金黄色葡萄球菌能够产生许多细胞外毒素，主要有α-溶血素、PV-杀白细胞素和肠毒素等，研究发现这些细胞外毒素与被感染细胞的凋亡有着密切的关系[1]。Vrieling等[2]发现LukMF′是金黄色葡萄球菌在奶牛乳腺炎体内主要分泌的杀白细胞素，Fromageau等[3]进一步研究发现体外纯化的LukMF′对奶牛中性粒细胞和巨噬细胞有细胞毒性，但对奶牛乳腺上皮细胞没有明显的毒性作用。PV-杀白细胞素(PVL)是金黄色葡萄球菌分泌的一种双组分成孔毒素，由LukS-PV和LukF-PV蛋白组成。近年来，PVL编码基因pvl在奶牛乳腺炎中检出率不断升高，2015年王晓和俞英[4]在中国北方奶牛金黄色葡萄球菌乳腺炎感染现状的研究中发现pvl检出率高达70.2%，2018年Wang(王伟)等[5]对北京地区奶牛生鲜乳检测发现pvl检出率更是高达93.8%，这提示PVL在奶牛乳腺炎发生过程中起着重要的作用。此外，pvl基因还被报道与金黄色葡萄球菌耐药性有关，并且由于PVL能够杀死巨噬细胞和白细胞，使得奶牛乳汁中体细胞数检测低于20万·mL-1，导致约40%的金黄色葡萄球菌性乳腺炎不易检出[4]。在奶牛乳腺炎的发病过程中，乳腺上皮细胞是病原菌感染乳腺时的第一道防线，是病原菌穿过乳头末端的机械屏障后最先黏附和侵袭的细胞，并且已经证明其在对病原微生物感染的先天性和特异性免疫防御中起重要作用[6]。Seol等[7]的研究发现α-溶血素作用奶牛乳腺上皮细胞后能够通过导致细胞发生DNA片段化、活性氧(ROS)产生和线粒体跨膜电位的改变来诱导细胞损伤，Liu等[8]的研究也发现体外重组的肠毒素H(rSEH)能够直接诱导奶牛乳腺上皮细胞凋亡，但是关于PVL作用于奶牛乳腺上皮细胞的研究目前还没有报道。通过研究原核表达纯化的体外重组PVL、产PVL金黄色葡萄球菌ATCC49775、pvl缺陷株△pvl 49775和相应的回补株C-△pvl 49775对奶牛乳腺上皮细胞的损伤作用，明确PVL在金黄色葡萄球菌对奶牛乳腺上皮细胞损伤过程中的作用，能够为系统研究金黄色葡萄球菌感染奶牛乳腺上皮细胞的机制提供依据。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株、质粒和细胞产PVL金黄色葡萄球菌(ATCC49775)购自美国ATCC菌种保藏中心；pvl缺陷株△pvl 49775和相应的回补株C-△pvl 49775由哈尔滨兽医研究所张万江研究员课题组惠赠。大肠杆菌表达宿主菌BL21和表达载体pET28a均购自TaKaRa公司。奶牛乳腺上皮细胞系MAC-T由山东农业大学惠赠。
1.1.2 实验试剂细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302)、DNA纯化回收试剂盒(DP214)、质粒小提试剂盒(DP103)均购自天根生物公司；5×蛋白电泳缓冲液、Kanamycin(ST102)、超敏ECL化学发光试剂盒(P0018S)购自碧云天生物公司；DNA Marker(SM0331)、蛋白质Marker(26616)均购自Thermo公司；dNTP Mixture、T4 DNA连接酶、限制性内切酶NdeⅠ、XhoⅠ、鼠源抗His抗体、HRP标记山羊抗小鼠IgG抗体均购自TaKaRa公司；蛋白纯化试剂盒His·Band Purification Kit购自Novagen公司；PVDF膜购自美国Millipore公司；胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)购自青岛海博生物公司；DMEM-F12和胎牛血清(FBS)购自美国Gibico公司；BCA蛋白含量检测试剂盒、Live/Dead细胞检测试剂盒、Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒，购自南京凯基生物公司。
