, TIAN Hong, MENG Xuelian, HUI Xiaoting, WANG Yaojie, GUAN Yuhua, SHANG Youjun
, LIU Yongsheng, ZHANG Zhidong
小反刍兽疫(peste des petits ruminants，PPR)是由小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus，PPRV)引起小反刍动物(尤其山羊、绵羊)眼、鼻分泌物增加、口腔糜烂、腹泻、肺炎等的一种急性、热性、高度接触性传染病[1]。PPR于1942年首次在西非报道，随后的调查发现PPR广泛流行于撒哈拉沙漠与赤道之间的大多数非洲国家，后来，其分布扩大到中东(如伊朗)、南亚次大陆、土耳其以及亚洲中部的部分国家[2-4]。自2007年PPR作为外来动物疫病传入我国以来[5]，至2010年，一直在西藏地区流行，而且处于平缓状态[6]。但是到了2013年年底，PPR风波又一次从新疆掀起，而且波及面积也逐步扩大，截至2014年6月，疫情已蔓延近20多个省份[7]，2015年8个省份报道，2016年6个省份报道[8]，严重影响我国国际贸易和经济发展。为OIE法定报告动物疫病，也是全球计划根除的动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。农业部2015年12月24日印发《全国小反刍兽疫消灭计划(2016-2020年)》，我国将于2020年根除PPR，要实现此目标，任重道远。
PPRV属于副黏病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒属(Morbillivirus)的成员，其与麻疹病毒(MV)、犬瘟热病毒(CDV)、牛瘟病毒(RPV)等有相似的理化及免疫学特性。病毒分离和鉴定是当前流行PPRV毒株生物学特性研究的基础，但PPRV在Vero、BHK-21、PK-15等常用细胞系上或不易适应，或不产生典型细胞病变(CPE)，或传代几次后病毒丢失，分离率较低，影响和限制了对PPRV野毒株分离、生物学特性和致病机制的研究。有报道称人、犬、牛的淋巴细胞活化信号分子(SLAM, CD150)是MV、CDV、RPV等副黏病毒的受体[9-11]。研究表明，将SLAM蛋白导入细胞中稳定表达可提高细胞对于麻疹病毒属病毒的敏感性[12-15]。稳定表达犬SLAM的Vero-DST细胞系较Vero或B95a细胞系能更快且敏感地分离出CDV野毒株[11, 15]。朱颖等[16]建立的稳定表达犬SLAM的细胞系BHK-21/SLAM，与BHK-21细胞相比较，受试CDV在该细胞上的增殖滴度更高(提高1 000倍)，产生的CPE更明显(提前12 h)。表达人SLAM的CHO细胞分离MV较B95a细胞更敏感。可见SLAM是麻疹病毒属中许多病毒的细胞受体，根据这一研究成果，2008年，Pawar等[17]利用siRNA技术证实SLAM也是PPRV感染的细胞受体。Adombi等[13]利用稳定表达山羊SLAM蛋白的CV1细胞系从病理样品中高效分离到了野生型PPRV。目前国内没有关于SLAM作为病毒受体高效分离PPRV的敏感细胞，鉴于此，本研究利用Gateway技术和慢病毒表达系统将小反刍兽疫病毒受体山羊SLAM稳定整合在Vero细胞染色体上，通过一系列筛选、验证，建立易于PPRV分离的敏感细胞系，有助于阐明增强PPRV复制的关键靶基因，在开展PPRV的深入研究和疫苗毒生产具有重要的应用价值。
1 材料与方法 1.1 材料BP Clonase® ⅡEnzyme Mix、LR Clonase® Ⅱplus Enzyme Mix、ViraPowerTM Packaging Mix、Blasticidin、One Shot® Mach1TMT1R Chemically Competent Cells、pDONRTMvector、pLenti6.2/V5-DESTTMGateway® Vector均购自Invitrogen公司；DMEM、含非必需氨基酸MEM、OPTI-MEM、胎牛血清等购自GIBCO；质粒提取试剂盒购自Omega公司；新生牛血清购自兰州荣晔生物科技有限公司；山羊外周血淋巴细胞分离液购自天津灏洋；山羊抗人SLAM抗体(sc-31270、sc-31272)、驴抗山羊HRP标记二抗(sc-2020)、驴抗山羊FITC标记二抗(sc-2024)均购自Santa Cruz公司；MX3005P购自Agilent；One Step PrimerScriptTMRT-PCR Kit购自TaKaRa公司；Vero细胞、293-FT(人胚肾)细胞由中国农业科学院兰州兽医研究所保存。
