棒状杆菌是革兰阳性, 过氧化氢酶阳性，需氧或兼性厌氧，不运动的“棒状”杆菌。它们广泛分布于动物的微生物群(包括人类微生物群)中，并且大部分被认为是无害的，还有些在工业环境中是有用的，例如谷氨酸棒状杆菌。而有些可能会导致人类疾病，其中最突出的是由白喉棒状杆菌引起的人白喉。近二十年来，棒状杆菌属细菌种类不断扩大，大部分种类的棒状杆菌可从人和动物分离到，该属细菌由于其潜在的致病性越来越受到人们的重视^[1]。

干燥棒状杆菌为人鼻咽部黏膜或皮肤的正常菌群，一般无致病性，但对于免疫功能低下的宿主可能致病。干燥棒状杆菌是一种常见的人类病原，可从人类感染耳部分泌物、脑脓肿以及骨髓炎病例分离到^[2]，还可引起心瓣膜置换术后的心内膜炎，也可因外伤引起深部组织感染及尿道感染等^[3]。

该菌在动物临床样品中也有分离的报道，2002年，分别从疑似丹毒猪的肺及有呼吸问题猪的肾分离到结膜干燥棒状杆菌，2003年，从疑似副结核的山羊肝分离出该菌，之后，还从患败血症的猪的内脏、患关节炎猪的关节、流产动物子宫或胎儿以及乳房炎奶牛的奶中分离出此菌^[4]，2016年，从墨西哥绵羊的皮肤脓肿中鉴定到该菌^[5]，但还未有从牦牛分离该菌的报道，且关于该菌致病机制研究甚少。

常规临床微生物学实验室中对于棒状杆菌属基于表型的鉴定存在难度和错误诊断，这暗示干燥棒状杆菌的临床意义可能高于目前的认识^[5]。干燥棒状杆菌与弗雷尼棒状杆菌(Corynebacterium freneyi)、无枝菌酸棒状杆菌(Corynebacterium amycolatum)和Corynebacterium hansenii 在遗传上密切相关^[6]，但是DNA-DNA杂交试验表明它们代表不同的种，依赖于16S rRNA基因进行种的区分是存在问题的，而RNA聚合酶β亚基编码基因(rpoB)是16S rRNA替代和补充方法^[7]，因此，本研究除了对分离细菌的表型和16S rRNA进行鉴定外，对其rpoB进行扩增和分析，能够对分离细菌进行准确鉴定。本文的研究不仅为干燥棒状杆菌的分离和鉴定提供了较高的参考价值，有助于更好地识别和鉴定兽医临床样品中的这种微生物，另外，由于本试验分离菌株来源于病变组织，为更好地了解其作为动物病原体的分布和临床相关性提供依据。

1 材料与方法 1.1 试剂

细菌基因组提取试剂盒、胶回收试剂盒购自OMEGA，Taq premix购自Thermo公司，pMD 19-T Vector购自TaKaRa；IPTG、X-gal、DH5α购自全式金生物技术有限公司。血琼脂平皿购自广州环凯公司。API GP鉴定卡购自梅里埃公司，引物由北京三博远志生物公司合成。药敏纸片购自杭州天河微生物有限公司。

1.2 细菌分离

某屠宰场牦牛肝有干酪样结节，无菌采集肝组织涂片，革兰染色法和瑞氏染色法染色，显微镜下观察。用接种环无菌挑取新鲜组织划线接种在血琼脂平板上，37 ℃培养24 h。将分离到的菌落接种血琼脂斜面进行纯培养。

