伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)又称为Aujeszky’s disease virus (ADV),是猪伪狂犬病(porcine pseudorabies, PR)的病原,其可引起妊娠母猪流产,产死胎和木乃伊胎,公猪精液品质下降;新生仔猪神经症状、腹泻和高死亡率;生长育肥猪呼吸道症状[1-2]。该病毒能够在猪的神经节内长期潜伏存在,呈隐性感染状态,而在猪群内长期循环传播,给猪场造成严重经济损失[2]。因此,很多国家的猪场采取了PRV净化策略,目前欧洲的多数国家及加拿大、美国和新西兰等国已经根除了该病毒[3-6]。然而世界上养猪地区仍然有PRV不断暴发和流行[7-8]。我国于20世纪50年代首次报道猪群发生PR,随后在国内广泛传播和流行。20世纪70年代开始应用Bartha-K61弱毒疫苗和灭活疫苗免疫防控PR,使该病得到了有效控制[9]。但是2011年,一些猪场(包括Bartha-K61免疫的猪场)暴发了伪狂犬病,并迅速传播,导致新生仔猪大批死亡[9-11]。病原学检测与遗传进化分析表明,PRV变异是导致免疫猪场PRV流行的原因[12-15]。
PRV属于疱疹病毒科、α-疱疹病毒亚科成员,基因组为线状双股DNA,长约150 kb,包含70多种不同基因,编码70多种功能蛋白,参与病毒的核衣壳、内膜和囊膜的形成[2]。在这些功能蛋白中糖蛋白gB和gC是病毒囊膜的重要组成蛋白,在病毒粒子与宿主细胞受体结合和侵染到细胞内的过程中发挥重要作用,并且是诱导细胞和体液免疫应答反应的主要抗原成分[14, 16-17]。胸腺激酶(thymidine kinase, TK)和糖蛋白gE是病毒的主要毒力因子,也是基因缺失弱毒疫苗研究的靶蛋白[18-19]。gB、gC、gE或TK等基因常用于PRV的感染免疫研究、分子流行病学调查与系统进化分析[13, 15, 20]。
本研究从河北某PRV Bartha-K61疫苗免疫猪场的发病仔猪脑组织中分离鉴定了一株PRV,检测了Bartha-K61株和PRV变异株抗血清分别对分离株的中和作用,基于gB、gC和TK基因和氨基酸序列分析遗传变异,比较分离株与Bartha株的gB和gC的潜在抗原表位的异同,旨在明确该猪场发生疫情的原因,为有效防控PRV提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 主要试剂2×Es Taq Master Mix (Dye)和100 bp DNA Ladder,购自北京康为试剂有限公司;病毒基因组提取试剂盒与离心柱型DNA凝胶纯化回收试剂盒,购自天根生化科技(北京)有限公司;pMD18-T载体,为TaKaRa公司产品;猪伪狂犬病病毒PCR检测试剂盒,为深圳真瑞生物科技有限公司产品;抗PRV Bartha-K61株猪阳性血清和阴性血清,为河北农业大学动物传染病实验室用SPF猪制备与保存;抗PRV变异株HB1201(GenBank ID: KU057086)猪阳性血清为农业部动物流行病学与人畜共患病重点实验室惠赠;HRP-山羊抗猪IgG(H+L),购自北京索莱宝生物科技有限公司。
1.2 细胞、培养基及实验动物PK-15细胞由河北农业大学动物传染病实验室保存。RPMI Medium 1640细胞培养液、胰酶等均为Gibco公司产品;特级新生牛血清,为兰州民海生物工程有限公司产品。2~4 kg的健康新西兰家兔,购自保定某种兔场。
1.3 病例与样品采集河北省某种猪场的母猪一年免疫3次PRV Bartha-K61弱毒疫苗,初生仔猪1 d喷鼻免疫,断奶后进行第二次免疫。2018年3月,该猪场的2周龄仔猪出现站立不稳、共济失调、震颤、不时蹭围栏等神经症状,注射红霉素、头孢菌素、氧氟沙星等无明显治疗效果,发病后2~3 d死亡。剖检可见脑膜充血、水肿,心包积液,间质性肺炎和出血,肝出血,肾点状出血。根据临床症状,初步诊断此次疫情为猪伪狂犬病。采取发病猪的脑、肝、肺、脾等组织,进行细菌学检测。同时取组织匀浆,反复冻融3次后,8 000 r·min-1离心10 min,收集上清液,直接用于PCR检测和PRV的分离鉴定。
