2. 临沂大学药学院, 临沂 276000;
3. 贵州大学动物科学学院, 贵阳 550025
2. School of Pharmacy, Linyi University, Linyi 276000, China;
3. College of Animal Science of Guizhou University, Guiyang 550025, China
山羊副流感病毒3型(caprine parainfluenza virus type 3, CPIV3)属于副黏病毒科呼吸道病毒属的新成员,同属成员还包括人副流感病毒1型和3型(human PIV1、human PIV3)、仙台病毒(Sendai virus, SV)和牛副流感病毒3型(bovine PIV3)[1]。该病原于2013年在江苏省养羊场检测到,发病羊以出现呼吸道症状为主[2]。通过全基因组测序发现,CPIV3与HPIV3、BPIV3的核酸相似性仅为73.3%~75.5%,在遗传进化上处于独立分支[3]。应用建立的荧光定量qRT-PCR方法检测鼻拭子样品,CPIV3的核酸阳性率为44.7%(51/114)[4];用阻断ELISA方法检测血清样品,CPIV3的抗体阳性率为39.3%(1 147/2 919)[5],可见CPIV3在羊群中流行率较高。动物攻毒试验发现,CPIV3感染山羊后引起呼吸道症状,出现咳嗽、流涕和病毒血症,剖检可见肺部实变,而且CPIV3能通过鼻腔和粪便排出体外,随着气溶胶水平传播,使相邻圈舍健康羊感染发病[6]。随后进行致病机制研究,将CPIV3感染的MDBK细胞进行高通量测序发现,240个miRNA在病毒感染中下调,9个miRNA在病毒感染中上调[7];对差异表达的miRNA进行功能研究发现,过表达/抑制表达bta-miR-222能影响CPIV3增殖,并证实了bta-miR-222可调控Ⅰ型干扰素分子通路,为进一步研究CPIV3在宿主细胞中感染复制提供基础资料[8]。
细胞凋亡(apoptosis)是机体正常细胞受到生理和病理性刺激后出现的一种自发的、基因控制的及一系列酶参与的死亡过程[9]。病毒感染能够引起细胞凋亡,细胞凋亡是病毒感染引起机体发病的重要原因,与疾病的严重程度呈正相关;同时,细胞凋亡为机体抵抗病毒感染提供的一种有效机制,感染的细胞通过自身裂解干扰病毒的复制[10]。细胞凋亡的启动和传递依赖于细胞内的一系列复杂的分子信号通路,主要包括外源性细胞凋亡通路和内源性细胞凋亡通路,这两条通路分别通过激活Caspase-8和Caspase-9,然后直接活化Caspase-3和Caspase-7,执行细胞凋亡[11]。
副黏病毒科成员,如新城疫病毒(NDV)[12-13]、SV[14-15]、犬瘟热病毒(CDV)[16-17]和小反刍兽疫病毒(PPRV)[18]等,均可引起细胞凋亡,其机制亦受到广泛关注。本实验室前期研究发现,CPIV3 JS2013株感染可造成山羊气管纤毛脱落变短[6];另有研究报道,BPIV3[19]和HPIV3[20]感染豚鼠可使气管上皮细胞脱落到气管腔中。因此,推测气管上皮细胞凋亡导致气管纤毛脱落变短。然而,目前CPIV3感染气管上皮细胞是否可诱导细胞凋亡尚无报道。笔者将实验室前期分离的CPIV3 JS2013体外接种气管上皮细胞,对CPIV3 JS2013是否能引起细胞凋亡及相关机制进行初步探究,以期明确CPIV3 JS2013感染气管上皮细胞引起细胞凋亡的信号通路。
1 材料与方法 1.1 病毒与主要试剂CPIV3 JS2013株和气管上皮细胞均为本实验室分离并保存;Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒;Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9活性检测试剂盒;Caspase抑制剂Z-VAD-FMK均购自上海碧云天生物技术公司;EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix、EasyScript One-Step RT-PCR SuperMix购自北京全式金生物公司;Caspase-3多抗购自Abcam公司;FITC标记的兔抗鼠荧光二抗购自上海碧云天生物技术公司;ECL化学发光显色试剂盒购自南京诺维赞生物科技有限公司。
1.2 qRT-PCR和TCID50检测CPIV3增殖用Transzol UP试剂提取上清中的总RNA后,使用TaKaRa公司的One Step PrimeScriptTM RT-PCR Kit检测上清中CPIV3核酸含量。使用ABI Step One荧光定量PCR仪进行扩增,qRT-PCR的反应体系和反应条件参照试剂盒说明书进行[4]。所用的引物qCPIV3F、qCPIV3R和探针qCPIV3-probe序列见表 1。
将气管上皮细胞接种96孔板,待细胞长至90%汇合度,用维持液将收获的病毒液进行10倍倍比稀释,然后接种细胞,每孔100 μL,重复4个孔,37 ℃培养3 d,然后观察每个稀释度出现的细胞病变的孔数。按Reed-Muench方法计算病毒TCID50。