1.3 基因组提取

挑纯培养的细菌菌落至3 mL LB液体培养基中，37 ℃培养24 h，按OMEGA公司的Bacterial DNA kit说明书方案提取细菌基因组。

1.4 PCR扩增细菌

16S rRNA基因的扩增使用通用引物27f(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和1492r(5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′)。rpoB基因扩增引物使用C2700F和C3130R^[8]。反应体系为25 μL。其中mix 12.5 μL，模板1 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，加dd H₂O至25 μL。16S rRNA序列PCR反应程序：95 ℃预变性5 min：95 ℃ 1 min，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，共30次循环；最后72 ℃ 10 min。rpoB基因扩增的退火温度为60 ℃，其他条件同上。扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。电泳后，切下目的条带。按胶回收试剂盒说明书回收纯化PCR产物。

1.5 连接与转化

连接反应体系：PCR产物4 μL，pMD19-T 1 μL，solution I 5 μL，16 ℃连接30 min。取5 μL连接产物加入到50 μL融化的感受态大肠杆菌DH5α中，冰浴30 min，42 ℃热激45 s，冰浴2 min。在上述感受态细胞中加入950 μL不含抗生素的LB液体培养基，37 ℃振荡培养1 h。用移液器吸取100 μL培养液涂布含有IPTG、X-gal和氨苄青霉素的LB平板培养基。37 ℃培养12~16 h。

1.6 重组质粒鉴定

挑取平板上生长的白斑至含氨苄青霉素的LB液体培养基。37 ℃摇振培养8 h左右至培养液浑浊。无菌吸取少量菌液沸水煮10 min作为PCR反应的模板，进行菌液PCR鉴定。鉴定阳性的菌液送上海生工测序。

1.7 序列比对与分析

测得的序列用NCBI的BLAST软件进行对比分析。从NCBI下载棒状杆菌属细菌16S rRNA序列20条，其中包括干燥棒状杆菌、纹带棒状杆菌、弗雷尼棒状杆菌、无枝菌酸棒状杆菌等，由于NCBI中棒状杆菌16S rRNA序列多为不完整的部分序列，故选择本试验分离株的16S rRNA长度为1 432 bp的部分核酸序列用MEGA 7进行进化关系分析，其他菌的比对长度为1 430~1 440 bp(不同菌序列存在核苷酸插入和缺失)。从NCBI下载棒状杆菌属细菌和地中海拟无枝酸菌rpoB 部分基因序列21条，用MegAlign软件计算一致性。

1.8 生化试验

将纯培养的细菌接种血琼脂培养基，37 ℃培养18~24 h。细菌的生化试验和菌种鉴定按照API GP鉴定卡和Vitek全自动细菌鉴定仪的使用说明进行。

1.9 药敏试验

将细菌接种至血琼脂平皿，按美国临床实验室标准委员会推荐的K-B纸片法的要求进行药敏试验。

2 结果 2.1 细菌形态及菌落形态观察

分离菌在普通营养琼脂和血琼脂平皿上都能生长，在血琼脂平皿上24 h形成隆起、干燥、黄白色、边缘不整齐、中等大小的菌落。在营养肉汤中形成颗粒状沉淀，菌液轻微浑浊。经革兰染色为阳性菌，短杆状，单在，V形或呈栅栏状排列。

2.2 PCR扩增及电泳

PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，可以观察到16S rRNA大小约为1 500 bp，rpoB扩增片段大小稍小于500 bp，结果如图 1所示。

2.3 序列分析

测序结果显示用通用引物27f和1492r扩增出的16S rRNA大小为1 483 bp，序列分析显示，该菌与干燥棒状杆菌GD34株(KF928790.1)16S rRNA序列一致性为99%(1 482/1 483 bp), 只在引物区有1个核苷酸不同。从进化树上看，该菌与干燥棒状杆菌位于同一进化分支上，与弗雷尼棒状杆菌和Corynebacterium hansenii进化关系较近，如图 2所示。rpoB基因扩增产物为434 bp，因引物区含有简并碱基，为得到准确结论，将不含引物序列394个核苷酸进行blast分析，与JZ2株(KU298439.1)和CIP 100653株(AY492233.1)均有3个核苷酸差异，与JZ3(KU298440.1)有4个核苷酸差异。与N1株(KU298443.1)有10个核苷酸差异。rpoB部分序列(389 bp)核苷酸同源性分析显示，该菌与干燥棒状杆菌KU298440.1和KU298443.1的一致性分别为97.5%和95.3%，与无枝菌酸棒状杆菌(HE586299.1)的一致性为88.5%，与棒状杆菌ATCC6931(CP008913.1)一致性为88%，与地中海拟无枝酸菌(CP003729.1)一致性81%。