1.4 细菌的涂片镜检与分离培养取病猪的肝、脾和脑等组织涂片,革兰染色,显微镜下检查细菌。同时将组织无菌划线接种到含5%血清的营养琼脂上,于37 ℃培养24 h,观察细菌的生长情况。
1.5 PCR检测取收集的上清液,提取DNA。按照产品说明,应用PRV PCR检测试剂盒检测病毒gB基因片段。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳,检测扩增的目的条带。
1.6 病毒分离培养处理的组织上清液经0.45 μm滤器过滤除菌,加入青、链霉素(1 000 U·mL-1)作用过夜后,接种到PK-15细胞,置37 ℃ 5% CO2细胞培养箱中吸附1 h;加入含3%新生牛血清的PRMI 1640维持液。逐日观察并记录细胞病变(cytopathic effect,CPE),待细胞70%以上脱落死亡时收获病毒。连续传代培养,直至细胞出现CPE的时间稳定,按照Reed-Muench方法测定病毒TCID50。分离的病毒命名为PRV HBXT-2018株。
1.7 病毒的鉴定 1.7.1 PCR应用病毒基因组DNA提取试剂盒提取病毒DNA,通过PCR扩增PRV gE基因。PCR用引物如下,PRV-gE-U:5′-ACGGCGACCTCGACGGCGAAC-3′,PRV-gE-L:5′-CCCGAG- GCGTCGTGCAGCGT-3′,扩增片段长度为418 bp。扩增体系为20 μL,包括2×Es Taq Master Mix 10 μL、上/下游引物各0.5 μL、DNA模板2 μL、灭菌双蒸水7 μL。扩增条件:94 ℃预变性4 min;94 ℃变性45 s,68 ℃退火45 s,72 ℃延伸45 s,共32个循环;72 ℃延伸10 min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后,纯化回收目的片段,与pMD18-T载体连接后送往北京六合华大基因科技有限公司,进行序列测定与分析。
1.7.2 免疫过氧化酶单层试验将PK-15细胞接种到96孔细胞培养板内,待生长为单层后,接种0.001 MOI的待检病毒,于37 ℃ 5% CO2条件下培养36~48 h,进行免疫过氧化酶单层试验(immunoperoxidase monolayer assay, IPMA)[21]。IPMA的主要步骤:弃去细胞维持液,PBS洗涤和固定细胞;每孔加入50 μL猪抗PRV阳性血清(1:100倍),37 ℃温育1 h,洗涤;加入50 μL山羊抗猪IgG-HRP(1:100倍),37 ℃温育45 min,洗涤;加入DAB溶液,室温显色,显微镜下观察结果。同时设立阴性血清对照。当细胞质内出现棕色或棕褐色着色判为阳性,无色者判为阴性。
1.8 动物试验将7只体重2~3 kg的健康家兔分为HBXT-2018感染组(n=4)和非感染阴性对照组(n=3)。感染组:每只家兔于右后侧背部皮下分别接种105TCID50的PRV HBXT-2018分离株(F6),阴性对照组:每只接种等体积的细胞维持液。两组家兔严格隔离饲养。感染后每天观察、记录发病和死亡情况。无菌采集发病死亡兔的脑、肺、肝、肾、脾等组织器官,PCR检测PRV gE基因。
1.9 血清中和试验取经灭活的猪抗PRV Bartha-K61和变异株血清分别作1:8 ~ 1:256倍比稀释后,与等体积的PRV HBXT-2018分离株(104.33 TCID50)混合,置37 ℃孵育1 h。然后将血清-病毒混合液接种到96孔细胞培养板内的单层PK-15细胞上,每个血清稀释度重复8孔,同时设立病毒感染阳性对照、未进行病毒中和的血清对照和非感染阴性对照。细胞于37 ℃ 5% CO2条件下培养24 h,观察并记录无CPE数目,按照Reed-Muench方法计算不同毒株抗血清的中和效价。