1.2 方法 1.2.1 LukS-PV和LukF-PV基因的克隆与原核表达载体的构建按照天根细菌基因组DNA提取试剂盒说明书的步骤提取PVL阳性金黄色葡萄球菌ATCC49775基因组DNA，PCR扩增反应引物见表 1，下划线标出的CATATG为NdeⅠ酶切位点，CTCGAG为XhoⅠ酶切位点。引物设计分析后，由上海生工生物工程公司合成。反应条件：95 ℃ 5 min，5 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 10 min，30个循环，用1%琼脂糖凝胶电泳检测反应产物。目的基因分别与酶切载体pET28a放置在4 ℃过夜连接后转化大肠杆菌BL21，用卡那霉素筛选阳性菌落，扩增后抽提质粒进行双酶切鉴定和基因测序。
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表 1 PCR扩增反应引物 Table 1 The primers for PCR |
将经过鉴定的阳性菌37 ℃活化后分别挑取单菌落接种于含30 μg·mL-1卡那霉素的LB培养液中，37 ℃培养至OD值达到0.6时，加入IPTG至终浓度0.5 mmol·L-1，分别20 ℃诱导过夜、37 ℃诱导4 h，未加IPTG诱导剂的为阴性对照，离心收集菌体后用PBS缓冲液重新悬浮，超声破碎后离心收集上清和沉淀，沉淀用500 μL包涵体溶解液溶解，分别取40 μL样品和10 μL 5×Protein loading buffer混匀，沸水浴10 min后进行SDS-PAGE检测。
1.2.3 目的蛋白的诱导表达及纯化将菌液按1:100比例接种于4 L含30 μg·mL-1卡那霉素的LB培养液中，37 ℃培养至OD值达到0.6时，添加终浓度为0.5 mmol·L-1 IPTG，20 ℃诱导过夜，离心收集细菌菌体。将收集的细菌菌体用破碎Buffer(1×PBS，0.2% Triton X-114，0.2 mmol·L-1 PMSF，pH7.4)溶解，冰浴中超声破碎菌体，离心收集上清(12 000 r·min-1，4 ℃，20 min)并按照His·Band Purification Kit试剂盒操作说明纯化表达产物，并进行SDS-PAGE检测。
1.2.4 纯化蛋白的Western blot鉴定及定量分析将表达纯化后的LukS-PV和LukF-PV重组蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳后270 mA、110 min湿转至PVDF膜，置于封闭液37 ℃缓慢振荡2 h封闭，以鼠源抗His单克隆抗体为一抗(1:500稀释)，37 ℃缓慢振荡1 h，HRP标记山羊抗小鼠IgG抗体为二抗(1:8 000稀释)，37 ℃缓慢振荡1 h，之后进行ECL化学发光检测。Western blot鉴定完成后用BCA法确定重组蛋白的浓度，具体操作按照BCA蛋白含量检测试剂盒说明书进行。
1.2.5 金黄色葡萄球菌和rPVL对奶牛乳腺上皮细胞增殖的影响将金黄色葡萄球菌ATCC49775、pvl缺陷株△pvl 49775和相应的回补株C-△pvl 49775接种于胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)，37 ℃恒温摇床培养至对数中期，紫外分光光度计测定金黄色葡萄球菌浓度，无菌PBS清洗后用DMEM/F12将菌体重悬并调整浓度为1.0×107CFU·mL-1。用0.25%胰酶消化并收集细胞之后用无双抗完全培养液按1.0×105·孔-1接种于12孔板，培养24 h后加入制备好的菌悬液(MOI=100)和含有rPVL的DMEM/F12培养液，37 ℃培养3 h后按照试剂盒说明书进行染色并使用荧光显微镜观察并拍照。
1.2.6 金黄色葡萄球菌和rPVL对奶牛乳腺上皮细胞凋亡的影响同上制备菌悬液，细胞按5.0×105·孔-1接种于6孔板，培养24 h后加入制备好的菌悬液(MOI=100)37 ℃培养6 h，加入含有rPVL(100 ng·mL-1)的DMEM/F12培养液培养3 h。用0.25%胰酶消化感染了金黄色葡萄球菌和rPVL的奶牛乳腺上皮细胞，之后按照试剂盒说明书进行并用流式细胞仪检测。
1.2.7 统计学分析使用SPSS22.0软件对试验数据进行方差分析，P＜0.05时差异有统计学意义，P＜0.01时差异极显著。
