制备取1 mL菌液，加入一定量的EMA使其浓度为3 μg·mL-1，避光反应10 min后将样品置于冰上，用碘钨灯在距离样品20 cm处曝光10 min。曝光后用DNA提取试剂盒按步骤提取DNA。用50 μL的Elution Buffer洗脱DNA作为模板。
1.2.3 q-PCR扩增细菌基因组DNAq-PCR采用20 μL的反应体系：2×Taq SBYR Green Mix 10 μL，上游引物0.8 μL，下游引物0.8 μL，DNA 2 μL，ddH2O 6.4 μL。反应条件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40个循环，同时设置平板计数方法作为阳性对照，与EMA-qPCR结果进行比较。
1.2.4 EMA-qPCR方法的优化在EMA-qPCR方法中对EMA的浓度及其曝光时间进行优化，以获得最优的反应条件。在1 mL(5.5×108CFU·mL-1)死细菌悬液中加入一定量的EMA，使其最终浓度为0、2、3、4、5、10 μg·mL-1，避光反应10 min后，不同曝光时间(0、5、8、10、15 min)反应后提取DNA进行q-PCR。
1.2.5 活菌/死菌混和液的配制及标准曲线的建立分别取活菌(6.33×108CFU·mL-1)和死菌(6.33×108CFU·mL-1)进行10倍梯度稀释，按照表 1进行1:1混合，经过EMA处理，进行q-PCR。
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表 1 活菌/死菌混合液的配制 Table 1 Preparation of mixture of live and dead bacteria |
对8份发酵饲料样品进行检测。每份样品取10 g溶于90 mL生理盐水中，放入摇床37 ℃ 150 r·min-1活化45 min。用双层纱布过滤，取滤液1 mL，将滤液按照所构建方法分别进行q-PCR和平板计数，比较两种方法所得结果。
2 结果 2.1 EMA-qPCR条件优化结果 2.1.1 EMA浓度的确定结果表明当EMA浓度大于3 μg·mL-1时，能够有效抑制5.5×108CFU·mL-1的细菌DNA扩增；当EMA浓度小于4 μg·mL-1时对活菌DNA扩增没有影响，当EMA浓度大于4 μg·mL-1时对活菌的DNA扩增产生一定的抑制作用。因此适宜的EMA浓度范围为3~4 μg·mL-1，本试验采用3 μg·mL-1。
2.1.2 曝光时间的确定乳酸菌浓度为1.2×109CFU·mL-1的菌液，经EMA处理曝光后进行q-PCR，结果表明，曝光8~10 min可有效抑制死菌扩增。本试验采取曝光10 min。
2.2 标准曲线的建立平板计数乳酸菌含量为6.33×108CFU·mL-1，用配制的活菌/死菌混合液，经EMA处理，进行q-PCR。以活菌数的对数值为横坐标，Ct值为纵坐标构建标准曲线。标准曲线呈良好线性关系(图 1)。
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图 1 Ct值与活菌浓度对数值的标准曲线 Fig. 1 Standard curve between the Ct value and the logarithm of the number of viable bacteria |
分别用EMA-qPCR、q-PCR和平板计数法测定不同浓度乳酸菌液中乳酸菌含量，结果(表 2)表明，根据EMA处理后的样品Ct值计算出的乳酸菌数量与平板计数所得的乳酸菌含量更接近，故EMA-qPCR能更为准确地反映样品中乳酸菌含量。
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表 2 平板计数、EMA-qPCR、q-PCR检测乳酸菌含量 Table 2 Detection of the content of lactic acid bacteria by using plate count, EMA-qPCR and q-PCR |
用EMA-qPCR和平板计数对8份发酵饲料样品进行乳酸菌含量检测。检测结果(表 3)表明通过EMA-qPCR计算所得结果与平板计数结果高度吻合，其中2号饲料样品的平板计数结果为1.03×109 CFU·g-1，通过EMA-qPCR检测结果为1.02×109 CFU·g-1。
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表 3 平板计数、EMA-qPCR检测乳酸菌的含量 Table 3 Detecton of the content of lactic acid bacteria by using plate count and EMA-qPCR method |
发酵饲料与传统饲料最大不同之处在于在发酵过程中产生了大量益生菌，这些益生菌及其代谢产物在改善饲料品质，调节畜禽肠道微生态平衡中起着关键作用[12-13]。在发酵饲料的品质评定中，除了借鉴传统饲料的评定方法之外还应考虑到益生菌这一关键因素。现在检测发酵饲料中活的益生菌含量的标准方法是平板计数法。平板计数的准确性毋庸置疑，但是如果利用平板计数法对多个样品进行检测非常耗时耗力。为了能够快速准确的检测发酵饲料中活的益生菌含量，本实验组尝试构建一种新的检测方法EMA-qPCR。EMA与PCR相结合鉴别活菌和死菌在食品安全检测方面应用较多，但在发酵饲料乳酸菌含量检测领域尚未有应用的先例[14-18]。本试验证明在EMA浓度3~4 μg·mL-1，曝光8~15 min可有效抑制死菌扩增。在确定好EMA作用条件后，结合q-PCR建立了乳酸菌对数值与Ct值之间的标准曲线，线性关系良好。在试验条件下对混合乳酸菌液进行EMA-qPCR检测，检测结果与平板计数结果相符合。通过对8份发酵饲料进行检测，结果与平板计数符合度较高，处于同一数量级。这表明利用EMA-qPCR检测发酵饲料中活的益生菌含量是可行的。与传统的平板计数法相比较，EMA-qPCR能将检测时间从近30 h缩减至5 h，而且能够同时对多个样品进行检测，在生产中应用可以极大地减少工作量，提高检测效率。
4 结论将EMA与q-PCR技术相结合建立EMA-qPCR方法，可用于快速准确地检测发酵饲料中活乳酸菌的含量。
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