1.10 病毒基因序列测定与系统进化分析提取病毒基因组DNA,经琼脂糖凝胶电泳检测和核酸浓度测定后,通过鸟枪法(shotgun)进行高通量测序,然后应用NCBI信息数据库和RAST工具分析获得的基因序列,并进行功能注释。比对分离毒株gB、gC和TK基因及其推导氨基酸序列与参考毒株(表 1)的相似性,在线(http://imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.html)预测HBXT-2018株和Bartha株gB、gC的抗原肽,分析HBXT-2018株抗原肽的变化。应用软件MEGA 7.0和Clustal W算法,用Neighbor-Joining方法绘制系统进化树。
从发病仔猪的脑、肝、肺、脾等组织内没有检测和分离到细菌。通过PCR从脑内检测到了预期大小(242 bp)的PRV核酸片段(图略)。
2.2 病毒分离培养与鉴定病猪的脑组织匀浆接种到PK-15细胞后培养24 h,细胞出现变圆、聚集、脱落等典型的CPE,感染后48 h 50%~70%以上的细胞脱落。病毒从第3代后CPE出现时间稳定,病毒滴度为106.33TCID50·0.1 mL-1。应用PCR可以从分离的病毒中扩增到预期大小(418 bp)PRV gE基因片段(图 1),该片段(GenBank ID: MK820643)与2011年以来国内流行的毒株相似性100%。分离的病毒(F7代)能够与猪抗PRV血清特异结合,在感染细胞的细胞质内形成棕色沉淀(图 2)。
家兔感染PRV HBXT-2018株后24 h出现兴奋,频频回头啃咬右后侧注射部位皮肤,直至咬掉皮毛、破损、出血。4只家兔于感染后44~68 h抽搐、死亡(图略)。剖检可见败血症变化,肺充血、出血,肝充血、出血,脾充血肿胀、边缘钝圆,肾出血。脑膜水肿、血管内充血(图略)。阴性对照组的家兔未见异常表现。病毒感染兔肺中的病毒核酸检出率最高(4/4),其次为脾(3/4)、脑(1/4)和肾(1/4)。在阴性对照组家兔的组织中未检测到PRV核酸。
2.4 抗Bartha-K61株阳性血清对HBXT-2018株的中和活性低将猪抗PRV Bartha-K61株和变异株的阳性血清与HBXT-2018株孵育后接种到PK-15细胞上,不同稀释倍数的抗Bartha-61株血清对分离株无中和作用,细胞孔出现典型的CPE。而1:8和1:16倍稀释的抗变异株血清能够完全中和病毒的CPE(0/8);1:32和1:64倍稀释时分别有1孔和4孔出现CPE,1:128倍稀释后不能阻止CPE出现。按照Reed-Muench方法计算,抗Bartha-K61株阳性血清的中和抗体效价<1:8,抗变异株阳性血清的中和抗体效价为1:58.9。
2.5 gB、gC和TK基因序列分析病毒基因组经高通量测序后,获得约71%PRV基因组的序列。与国内外参考毒株对比,HBXT-2018株的gB、gC和TK基因序列与国内2011年后流行毒株的相似性分别为99.93%~100%、99.73%~100%和100%;与2011年之前的国内流行毒株的相似性分别为99.71%~99.82%、98.89%~99.66%和99.69%~100%;与日本毒株RC1的相似性分别为99.5%、99.2%和100%;与欧美毒株的相似性分别为97.93%~98.36%、93.44%~94.81%和98.77%~99.58%。可见,HBXT-2018株与国内和日本流行毒株的相似性高于与欧美毒株的相似性。
HBXT-2018株及其他国内流行株与欧美毒株之间比较,TK基因保守,而gB和gC基因多处发生单个或连续几个碱基置换、插入和缺失突变。与Bartha株比较,HBXT-2018株及其他国内流行株的gB基因在224~232 bp发生9个碱基的缺失,279~281 bp发生3 bp的碱基插入,相应的氨基酸序列的第75~77位连续缺失3个氨基酸(75SPG77),第94位插入1个氨基酸(G)。gC基因在186~206 bp连续缺失21 bp,氨基酸序列在第63~69位,连续插入7个氨基酸(63AAASTPA69)。对gB和gC氨基酸序列的抗原表位预测发现,HBXT-2018株与Bartha株的gB分别有37和39个表位,gC分别有17和16个表位。位置相似的表位氨基酸残基也不完全一致(表 2)。