2 结果 2.1 LukS-PV和LukF-PV基因的克隆与原核表达载体的构建根据设计的LukS-PV和LukF-PV基因的引物对产PVL金黄色葡萄球菌进行PCR扩增获得预期大小的片段，结果如图 1A、B所示。重组的pET28a-LukS-PV和pET28a-LukF-PV质粒分别经NdeⅠ、XhoⅠ双酶切后，凝胶电泳显示出两条条带，其中较小的条带与目标基因大小相符，结果如图 1C、D所示。表明LukF-PV和LukS-PV基因已成功连接到pET28a表达载体。构建的LukS-PV-pET28a和LukF-PV-pET28a表达载体经序列全自动分析测序，所得序列与GenBank收录的LukS-PV和LukF-PV序列高度同源。
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A、B. LukS-PV和LukF-PV基因PCR产物电泳；C、D.重组表达载体pET28a-LukS-PV和pET28a-LukF-PV的双酶切产物电泳图。M.DNA相对分子质量标准；1.LukS-PV基因PCR产物；2.LukF-PV基因PCR产物；3.pET28a-LukS-PV的Nde Ⅰ、XhoⅠ双酶切；4.pET28a-LukF-PV的NdeⅠ、XhoⅠ双酶切 A, B. Electrophoresis of PCR products of LukS-PV and LukF-PV; C, D. Electrophoresis of recombinant expression vector pET28a-LukS-PV and pET28a-LukF-PV digested by double enzymes.M.DNA marker; 1.PCR product of LukS-PV; 2.PCR product of LukF-PV; 3.pET28a-LukS-PV digested by NdeⅠ and XhoⅠ; 4.pET28a-LukF-PV digested by NdeⅠ and Xho Ⅰ 图 1 LukS-PV、LukF-PV基因克隆与原核表达载体构建的鉴定 Fig. 1 Clone of LukS-PV, LukF-PV clone and construction of recombinant expression vector |
诱导表达条件选择20 ℃诱导过夜，结果如图 2A所示。SDS-PAGE电泳检测发现上清和沉淀均可见清晰的表达性条带，表明其为部分可溶性表达。将含有重组质粒的细菌经IPTG过夜诱导表达后进行SDS-PAGE电泳，分别在35和36 ku处出现与预期相符的表达条带，结果如图 2B、C所示。将SDS-PAGE凝胶放置在凝胶成像系统中进行灰度扫描分析，结果显示纯度均在97%以上。
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A. pET28a-LukS-PV表达产物SDS-PAGE分析图(M.蛋白质相对分子质量标准；1.诱导前总蛋白；2. 20 ℃上清；3. 20 ℃沉淀；4. 37 ℃上清；5. 37 ℃沉淀)；B、C. pET28a-LukS-PV和pET28a-LukF-PV表达产物SDS-PAGE分析图(M.蛋白质相对分子质量标准；1.纯化后的LukS-PV蛋白；2.纯化后的LukF-PV蛋白) A. Confirmation of pET28a-LukS-PV expression with SDS-PAGE (M. Protein marker; 1. Total protein before induction; 2. 20 ℃'s supernatant; 3. 20 ℃'s precipitation; 4. 37 ℃'s supernatant; 5. 37 ℃'s precipitation); B, C. SDS-PAGE analysis of pET28a-LukS-PV and pET28a-LukF-PV expression (M.Protein marker; 1.Purified LukS-PV protein; 2.Purified LukF-PV protein) 图 2 目的蛋白的诱导表达与纯化蛋白的SDS-PAGE检测 Fig. 2 Confirmation of pET28a-LukS-PV and pET28a-LukF-PV expression with SDS-PAGE |