1.3 CPIV3感染气管上皮细胞与观察在6孔板中准备气管上皮细胞,待细胞长至90%汇合度时接种1 MOI的CPIV3病毒液。分别于接毒24、48和72 h用倒置显微镜观察细胞形态。对照组加入相同体积的PBS,其他处理相同。
1.4 流式细胞术(FACS)检测细胞凋亡在6孔板中准备气管上皮细胞,待细胞长至90%汇合度时接种1 MOI的CPIV3病毒液。接毒后48 h收获细胞,PBS洗涤2次,同时设健康细胞对照组。将收获的细胞悬浮于Annexin V-FITC/PI结合缓冲液中,加入5 μL的Annexin V-FITC染色液,轻轻混匀,室温避光孵育15 min,加入10 μL的PI染色液,轻轻混匀,室温避光孵育5 min,上机检测。
1.5 Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9活性检测在6孔板中准备气管上皮细胞,待细胞长至90%汇合度时接种1 MOI的CPIV3病毒液,同时设健康细胞对照组。分别于接毒后24和48 h收获细胞。采用BCA法测定样品的蛋白质浓度。Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9活性检测按照试剂盒说明书进行,以酶标仪在405 nm波长处所测定的0 h样品的OD405 nm值为基准,确定各个时间段样品的Caspase相对活性。
1.6 qRT-PCR检测细胞凋亡因子mRNA表达在24孔板中准备气管上皮细胞,待细胞长至90%汇合度时接种1 MOI的CPIV3病毒液。接毒48 h后收获细胞,用qRT-PCR检测细胞中Fas、TNF-α、Bax、Bcl-2、Caspase-8、Caspase-9和Caspase-3的mRNA水平。同时设立转染NC对照组。
提取收获细胞的总RNA,使用北京全式金生物公司的EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix和EasyScript One-Step RT-PCR SuperMix进行反转录和qRT-PCR检测。使用ABI Step One荧光定量PCR仪进行扩增,反应体系和反应条件均参照试剂盒说明书进行[8]。以β-actin为内参计算感染组和对照组的细胞凋亡因子mRNA表达量变化,结果以-ΔΔCt表示。所用Fas、TNF-α、Bax、Bcl-2、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-3和β-actin的引物见表 1。
1.7 Caspase-3蛋白表达的Western blot检测将收获细胞样品加入Loading Buffer,煮沸10 min使蛋白变性,然后进行SDS-PAGE电泳。用转膜仪将凝胶中的蛋白转印到NC膜上,用BSA将NC膜在4 ℃封闭过夜。PBST洗涤三次后,加入抗Caspase-3兔多克隆抗体作为一抗,4 ℃孵育过夜,PBST洗涤三次后,加入HRP标记的羊抗兔IgG二抗,37 ℃孵育2 h,PBST洗涤三次,加入ECL显色液后进行曝光显色分析。
1.8 抑制细胞凋亡对CPIV3增殖的影响在24孔板中准备气管上皮细胞,待细胞长至90%汇合度时接种1 MOI的CPIV3病毒液。加入终浓度为0.1 mmol·L-1的Caspase抑制剂Z-VAD-FMK。同时设加入等体积的DMEM对照组。分别在接毒24和48 h后收获细胞上清,用qRT-PCR和TCID50检测CPIV3增殖情况。
1.9 统计分析本研究所有数据均采用SAS软件进行统计学分析,通过ANOVA、Least significance difference (LSD)方法进行计算。P<0.05时差异显著,用*表示;P<0.01和P<0.001时差异极显著,分别用**和***表示。数据以x±s表示,用Graphpad Prism软件绘制病毒增殖水平、细胞凋亡率、Caspase-3/8/9活性和细胞凋亡分子mRNA等变化趋势图。
2 结果 2.1 CPIV3在气管上皮细胞上的增殖将病毒接种气管上皮细胞后,分别在12、24、36、48、72和96 h收集培养上清,采用qRT-PCR和TCID50方法检测上清中CPIV3核酸含量和病毒滴度,结果显示,CPIV3感染气管上皮细胞后开始增殖,上清中的病毒含量在24 h出现明显升高,达106.50 copies·mL-1、102.50TCID50·mL-1,12~72 h病毒增殖最快,72 h的病毒载量达109.25 copies·mL-1、104.30TCID50·mL-1,随后72~96 h之间病毒增殖缓慢,96 h的病毒载量为109.36 copies·mL-1、104.50TCID50·mL-1。详见图 1。
CPIV3接种气管上皮细胞后,利用倒置显微镜进行观察,结果显示,感染24 h时,细胞变圆,相互融合;感染48 h后,CPE较为明显,主要表现为细胞变圆、皱缩、脱落等,且随着时间延长,CPE越明显。健康对照细胞生长正常,轮廓清晰,未见明显CPE。详见图 2。