1.2 靶标基因表达骨架pDEST/SLAM的构建及其鉴定 1.2.1 靶标基因的获得分离健康山羊外周血淋巴细胞(操作依据淋巴细胞分离液说明书进行)，提取其总RNA。按照载体需要设计针对SLAM基因引物：S上: 5′-ATGGATCACAAAGGGCTCCTCTCCT-3′；S下: 5′-TCAGCTCTCTGGAACCGTCACA-3′，并在引物两端分别加入载体位点同源臂。采用One Step PrimerScriptTMRT-PCR Kit试剂盒中试剂建立50 μL扩增体系：2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ 25 μL；RNase Free dH2O 11 μL；TaKaRa Ex Taq HS 1 μL；PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ 1 μL; S上(50 μmol·L-1)1 μL；S下(50 μmol·L-1)1 μL；Total RNA 10 μL。扩增程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 1 min，61 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min；35个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃ 5 min。1%的琼脂糖凝胶电泳纯化、回收PCR产物进行下游载体构建。
1.2.2 靶标基因的Entry clone载体构建及表达骨架pDEST/SLAM的获得上述PCR回收产物与pDONRTMvector进行B、P位点同源重组，建立20 μL反应体系：B位点PCR产物14 μL(稀释至适合浓度的质粒)；P位点pDONR载体2 μL；BP Clonase®ⅡEnzyme Mix 4 μL。点击混匀，置25 ℃金属浴中反应2 h后，加入蛋白酶k 4 μL，37 ℃水浴中10 min后全量转化One Shot Mach1TMTlR Chemically Competent Cells感受态细胞，扩增为阳性的克隆菌测序验证Entry clone是否合适，将合适的命名为pDONR/SLAM；同理，Entry clone载体14 μL，pLenti6.2/V5-DESTTMGateway® Vector 2 μL；LR Clonase®Ⅱplus Enzyme Mix 4 μL，连接、转化One Shot®感受态细胞，扩增验证为阳性的克隆菌外送测序，测序引物为DEST载体通用引物CMV和V5，将合适的命名为pDEST/SLAM。
1.3 复制缺陷型慢病毒样粒子的获得及感染阳性克隆细胞株的筛选 1.3.1 pDEST/SLAM表达骨架包装成完整病毒复苏液氮中保存293-FT包装细胞，培养液为含8%胎牛血清、10%非必需氨基酸的MEM，复壮第三代时，按次日满度为80%~90%比例接种6孔细胞培养板。依据Lipfection 2000说明书，将pDEST/SLAM表达骨架与包装质粒VSV-G、pLP1、pLP2共转染293-FT细胞进行包装，10 h后更换完全培养基，继续培养72 h，收集包装细胞，1 000 r·min-1离心5 min，0.22 μm滤器过滤的上清即为慢病毒样粒子，置-80 ℃保存，备用。
1.3.2 Vero细胞对Blasticidin抗性压力耐受浓度的确定将正常Vero细胞分种于10 cm2细胞瓶，达到80%~90%融合度时，利用细胞完全培养基按照1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、5、6 μg·mL-1梯度稀释Blasticidin杀稻瘟菌素，更换细胞培养液，期间更换几次抗性培养基，连续培养2周，进行细胞抗性致死浓度测定。
1.3.3 pDEST/SLAM转基因阳性细胞克隆的筛选利用“1.3.1”中慢病毒样粒子感染正常Vero细胞，25 cm2细胞瓶接种2 mL慢病毒样粒子上清，感作1 h后，补加完全培养基，采用“1.3.2”测定Blasticidin抗性浓度对感染细胞进行抗性筛选，整合有SLAM基因的细胞具有抗压能力，存活，没有被整合上基因的细胞会逐渐死亡。2周后，存活细胞会形成类似细胞岛，胰酶消化，1:1进行分种，长满后继续抗性筛选。对筛选后的细胞胰酶消化后进行有限稀释，接种于24孔细胞培养板，约1周后，将孔内只有一个克隆岛的细胞继续扩大培养，即为获得转基因的阳性克隆，命名为Vero/SLAM，进行扩大培养、连续传代并检测。
1.4 转基因阳性细胞功能验证 1.4.1 pDEST/SLAM基因稳定整合以及遗传稳定性鉴定为鉴定Vero细胞基因组染色体是否稳定整合pDEST/SLAM基因，以及其遗传稳定性，选取正常Vero细胞和连续传30代的转基因细胞各1瓶，弃培养液，胰酶消化，各500 μL PBS收集细胞，利用TaKaRa基因组DNA提取试剂盒，方法参照试剂盒说明书，提取细胞基因组DNA，用含有SLAM同源臂的上、下游引物进行PCR扩增，从基因水平验证整合情况。