用鼠源抗His抗体分别对重组的LukF-PV和LukS-PV蛋白进行Western blot检测，结果如图 3所示，在预期位置有特异性条带。BCA蛋白定量检测到LukS-PV浓度为0.6 mg·mL-1，LukF-PV浓度为1.15 mg·mL-1。通过将LukF-PV和LukS-PV蛋白等比例混匀制备成金黄色葡萄球菌rPVL。
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M.蛋白质相对分子质量标准；1.纯化后的LukS-PV蛋白；2.纯化后的LukF-PV蛋白 M. Protein marker; 1. Purified LukS-PV protein; 2. Purified LukF-PV protein 图 3 pET28a-LukS-PV (A)和pET28a-LukF-PV (B)表达产物Western blot鉴定 Fig. 3 Western blot identification of pET28a-LukS-PV (A) and pET28a-LukF-PV (B) expression |
通过Live/Dead细胞荧光染色检测金黄色葡萄球菌和rPVL对奶牛乳腺上皮细胞增殖的影响，用倒置荧光显微镜观察细胞时活细胞在激发光下呈现绿色，死细胞呈现红色，结果如图 4所示。通过观察发现金黄色葡萄球菌ATCC49775、△pvl 49775和C-△pvl 49775作用于奶牛乳腺上皮细胞3 h后均表现出毒性作用，rPVL作用于奶牛乳腺上皮细胞3 h后表现出明显的毒性作用，并且随着作用时间的延长毒性作用增强。
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图 4 金黄色葡萄球菌和rPVL对奶牛乳腺上皮细胞的毒性作用 Fig. 4 The toxicity of S.aureus and rPVL to bovine mammary epithelial cells |
通过Annexin V/PI双染法检测金黄色葡萄球菌对奶牛乳腺上皮细胞的影响，结果见图 5。金黄色葡萄球菌ATCC49775、△pvl 49775和C-△pvl 49775作用6 h时均能诱导奶牛乳腺上皮细胞明显凋亡和坏死，与空白对照组相比差异极显著(P < 0.01)。同时发现pvl阳性菌株ATCC49775和C-△pvl 49775诱导的奶牛乳腺上皮细胞凋亡率和坏死率明显高于△pvl 49775，结果差异显著(P＜0.05)，说明PVL的分泌可以增强金黄色葡萄球菌的毒力。
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与△pvl49775组相比.*.0.01 < P < 0.05，**.P < 0.01；与空白组相比, #.P < 0.01 Compared with △pvl49775 group, *. 0.01 < P < 0.05, **. P < 0.01; Compared with control group, #. P < 0.01 图 5 金黄色葡萄球菌对奶牛乳腺上皮细胞的影响 Fig. 5 Effect of S.aureus on bovine mammary epithelial cells |
rPVL诱导奶牛乳腺上皮细胞的凋亡结果如图 6所示。rPVL在作用时间内主要诱导奶牛乳腺上皮细胞的凋亡，与空白对照组相比差异极显著(P < 0.01)。rPVL在作用5 min时即可诱导奶牛乳腺上皮细胞发生凋亡，并且随着作用时间的延长细胞凋亡率升高。
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与对照组相比，*.0.01 < P < 0.05，**.P < 0.01 Compared with control group, *.0.01 < P < 0.05, **.P < 0.01 图 6 rPVL(100 ng·mL-1)对奶牛乳腺上皮细胞的影响 Fig. 6 Effect of rPVL (100 ng·mL-1) on bovine mammary epithelial cells |