将收获的细胞用Annexin V-FITC和PI染色液双染,用流式细胞仪检测发现,气管上皮细胞接种CPIV3后出现细胞凋亡,接毒48 h后细胞凋亡率接近20%,正常细胞凋亡率仅为1.60%。详见图 3。
收获接毒后24和48 h的气管上皮细胞进行检测,结果显示,与健康细胞相比,接种CPIV3的气管上皮细胞Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9活性在感染后24和48 h出现持续上升,其中Caspase-3上升2~3倍,Caspase-8和Caspase-9上升2倍左右。因此,CPIV3感染气管上皮细胞后,内源性凋亡通路(Caspase-9)和外源性凋亡通路(Caspase-8)均被激活,然后由Caspase-3执行细胞凋亡。详见图 4。
CPIV3接种气管上皮细胞后,在48 h收集细胞,利用qRT-PCR检测凋亡因子mRNA表达水平。结果显示,CPIV3感染细胞后,死亡受体凋亡途径的Fas、TNF-α和Caspase-9表达量上调(3~6倍);线粒体凋亡途径的Bax/Bcl-2(Bax表达量上调,Bcl-2表达量下调),Caspase-8表达量上调(6~12倍);最后凋亡执行者Caspase-3表达量迅速上调(12倍)。以上结果表明,CPIV3感染气管上皮细胞后,可启动死亡受体凋亡途径和线粒体凋亡途径,导致细胞凋亡。详见图 5。
对不同时间点CPIV3感染细胞中的Caspase-3蛋白进行Western blot检测,结果发现,随着病毒感染时间的延长Cleaved Caspase-3蛋白逐渐增加,见图 6。结果表明,Caspase-3途径在病毒诱导的细胞凋亡过程中被激活。
将CPIV3接种气管上皮细胞,并加入Caspase抑制剂Z-VAD-FMK后,分别在接毒24和48 h收获细胞上清,用qRT-PCR和TCID50检测CPIV3增殖情况。结果显示,加入Caspase抑制剂后在24和48 h均能有效抑制CPIV3增殖(P<0.01),如图 7所示。结果表明,抑制细胞凋亡能有效降低CPIV3的增殖水平。
CPIV3是2013年在江苏和安徽地区新分离到的病原,该病毒在MDBK细胞中生长速度快,增殖滴度高,且可稳定传代,因此前期试验一直使用MDBK细胞进行研究。然而,CPIV3的靶器官是呼吸器官,使用牛源的细胞系进行研究具有一定局限性。本研究发现,CPIV3能感染原代山羊气管上皮细胞,不同时间收获的培养物上清中病毒滴度呈上升趋势,72 h能达到104.30TCID50·mL-1。形态学观察发现,病毒感染48 h后,气管上皮细胞出现明显的细胞病变,且随着时间延长,CPE越发明显。因此,气管上皮细胞可作为研究CPIV3感染增殖的可靠细胞系。
细胞凋亡是机体重要的抗病毒应答反应,但有些病毒诱导细胞凋亡有利于病毒复制[21]。研究发现,传染性胃肠炎病毒(TGEV)感染PK-15细胞后活化FasL通路和Bax/Bcl-2通路,诱导细胞凋亡,且细胞凋亡和病毒增殖呈正相关[22]。猪血凝性脑脊髓炎病毒(PHEV)依赖Caspase途径诱导PK-15细胞凋亡[23]。Zhao等[24]研究得出,严重急性呼吸道综合征(SARS)是通过病毒的结构蛋白M蛋白和N蛋白诱导人肺成纤维细胞(HPF)凋亡。此前研究发现CPIV3感染MDBK细胞后与凋亡相关的miR-29c和miR-29d-3p出现不同程度的下调[25]。本研究首次揭示了CPIV3感染山羊气管上皮细胞能产生典型的细胞凋亡特征,包括典型的细胞病变(CPE)、凋亡细胞数量增多、Caspase酶活性增加、细胞凋亡因子mRNA表达量上升和Cleaved Caspase-3蛋白激活等现象。
Caspase为天冬半胱氨酸蛋白酶,在细胞凋亡过程中起关键作用。死亡受体通路和线粒体通路是激活Caspase的两个主要途径。研究发现,丙型肝炎病毒(HCV)[26]和登革热病毒(DENV)[27]通过激活死亡受体通路的Fas/FasL受体诱导细胞凋亡并促进病毒感染;SARS病毒[28]和EB病毒(Epstein-Barr virus)[29]通过与线粒体通路的Bcl-2家族蛋白相互作用,抑制其活性来启动细胞凋亡。本研究结果显示,CPIV3感染气管上皮细胞后,死亡受体凋亡途径的Fas、TNF-α和Caspase-9表达量上调;线粒体凋亡途径的Bax/Bcl-2和Caspase-8表达量上调;细胞凋亡的重要执行蛋白Caspase-3表达量亦上调。同时Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9活性在感染后24、48 h持续上升;Cleaved Caspase-3蛋白表达提高。这些结果提示,CPIV3诱导的细胞凋亡可能是通过启动死亡受体通路和线粒体通路来激活Caspase-3蛋白实现的。随后,在接种CPIV3的细胞中加入Caspase抑制剂,分别在感染24和48 h后收获细胞上清进行检测,发现抑制细胞凋亡能有效抑制CPIV3的增殖。结果进一步揭示,CPIV3通过诱导Caspase途径的细胞凋亡促进病毒释放,增强其复制和感染。