1.4.2 转基因Vero/SLAM细胞表达SLAM受体验证参照“1.4.1”方法收集正常培养Vero以及Vero/SLAM转基因阳性细胞，蛋白裂解液裂解后跑SDS-PAGE电泳，用抗SLAM一抗(1:2 000稀释)以及驴抗山羊酶标二抗(1:5 000稀释)进行免疫印迹，从蛋白水平验证Vero/SLAM表达SLAM情况。
1.4.3 转基因Vero/SLAM细胞表达SLAM细胞定位转基因阳性细胞Vero/SLAM分种于激光扫描共聚焦显微镜(德国Leica，型号TCS-SP8)专用平皿，于24、36、48 h不同时间，收集细胞，清洗细胞面，封闭，固定，分别利用细胞质区和胞外域不同抗SLAM一抗孵育，清洗，加驴抗山羊TITC荧光二抗反应，设正常Vero细胞为对照，聚光共聚焦显微镜观察Vero/SLAM表达SLAM定位。
1.4.4 转基因Vero/SLAM细胞接种PPRV弱毒株后表达SLAM增强PPRV复制的验证 1.4.4.1致细胞病变及细胞毒价：正常及转基因细胞分别接种PPRV弱毒株，一方面观察致细胞病变情况；另一方面测定细胞毒价，正常收毒时间收毒，冻融两次后，连续传6代，将正常及转基因细胞分种于96孔板(三块板子，平行做三次)，48 h后，将F6代细胞毒按照100 μL病毒加900 μL维持液依次倍比稀释(使成10-1~10-10)。弃96孔细胞板内液体，第1~10列分别加稀释病毒液100 μL，每个梯度8个重复，第11和12列每孔加入100 μL维持液作为阴性对照，将96孔培养板置37 ℃含5%的CO2培养箱，每天观察记录并用Reed-Muench公式计算TCID50。
1.4.4.2间接免疫荧光验证转基因阳性细胞由于表达SLAM增强PPRV复制情况：将Vero及Vero/SLAM细胞分种于6孔细胞培养板，48 h后接种F6代细胞毒，36 h弃去病毒液，以pH7.6，0.5 mol·L-1的PBS缓冲液轻洗细胞面2次，吸水纸吸干，加入预冷的丙酮-20 ℃固定30 min，PBS洗涤4~5次，加入1:20稀释的山羊PPRV阳性血清，置湿盒中，37 ℃作用45 min，吸干，加入1:5 000稀释FITC标记驴抗山羊二抗，孵育45 min，吸弃液体，PBS洗涤4~5次，吸干后滴加50%甘油，观察绿色荧光产生情况，从蛋白水平验证SLAM表达对病毒增殖的影响。
1.4.4.3Real-time RT-PCR验证PPRV在Vero/SLAM敏感细胞上的增殖效果：PPRV接种正常及转基因细胞，分别于12、24、36、48、60 h收集细胞毒各一瓶，Trizol法提取基因组RNA，将其稀释至100 ng·μL-1，利用本实验室研发的“一种用于检测小反刍兽疫病毒的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒”专利中PPRV探针[18]，同时合成GAP-DH管家基因引物，以及一步探针法扩增试剂盒扩增V基因，每个样品重复三次，用比较阈值法分析不同样品中PPRV的相对拷贝数[19]。从转录水平验证Vero/SLAM敏感细胞表达的SLAM对PPRV增殖的影响。
2 结果 2.1 慢病毒介导靶标基因表达骨架pDEST/SLAM的构建及其鉴定从山羊外周血淋巴细胞中成功获得完整开放阅读框SLAM基因(约1 071 bp)；经BP、LR重组后，PCR及测序鉴定，验证，构建的Entry clone及其表达骨架pDEST/SLAM完全正确，初步证实表达骨架pDEST/SLAM已成功构建(图 1)。序列分析证实，SLAM构建于DEST载体的读码框完全正确。
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M. DL2000相对分子质量标准；1.山羊淋巴细胞扩增SLAM片段；2. BP重组验证；3. LR重组验证；4~6. Vero/SLAM转基因阳性细胞F10、F20及F30代扩增验证；7.正常Vero细胞 M. DL2000 molecular weight marker; 1. SLAM fragment of goat lymphocyte amplification; 2. BP recombination verification; 3. LR recombination verification; 4-6. SLAM amplification of F10, F20 and F30 generation of Vero/SLAM transgenic positive cells; 7. Normal Vero cells 图 1 SLAM基因扩增及整合验证电泳 Figure 1 SLAM gene amplification and integrated verification of electrophoretic diagram |