2.4 生化试验

API GP鉴定卡包含生化测试43项，其中D-核糖-L-乳酸盐产碱试验、精氨酸双水解酶1试验结果为阳性，而苦杏仁苷、D-木糖、磷脂酰磷脂酶C、β-D-半乳糖、α-葡萄糖苷酶、丙氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸芳胺酶、环式糊精、L-天冬氨酸芳胺酶、β-半乳糖吡喃糖苷酶、α-甘露糖苷酶、磷酸酶、亮氨酸芳胺酶、L-脯氨酸芳胺酶、β-葡萄糖醛酸酶、α-半乳糖苷酶、焦谷氨酸芳胺酶、β-D-葡萄糖醛酸酶、丙氨酸芳胺酶、酪氨酸芳胺酶、D-山梨醇、尿素酶、D-半乳糖、乳糖、N-乙酰-D-氨基葡萄糖、D-麦芽糖、杆菌肽耐受、新生霉素耐受、多黏菌素B耐受、6.5% NaCl生长、D-甘露醇、D-甘露糖、甲基-B-D-葡萄糖吡喃苷、支链淀粉、D-棉子糖、O/129耐受、水杨素、蔗糖、D-海藻糖、精氨酸双水解酶2和奥普托欣耐受等试验均为阴性。

2.5 药敏试验

分离菌株对米诺环素、氨曲南、妥布霉素、哌拉西林、头孢西叮、头孢哌酮、万古霉素、四环素、氯霉素抗菌药物均敏感，此外，该菌对青霉素、大观霉素、卡那霉素也均敏感。

3 讨论

棒状杆菌属的细菌有60多种，因为有些棒状杆菌是非致病性的，所以对临床分离株的菌种鉴定是很重要的，使用传统方法如色谱法或者使用商业的生物化学测试系统可能不包括鉴定所有菌种所必须的全部反应。16S rRNA基因序列分析为棒状杆菌的可靠鉴定铺平了道路，但是由于棒状杆菌的16S rRNA基因序列几乎不显示多态性，必须对16S rRNA的全长进行测序(约1 500 bp)才能作出比较准确的鉴定^[9]，此外，16S~23S rRNA基因间隔区的限制性片段长度多态性分析(RFLP)能够准确区分棒状杆菌某些菌种^[10]。RNA聚合酶β亚基编码基因(rpoB)被用于葡萄球菌、分枝杆菌、巴尔通体等的分类研究，rpoB全长大约3 500 bp，将56种棒状杆菌的rpoB 基因进行测序并研究表明，rpoB上434~452 bp片段的多态性足够对菌种进行准确鉴定。rpoB序列比16S rRNA基因序列对棒状杆菌的鉴定率高，这是一种简单的用于棒状杆菌鉴定的分子生物学方法，但是这种方法必须与其他方法结合用于细菌的精确鉴定^[11]。有研究分析了60种棒状杆菌的16S rRNA基因及rpoB基因序列，发现16S rRNA基因的种间相似度最高可达99.7%，而rpoB基因的种间相似度最高为95.9%，rpoB基因(2 700~3 130 bp)的序列分析对于棒状杆菌的辨别更有意义，当该部分基因序列的相似度低于96.6%时，考虑细菌为不同菌株的可能^[12]。在本试验分析的21条16S rRNA序列中，本分离株的16S rRNA与其他干燥棒状杆菌遗传距离为0~0.006不等，与同属不同种棒状杆菌遗传距离0.006~0.059不等。在分析的22条rpoB 部分基因序列中，本分离株的rpoB 部分基因序列与同种菌KU298440.1和KU298443.1的一致性分别为95.3%和97.5%，与同属不同种的一致性为79.1%~88.8%不等，且C. timonensis、C. maris、C. auris、Corynebacterium sp. 3301750与C. auris在比对区存在几个核苷酸的插入现象。结合16S rRNA及rpoB 部分基因的序列分析结果，认为该分离菌为干燥棒状杆菌。