本研究通过细胞形态学观察和流式细胞仪检测证实,CPIV3能诱导气管上皮细胞凋亡。随后用Caspase活性试剂盒检测、qRT-PCR检测和Western blot试验揭示,CPIV3感染气管上皮细胞后,可激活死亡受体通路和线粒体通路,活化Caspase-8、Caspase-9和Caspase-3分子。研究结果可为进一步探究CPIV3诱导气管上皮细胞凋亡的分子机制提供科学数据。
4 结论首次揭示CPIV3感染气管上皮细胞能产生CPE现象,并诱导细胞凋亡。接毒细胞的Caspase-3/8/9活性显著升高,死亡受体凋亡途径和线粒体凋亡途径细胞凋亡因子mRNA表达显著上调,激活型Caspase-3蛋白在病毒感染过程中表达量增加。为进一步研究CPIV3诱导气管上皮细胞凋亡的分子机制奠定基础。
[1] | REN J L, ZHU Y M, ZHOU Y H, et al. Identification of three antigen epitopes on the nucleocapsid protein of the genotype C of bovine parainfluenza virus type 3[J]. Vet Microbiol, 2015, 178(1-2): 61–69. DOI: 10.1016/j.vetmic.2015.04.016 |
[2] | LI W L, MAO L, CHENG S P, et al. A novel parainfluenza virus type 3(PIV3) identified from goat herds with respiratory diseases in eastern China[J]. Vet Microbiol, 2014, 174(1-2): 100–106. DOI: 10.1016/j.vetmic.2014.08.027 |
[3] | YANG L L, LI W L, MAO L, et al. Analysis on the complete genome of a novel caprine parainfluenza virus 3[J]. Infect, Genet Evol, 2016, 38: 29–34. DOI: 10.1016/j.meegid.2015.11.027 |
[4] | LI J Z, LI W L, MAO L, et al. Rapid detection of novel caprine parainfluenza virus type 3(CPIV3) using a TaqMan-based RT-qPCR[J]. J Virol Methods, 2016, 236: 126–131. DOI: 10.1016/j.jviromet.2016.07.016 |
[5] | MAO L, LI W L, ZHOU T C, et al. Development of a blocking ELISA for Caprine parainfluenza virus type 3[J]. J Virol Methods, 2017, 250: 59–65. DOI: 10.1016/j.jviromet.2017.09.028 |
[6] | LI W L, HAO F, MAO L, et al. Pathogenicity and horizontal transmission studies of caprine parainfluenza virus type 3 JS2013 strain in goats[J]. Virus Res, 2016, 223: 80–87. DOI: 10.1016/j.virusres.2016.06.021 |
[7] | LI J Z, MAO L, LI W L, et al. Analysis of microRNAs expression profiles in madin-darby bovine kidney cells infected with caprine parainfluenza virus type 3[J]. Front Cell Infect Microbiol, 2018, 8: 93. DOI: 10.3389/fcimb.2018.00093 |
[8] | LI J Z, MAO L, ZHONG C Y, et al. Cellular microRNA bta-miR-222 suppresses caprine parainfluenza virus type 3 replication via downregulation of interferon regulatory factor 2[J]. Vet Microbiol, 2018, 224: 58–65. DOI: 10.1016/j.vetmic.2018.08.028 |
[9] | TIWARI M, PRASAD S, TRIPATHI A, et al. Apoptosis in mammalian oocytes:a review[J]. Apoptosis, 2015, 20(8): 1019–1025. DOI: 10.1007/s10495-015-1136-y |