将含一定比例杀稻瘟菌素Blasticidin培养基接种正常Vero细胞进行为期两周压力筛选后，发现，使正常Vero细胞全部死亡的Blasticidin最低浓度为3.5~4 μg·mL-1(如图 2A)。故筛选转基因细胞时先用3.5 μg·mL-1筛选，扩大培养后用4 μg·mL-1再次加大剂量筛选，以获得较纯的转基因细胞。
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A. Blasticidin抗性压力后Vero细胞；B. Vero/SLAM转基因阳性细胞克隆 A. Vero cell by Blasticidin; B. Cloning of Vero/SLAM transgenic positive cells 图 2 经Blasticidin抗性及转基因后的正常Vero细胞 Figure 2 Normal Vero cells after Blasticidin resistance and transgene |
慢病毒样粒子感染正常Vero细胞后，经两个浓度、三轮Blasticidin筛选，成功获得转基因阳性细胞克隆，命名为Vero/SLAM(如图 2B)，继续扩大、分种以及连续传代培养。与正常Vero细胞相比，整合后的细胞其形态眼观上有所改变(细胞扩大培养后形态参见“2.7”部分图 5中VS所示)。
2.4 Vero/SLAM转基因阳性细胞基因整合以及遗传稳定性鉴定分别提取Vero/SLAM转基因细胞F10、F20、F30代以及正常Vero细胞基因组DNA，利用SLAM同源臂上、下游引物扩增SLAM基因。与图 1中1的正常Vero细胞相比，Vero/SLAM转基因细胞F10、F20及F30代SLAM基因均获得成功扩增(图 1)，可见，本研究借助慢病毒表达系统成功将SLAM基因稳定整合在正常Vero细胞基因组染色体上，连续传30代后不丢失，说明整合具有一定遗传稳定性。从基因水平证实转基因阳性细胞Vero/SLAM被稳定整合。
2.5 Vero/SLAM转基因阳性细胞表达SLAM的Western blot验证收集的Vero/SLAM转基因阳性细胞和正常Vero细胞裂解后，经山羊SLAM一抗和驴抗山羊酶标二抗孵育反应，印迹结果显示，转基因细胞Vero/SLAM出现特异性结合条带，大小与预期相符，正常Vero细胞没有出现印迹条带，说明转基因Vero/SLAM阳性细胞具有表达SLAM蛋白功能，结果如图 3。
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1. Vero; M.蛋白质相对分子质量标准；2. Vero/SLAM 1. Vero; M.Protein marker; 2. Vero/SLAM 图 3 转基因细胞表达SLAM的Western blot验证 Figure 3 Western blot verification of the expression of SLAM in transgenic cells |
分别用针对细胞质区、胞外域抗SLAM一抗及驴抗山羊FITC荧光二抗与正常Vero/SLAM细胞进行间接免疫荧光反应时，激光共聚焦显微镜显示：与胞外域抗体反应的细胞基本没有荧光产生，与细胞质区抗体反应的细胞表达产生荧光，主要集中细胞周质表达(vs-FITC、vs-DAPI、vs-Merge)。说明构建Vero/SLAM表达SLAM主要集中于细胞周质。正常对照细胞基本没有表达(v-FITC、v-DAPI、v-Merge)，转基因细胞用vs表示，正常细胞用v表示，下同，具体如图 4。
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vs-FITC. Vero/SLAM细胞表达SLAM与一抗、二抗反应后产生绿色荧光定位; vs-DAPI. Vero/SLAM细胞核被DAPI染成蓝色; vs-Merge. vs-FITC与vs-DAPI叠加；v-FITC. Vero细胞表达SLAM与一抗、二抗反应后产生绿色荧光定位; v-DAPI. Vero细胞核被DAPI染成蓝色; v-Merge.v-FITC与v-DAPI叠加 vs-FITC. FITC staining of Vero/SLAM; vs-DAPI. DAPI nuclear staining of Vero/SLAM; vs-Merge. Overlay of vs-FITC and vs-DAPI; v-FITC. FITC staining of Vero; v-DAPI. DAPI nuclear staining of Vero; v-Merge. Overlay of v-FITC and v-DAPI 图 4 转基因细胞表达SLAM的细胞定位 Figure 4 Cell localization of SLAM expressed by transgenic cells SLAM |