有的干燥棒状杆菌临床菌株能够发酵麦芽糖产酸和有很强的α-葡萄糖苷酶的活性，这是少数能将干燥棒状杆菌与纹状体棒状杆菌和C. amycolatum 区分开来的生化特性^[13]。在Palacios等^[11]的研究中，多数干燥棒状杆菌，表达酯酶脂肪酶(C8)活性，并且能够发酵葡萄糖、核糖和麦芽糖，但是不发酵木糖、甘露醇、果糖或糖原；不产生吡咯烷酮芳基酰胺酶、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、β-甘露糖苷酶、β-岩藻糖苷酶、N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶、缬氨酸芳基酰胺酶、胱氨酸芳基酰胺酶、胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶，并且不水解七叶苷或尿素。但本次的分离株不能发酵麦芽糖，也没有α-葡萄糖苷酶的活性，发生生化表型差异可能是由于当营养环境改变时，许多棒状杆菌的生长特性及生化反应特点会随之变化，当新的表型特点与已有数据库不符，错误识别就时常发生^[12]，所以Vitek 2全自动微生物鉴定仪鉴定时将其错误鉴定为变异库克菌。据报道临床分离株对青霉素、氨苄西林、阿莫西林克拉维酸、强力霉素、头孢噻呋、头孢氨苄、庆大霉素、土霉素、恩诺沙星等均敏感^[13]。本次分离株对试验用的所有药物均有很高的敏感性，可能与本分离株的宿主动物很少应用抗菌药物有关，但是从病人分离到的干燥棒状杆菌对某些药物具有一定的耐药性^[14]。

虽然只有少数种类的棒状杆菌是公认的动物病原，在过去的几十年中，有很多来自人类和动物棒状杆菌新种的描述及分类修订，其中一些具有致病作用。Vela等^[4]用分子遗传方法对来自动物临床标本的干燥棒状杆菌进行首次鉴定，绝大多数分离的干燥棒状杆菌来自本应无菌的器官的纯培养物，这可能表明了该菌的临床重要性，在少数情况下从同一动物的不同器官或相同疾病的不同动物上同时分离到其他动物病原，如猪链球菌，猪肺炎支原体，这使得很难推断干燥棒状杆菌的致病特征。尽管如此，来自动物临床样品的干燥棒状杆菌的分离和报道有利于兽医临床微生物学家了解该菌的分布及其与动物疾病的关系^[2]。在过去的报道中，曾在疑似伪结核的病料中分离出干燥棒状杆菌，在本次试验中，也是在有干酪样结节的肝组织分离到该菌，同时还分离到罗氏菌、漫游球菌等。干燥棒状杆菌是否能够引起结节样病灶的形成，还需进一步试验验证。本试验较系统地研究了该菌的生物表型和分子特征，为该菌的鉴定和深入认识提供了依据。

4 结论

从牦牛肝分离出干燥棒状杆菌，该菌基因序列(如rpoB，MH006608)以及生化表型均存在一定程度的变异，该菌在16S rRNA进化树上与干燥棒状杆菌位于同一进化分支，与弗雷尼棒状杆菌和Corynebacterium hansenii进化关系较近；该菌株对米诺环素、氨曲南、妥布霉素、哌拉西林、头孢西叮、头孢哌酮、万古霉素、四环素、氯霉素、青霉素、大观霉素、卡那霉素均敏感。