[10] | GALLUZZI L, KEPP O, MORSELLI E, et al. Viral strategies for the evasion of immunogenic cell death[J]. J Intern Med, 2010, 267(5): 526–542. DOI: 10.1111/j.1365-2796.2010.02223.x |
[11] | ZHOU X C, JIANG W B, LIU Z S, et al. Virus infection and death receptor-mediated apoptosis[J]. Viruses, 2017, 9(11): 316. DOI: 10.3390/v9110316 |
[12] | RAJMANI R S, GANDHAM R K, GUPTA S K, et al. HN protein of newcastle disease virus induces apoptosis through SAPK/JNK pathway[J]. Appl Biochem Biotechnol, 2015, 177(4): 940–956. DOI: 10.1007/s12010-015-1788-7 |
[13] | AHMAD U, AHMED I, KEONG Y Y, et al. Inhibitory and apoptosis-inducing effects of Newcastle disease virus strain AF2240 on mammary carcinoma cell line[J]. BioMed Res Int, 2015, 2015: 127828. |
[14] | ZHANG Q, ZHU H X, XU X S, et al. Inactivated Sendai virus induces apoptosis and autophagy via the PI3K/Akt/mTOR/p70S6K pathway in human non-small cell lung cancer cells[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2015, 465(1): 64–70. DOI: 10.1016/j.bbrc.2015.07.130 |
[15] | SHI L Y, HAN Z, LI X X, et al. Inactivated Sendai virus strain Tianjin induces apoptosis in breast cancer MCF-7 cells by promoting caspase activation and Fas/FasL expression[J]. Cancer Biother Radiopharm, 2015, 30(1): 33–40. DOI: 10.1089/cbr.2014.1704 |
[16] | DEL PUERTO H L, MARTINS A S, MILSTED A, et al. Canine distemper virus induces apoptosis in cervical tumor derived cell lines[J]. Virol J, 2011, 8: 334–341. DOI: 10.1186/1743-422X-8-334 |
[17] | PILLET S, VON MESSLING V. Canine distemper virus selectively inhibits apoptosis progression in infected immune cells[J]. J Virol, 2009, 83(12): 6279–6287. DOI: 10.1128/JVI.00050-09 |
[18] | MONDAL B, SREENIVASA B P, DHAR P, et al. Apoptosis induced by peste des petits ruminants virus in goat peripheral blood mononuclear cells[J]. Virus Res, 2001, 73(2): 113–119. DOI: 10.1016/S0168-1702(00)00214-8 |
[19] | SHI H F, ZHU Y M, DONG X M, et al. Pathogenesis of a genotype C strain of bovine parainfluenza virus type 3 infection in albino guinea pigs[J]. Virus Res, 2014, 188: 1–7. DOI: 10.1016/j.virusres.2014.03.017 |