Vero/SLAM(如图 5中VS)和正常Vero(如图 5中V)细胞接种PPRV弱毒苗后，F1代，两者几乎没有太大区别，估计处于适应阶段，从F2代开始(图 5中VS1)，PPRV弱毒苗致Vero/SLAM细胞病变程度明显强于Vero细胞：形成合胞体时间提前，第2天开始出现，随后融合细胞进一步增多，呈蜂窝状，60 h时，病变非常明显，第4天收毒，F4代开始，第3.5天收毒(如图 5中VS2)；正常对照细胞第3天开始出现病变(如图 5中V1)，细胞聚集成团，形成合胞体较少，形成的合胞体也没连接成片，病变程度较Vero/SLAM细胞轻微，F4代第4~6天收毒(如图 5中V2)。另外，接毒后，用PPRV一抗和FITC二抗进行间接免疫反应时，Vero/SLAM细胞产生特异性荧光明显多于Vero细胞，可见，无论从细胞病变效应还是特异性间接免疫荧光产生情况均说明转基因细胞因表达了SLAM而使PPRV复制现象明显增强。
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VS. Vero/SLAM细胞；VS1.Vero/SLAM细胞感染PPRV后第2天；VS2. Vero/SLAM细胞感染PPRV后第3.5天；VS3.Vero/SLAM细胞感染PPRV后间接免疫荧光；V.正常Vero细胞对照；V1. Vero细胞感染PPRV后第3天；V2.Vero细胞感染PPRV后第5天；V3. Vero细胞感染PPRV后间接免疫荧光 VS. Vero/SLAM cells, VS1.Vero/SLAM cells at the 2nd day post PPRV infection; VS2. Vero/SLAM cells at the 3.5th day post PPRV infection; VS3. Immunofluorescence of Vero/SLAM cells post PPRV infection; V. Normal Vero cells control; V1. Vero cells at the 3rd day post PPRV infection; V2. Vero cells at the 5th day post PPRV infection; VS3. Immunofluorescence of Vero cells post PPRV infection 图 5 PPRV致Vero/SLAM和Vero细胞的CPE及免疫荧光 Figure 5 CPE and immunofluorescence of Vero/SLAM and Vero cells infected by PPRV |
转基因阳性细胞及正常Vero细胞接毒后，第5天收毒，置-70 ℃反复冻融2次，倍比稀释，利用Reed-Muench两氏法分别测定24、48、72、96 h等不同时间的TCID50。结果，24~96 h不同时间点，转基因阳性细胞Vero/SLAM TCID50值均明显高于正常Vero细胞阴性(图 6)。说明转基因阳性细胞表达的SLAM具有增强PPRV复制的能力。结果进一步印证了“2.7”中直接观察到的细胞病变效应以及间接免疫荧光结果。
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图 6 转基因阳性细胞感染PPRV后不同时间TCID50 Figure 6 TCID50 of different time of transgenic positive cells infected by PPRV |
12、24、36、48、60 h不同时间点收集细胞，从中扩增PPRV及GAP-DH基因进行相对表达分析后发现，无论整体时间或者某一个时间点，Vero/SLAM细胞中PPRV相对拷贝数明显高于Vero细胞，而且效果显著(图 7)。说明Vero/SLAM稳转细胞表达的SLAM完整ORF具有增强PPRV繁殖的性能。这一结果进一步从基因组转录水平证实构建的稳转细胞株Vero/SLAM表达的SLAM完整ORF具有特异性增强PPRV复制的能力。
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图 7 Real-time RT-PCR验证转基因阳性细胞表达的SLAM对PPRV复制增殖的影响 Figure 7 Transcriptional level verifies the effect of SLAM expressed by transgenic positive cells on the proliferation of PPRV replication |