金黄色葡萄球菌是一种能够引起严重感染的病原菌，其致病性与其能够分泌多种毒素及侵袭性酶有很大关系，PVL是金黄色葡萄球菌产生的主要外毒素之一，其优先靶向白细胞。研究证实，LukS-PV组分首先与宿主细胞膜上特异性高、亲和力强的受体结合，LukF-PV再与之结合形成二聚体，然后LukS-PV和LukF-PV两种组分依次结合在细胞膜上，最终组合成一环状结构的八聚体并在宿主细胞膜上形成孔道，进而损伤细胞[9]。前期研究表明，PVL能引起嗜中性粒细胞、巨噬细胞等免疫细胞和具有免疫功能的角质形成细胞损伤，并导致坏死性肺炎、严重的皮肤和软组织感染等疾病[10-13]。近年来，pvl基因在奶牛乳腺炎和生鲜乳中检出率不断升高，说明其编码的PVL在奶牛乳腺炎发生过程中扮演重要的角色。1960年Woodin[14]首次对PVL进行纯化，并证明了有活性的杀白细胞素是由两个独立的蛋白质成分组成，分别称为“S”或LukS-PV，“F”或LukF-PV，双组分杀白细胞素仅在S和F亚基组合时才具有细胞毒性，在此之前的大多数研究使用的是金黄色葡萄球菌培养上清液[14-15]。此前，常文娇等[16]体外重组了PVL并作用人多形核粒细胞，用6 nmol·L-1的rPVL作用细胞8 h后出现典型细胞凋亡形态，由于目前还没有商品化的PVL，作者参考常文娇等的方法在实验室进行PVL原核表达，在诱导表达时选择从对数期开始20 ℃过夜诱导使得重组蛋白主要存在于上清液中，保证其生物学活性。Genestier等[17]也成功重组了PVL并作用人嗜中性粒细胞，发现用5 nmol·L-1的rPVL处理细胞6 h后即出现典型的细胞凋亡特征，用200 nmol·L-1的rPVL处理细胞1 h即可引起细胞坏死，并证明PVL引起嗜中性粒细胞凋亡的主要途径是线粒体途径。
乳腺上皮细胞是病原菌进入机体内部之前最先接触的细胞，当病原菌入侵时，奶牛乳腺上皮细胞上的TLRs等模式识别受体可识别病原体相关分子模式，调节一系列炎性因子的分泌，主动参与免疫应答[18]。为了研究PVL在金黄色葡萄球菌感染奶牛乳腺上皮细胞过程中的作用，作者进行了本研究。试验结果显示，体外重组的rPVL使用浓度100 ng·mL-1作用30 min~3 h均能够对奶牛乳腺上皮细胞产生明显的细胞毒性作用(P＜0.01)。金黄色葡萄球菌ATCC49775、pvl缺陷株△pvl 49775和相应的回补株C-△pvl 49775作用6 h时均能诱导奶牛乳腺上皮细胞明显凋亡和坏死，并且ATCC49775和C-△pvl 49775诱导的奶牛乳腺上皮细胞凋亡率和坏死率明显高于△pvl 49775(P＜0.05)，说明PVL的分泌增强了金黄色葡萄球菌的毒力。
PVL在金黄色葡萄球菌毒力中的作用一直存在争议，这是由PVL的靶细胞和物种特异性决定的。研究表明PVL对人和兔的嗜中性粒细胞具有强烈和快速的细胞毒性，而对鼠和猴的免疫细胞没有作用[19]。近几年PVL的特异性受体相继被发现，Spaan等[20]证明C5aR是LukS-PV的受体，Tromp等[21]证明人CD45分子是LukF-PV的特异性受体，这些发现解释了PVL在免疫细胞中的物种特异性。关于PVL对非专职免疫细胞作用的研究也有报道，Chi等[13]通过研究pvl阳性菌株与其同源Δpvl缺陷株发现PVL能有效地破坏内体，促进金黄色葡萄球菌逃逸到细胞质中并在细胞内复制，通过胱天蛋白酶依赖性途径诱导人角质形成细胞凋亡。作者的研究发现，体外重组的rPVL对奶牛乳腺上皮细胞有明显的细胞毒性，并且pvl阳性金黄色葡萄球菌在感染奶牛乳腺上皮细胞时表现出更强的毒力，关于其损伤奶牛乳腺上皮细胞的具体机制有待进一步研究。
4 结论原核表达的rPVL对奶牛乳腺上皮细胞表现出较强的毒性；pvl缺陷株△pvl 49775诱导奶牛乳腺上皮细胞凋亡和坏死的能力比pvl阳性菌株ATCC49775和C-△pvl 49775低，说明PVL在金黄色葡萄球菌感染奶牛乳腺上皮细胞过程中有重要作用。
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