基于gB、gC、TK基因绘制的系统进化树显示,HBXT-2018株与国内分离株、日本分离株的遗传关系近,处于同一分支,而与Bartha疫苗株及其他欧美分离株的亲缘关系较远,属于不同分支(图 3)。在国内分离株内,HBXT-2018株与绝大多数2011年后国内流行株集中在同一亚分支上,与2011年之前的分离株,如Ea (Hubei, 1993)、LA(1997),以及与2011年后的Fa(2012)分布在不同的亚分支上(图 3a、3b)。此外,HBXT-2018株与国内更早的分离株SC株(1986)处于不同的大分支上,SC株与欧美分离株分布在一个大分支上(图 3b、3c)。上述结果表明,HBXT-2018株与2011年后国内流行的PRV毒株的亲缘关系最近,为PRV变异株。
目前尚无有效治疗伪狂犬病的药物,免疫接种是很多国家预防和控制该病的有效措施,通过接种gE基因缺失弱毒疫苗Bartha-K61和血清学监测,PR在很多国家得到了有效控制或已被消灭[3-6]。2011年以来,由于PRV毒株的变异,导致国内许多免疫猪场暴发了PR,给养猪场造成了巨大经济损失[9-11, 22]。与Bartha-K61疫苗株对比,当前PRV流行毒株的基因和氨基酸序列发生了多处碱基与氨基酸的置换、缺失或插入突变,并通过动物试验证明gB的突变可能是导致Bartha-K61疫苗对新发PRV变异株不能提供完全保护的重要原因之一[12, 14]。本研究首先从疑似患伪狂犬病仔猪的脑组织内检测到了PRV gE基因片段,表明患病仔猪感染的PRV为致病性野毒株,进而从脑组织中分离到PRV HBXT-2018株。该毒株能够使家兔在感染后24 h内出现兴奋、瘙痒和啃咬等典型的神经症状,并在68 h内致实验感染家兔全部死亡,说明分离到的毒株为强毒株。鉴于gB和gC在PRV侵染宿主细胞、诱导免疫应答以及TK在病毒致病中的重要作用[16-18],本研究基于此三个蛋白的基因与氨基酸序列分析发现,HBXT-2018株与当前国内流行的其他PRV变异株gB、gC和TK基因序列的相似性可高达100%,处于同一遗传进化分支内。而与Bartha及其他欧美毒株的相似性较低,处于不同分支。与已有的文献报道类似[11, 15],在HBXT-2018株与国内外的不同分离株之间,TK保守性高,而gB和gC基因序列内发生多处碱基置换、连续插入或缺失突变。
抗原变异和毒力增强是导致原有疫苗对感染变异毒株的宿主不能提供完全保护的重要原因。自从20世纪90年代国内猪场广泛应用Bartha-K61疫苗以来,直到2011年PRV变异株出现,PR得到了稳定控制。据报道,Bartha-K61疫苗对国内20世纪80年代流行毒株SC攻击的猪可以提供100%的保护,但对近年流行的PRV变异株HeN1的攻击仅仅能提供50%的保护[9]。本研究中,通过血清中和试验证明,抗Bartha-K61株猪阳性血清对分离株HBXT-2018的中和活性非常低,而抗变异株的阳性血清能够很好地中和病毒的CPE,具有较高的中和活性。该结果也提示Bartha-K61株对该猪场流行的毒株不能提供理想的交叉保护。Yu等[14]将Bartha-K61株与敲除gE/gI基因的变异株JS-2012(JS-2012-ΔgE/gI)的gB基因互换后,发现交换gB后的Bartha-K61对变异株JS-2012攻击的免疫保护力上升。因此gB在PRV诱导的免疫保护中发挥着重要作用,其突变可能在近年免疫猪场PRV暴发流行中承担着重要角色。本研究中,通过与Bartha-K61疫苗株比对,发现HBXT-2018株gB和gC的氨基酸序列均发生多处突变,致使分离毒株与疫苗毒株之间gB和gC的抗原表位数目、位置或氨基酸残基发生改变。这些突变与文献[15]报道的结果类似,提示HBXT-2018株gB和gC的抗原表位的变化可能与本研究中提及的免疫猪场暴发疫情有关。有关HBXT-2018株的分子致病机制有待进一步研究证实。
4 结论从某Bartha-K61疫苗免疫猪场分离到一株PRV变异株HBXT-2018,其与当前国内流行的PRV变异株具有相同的遗传特征,与Bartha株为代表的欧美流行株的遗传关系远。抗变异株血清对HBXT-2018株具有中和作用,而Bartha-61株抗血清对该毒株没有明显中和作用。上述结果提示,PRV的突变可能与该毒株的免疫逃逸及仔猪发病有关。
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