本研究通过激光扫描共聚焦显微镜技术、间接免疫荧光产生、致细胞病变效应以及实时荧光定量等手段分别从基因水平、蛋白水平、转录水平等验证已成功构建能够稳定表达SLAM的稳转细胞系Vero/SLAM。该细胞系连续传30代不丢失，说明具有遗传稳定性；其蛋白主要表达于Vero细胞周质，可以与SLAM特异性抗体反应，说明具有一定反应活性；其接种PPRV后，与正常Vero细胞相比，细胞病变效应增强，合胞体变大，收毒时间由4~7 d缩短至3.5 d，Real-time RT-PCR分析时，Vero/SLAM使PPRV相对表达量明显增加。由此说明整合在细胞上的SLAM成功获得表达(图 1)，从上述图 2~6中也可以看出SLAM的表达使得PPRV增殖效果显著。赵建军等[20]、闫如勋[21]分别构建表达貂以及不同动物SLAM的Vero细胞系能够提高犬瘟热病毒复制能力，张家林等[22]构建的山羊SLAM BHK-21细胞具有增强PPRV复制的功效，也能传20代，但都是建立在瞬时转染的基础上，而且只是对某个靶点的瞬时验证，仍停留在基因水平，没有形成有形的工具。
本研究采用慢病毒表达系统和Gateway技术建立一种可以增强PPRV复制的工具，慢病毒表达载体，包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息，可以将外源基因有效地整合到宿主基因组染色体上，达到持久性表达，同时包装的慢病毒可以感染各种类型细胞，从而为本试验的成功构建提供有利途径。上述数据已证实，本次构建的细胞Vero/SLAM被稳定整合，具有遗传稳定性。吴锦艳等[23]利用慢病毒表达系统和重组技术建立稳定表达靶向抑制PRRSV复制的shRNA的Marc-145阳性细胞克隆，齐兴财等[24]通过慢病毒表达系统构建用于抑制口蹄疫病毒复制的BHK-21细胞系，抑制率达到85%~90%。这些研究进一步说明慢病毒表达系统具有稳定整合功能。
Gateway技术是在插入的目的DNA片段两端整合att L1和att L2两个侧端重组序列，来构建一个类似通道的结构，并称之为“入门克隆”(Gateway entry clone)，将靶标基因克隆到入门载体(entry vector)后，依赖载体上存在的特定重组位点和重组酶，高效、快速地将目的基因克隆到受体载体(destination vector，目的载体)上，通过去除冗长的亚克隆步骤节省操作时间，不同于传统的限制性内切酶方法，避免了目的片段内存在切点的问题而使得大片段DNA保持其完整性，大大提高了克隆效率[25]，已得到广泛应用。赵容等[26]利用Gateway克隆技术构建丹参NAC转录因子的RNAi植物表达载体；周洁等[27]创制基于Gateway重组技术的双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation, BiFC)载体, 同时创制低成本低克隆背景的Gateway入门载体，利用入门载体，采用Gateway技术快速将目标基因重组到BiFC目标载体；刘健[28]通过改造pYBA骨架, 将原菌中筛选标记卡那霉素抗性基因置换成链霉素抗性基因，通过酶切连接的方法先后连接植物筛选标记表达框(Npt、Hyg和Bar)、35s-Pro、35stop polyA、荧光蛋白(EGFP、EYFP、ECFP、mVenus、mTFP1、TagRFP和m Cherry)和attR位点，成功构建7种含荧光蛋白标签的Gateway目标载体，依靠Gateway LR重组反应，使目的基因LST8.2和PGK.1转移到了目标载体中，成功构建含标签TagRFP和Cherry的重组载体。本研究利用该技术通过BP、LR重组高效、快速获得表达骨架，构建的Vero/SLAM敏感细胞亚克隆与正常Vero细胞相比，形态上稍有改变，经细胞生长曲线、细胞毒性试验等一系列试验验证(没有一一列举)，其生物学特性没有异常，所以无论科学研究还是生产疫苗，该Vero/SLAM敏感细胞亚克隆完全可以用于小批量或大规模生产使用。值得注意的是，建立的稳转细胞系虽然实验室验证能够持续产生增强效果，但回归本动物时是否具有增殖病毒复制的功效还需要大量试验验证。
4 结论成功建立一株稳定表达山羊淋巴细胞活化分子(SLAM)受体的Vero细胞-Vero/SLAM：该细胞因稳定表达SLAM受体，具有明显增强小反刍兽疫病毒复制的功能。不仅可以从细胞模型水平阐明增强PPRV复制的关键靶基因，也为PPRV感染引起宿主细胞的变化以及对机体的致病机制等提供研究工具。
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