[20] | MIYATA H, KANAZAWA T, SHIBUYA K, et al. Contamination of a specific-pathogen-free rat breeding colony with Human parainfluenzavirus type 3[J]. J Gen Virol, 2005, 86(3): 733–741. DOI: 10.1099/vir.0.80666-0 |
[21] | CLARKE P, TYLER K L. Apoptosis in animal models of virus-induced disease[J]. Nat Rev Microbiol, 2009, 7(2): 144–155. DOI: 10.1038/nrmicro2071 |
[22] | DING L, XU X G, HUANG Y, et al. Transmissible gastroenteritis virus infection induces apoptosis through FasL-and mitochondria-mediated pathways[J]. Vet Microbiol, 2012, 158(1-2): 12–22. DOI: 10.1016/j.vetmic.2012.01.017 |
[23] | LAN Y G, ZHAO K, WANG G L, et al. Porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus induces apoptosis in a porcine kidney cell line via caspase-dependent pathways[J]. Virus Res, 2013, 176(1-2): 292–297. DOI: 10.1016/j.virusres.2013.05.019 |
[24] | ZHAO G, SHI S Q, YANG Y, et al. M and N proteins of SARS coronavirus induce apoptosis in HPF cells[J]. Cell Biol Toxicol, 2006, 22(5): 313–322. DOI: 10.1007/s10565-006-0077-1 |
[25] |
李基棕, 李文良, 毛立, 等. 山羊副流感病毒3型感染MDBK细胞的miRNA表达谱变化分析[J]. 畜牧兽医学报, 2017, 48(5): 896–906.
LI J Z, LI W L, MAO L, et al. Identification and analysis of the miRNA expression profiles in MDBK cells in response to the infection of caprine parainfluenza virus type 3(CPIV3)[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2017, 48(5): 896–906. (in Chinese) |
[26] | CHEN Z H, ZHU Y Z, REN Y L, et al. Hepatitis C virus protects human B lymphocytes from fas-mediated apoptosis via E2-CD81 engagement[J]. PLoS One, 2011, 6(4): e18933. DOI: 10.1371/journal.pone.0018933 |
[27] | LIAO H W, XU J, HUANG J Q. FasL/Fas pathway is involved in dengue virus induced apoptosis of the vascular endothelial cells[J]. J Med Virol, 2010, 82(8): 1392–1399. DOI: 10.1002/jmv.21815 |
[28] | TAN Y X, TAN T H P, LEE M J R, et al. Induction of apoptosis by the severe acute respiratory syndrome coronavirus 7a protein is dependent on its interaction with the Bcl-XL protein[J]. J Viro, 2007, 81(12): 6346–6355. DOI: 10.1128/JVI.00090-07 |
[29] | FU Q, HE C, MAO Z R. Epstein-Barr virus interactions with the Bcl-2 protein family and apoptosis in human tumor cells[J]. J Zhejiang Univ Sci B, 2013, 14(1): 8–24. DOI: 10.1631/jzus.B1200189 |