, YANG Jinfang, JING Haixia
, YU Hongxian, ZHANG Qinwen, LI Li, WEI Qing, WANG Xinyue, LI Feng, CHEN Yonghao, YANG Yuying, LI Guangzhen
牦牛主要生活在海拔3 000 m以上的青藏高原地区，对高寒、低氧、低压环境有较强的适应能力，能充分适应其他动物难以适应的高原环境和气候，是高原地区农牧民的主要经济来源[1]。此外，牦牛乳与其他普通牛种相比，其干物质、蛋白质、乳脂率、乳糖、维生素和微量元素的含量较高[2]。牦牛以自然放牧为主，长期生活在无工业污染的高原地区，采食天然牧草，为人们提供了无污染和高质量的牦牛乳产品[3]。但牦牛的乳产量不高，这成为制约牦牛乳产业进一步发展的主要原因。
乳腺(mammary gland)是哺乳动物分泌乳汁的器官，属外分泌腺，它所分泌的乳汁是新生幼仔获得营养和免疫保护的重要途径。牦牛的泌乳能力与乳腺的发育密切相关，研究表明，在乳腺发育过程中乳腺的腺泡越多，则动物的泌乳能力就越强[4]。除此之外，牦牛的泌乳量还受机体多种激素的调控，其中卵巢雌激素起重要作用[5]。雌激素是卵巢分泌的脂溶性类固醇类激素，也是人和其他高等动物中最重要的激素之一，其生理功能是通过与乳腺组织细胞膜上的受体特异性结合后，刺激乳腺导管伸长、调节乳腺小叶周围结缔组织和腺泡的发育、增加细胞膜的通透性并促进细胞外液的积累[6]。激素-受体复合物进入细胞核与DNA特异性结合后，调节基因转录过程，从而诱导蛋白质的合成，分泌乳汁。
雌激素受体(estrogen receptor, ER)是甾体激素受体(steroid hormone receptor, SHR)大家族的一种核受体，它位于细胞膜、细胞质或细胞核中，主要有ERα和ERβ两种亚型，不同属动物的正常乳腺组织都表达ERα和ERβ，ERα对乳腺导管伸长和上皮分化有促进作用[7]，而ERβ却不具备这种作用。研究表明，ERα和ERβ在牦牛各组织均有表达，且它们的分布具有差异性，ERα在牦牛乳腺中表达最高，而ERβ在牦牛卵巢中表达最高，ERα和ERβ在子宫和输卵管的表达量较少[8]。
为进一步了解牦牛乳腺组织雌激素受体的分布与表达，选取5头健康泌乳中期和静止期牦牛的乳腺组织，通过免疫组织化学染色SP法和Western blot技术研究牦牛乳腺雌激素受体的分布与表达情况，旨在研究泌乳中期和静止期牦牛乳腺内雌激素受体对泌乳的调节机制是否存在差异性，以期为提高牦牛乳产量提供理论指导，也为高寒哺乳动物乳腺的研究提供参考资料。
1 材料与方法 1.1 动物来源及样品处理选择泌乳中期(分娩后3~4个月)和静止期(断乳后1个月)的健康牦牛各5头(购于青海省海晏县)，经检测无乳腺炎及其他疾病，在试验牛栖息地现场颈动脉放血后，立即沿正中线切开腹部皮肤直至耻骨后缘，剥离皮肤，在20 min内取乳腺体部组织，取材时避开血管和脂肪组织，将乳腺组织分为两部分，一部分(0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm)放入4%的多聚甲醛溶液，用于免疫组织化学染色；另一部分(50~100 mg)立即投入液氮中速冻，之后放在-80 ℃冰箱保存，用于提取乳腺组织蛋白。
1.2 设备和试剂紫外凝胶成像仪(BIO-RAD)、低温高速离心机(Eppenddorf)、超纯水系统(帕斯帝卡)、恒温振荡器(ZD-85A型金坛市富华仪器有限公司)、NIKON H600L显微镜(日本)；免疫组织化学染色试剂：一抗ERα为小鼠单克隆抗体C-542(ab66102)、ERβ为兔多克隆抗体(ab3577)，二抗过氧化氢封闭液及链酶卵白素使用免疫组织化学染色试剂盒(ab64264)均购于Abcam艾美捷公司；Western blot试剂：ERα和ERβ一抗同免疫组织化学染色方法中一抗，管家基因β-actin蛋白抗体(bs-0061R)购于北京博奥森生物技术有限公司，二抗羊抗小鼠(BA1050)和羊抗兔(BA1054)均购于博士德生物有限公司，全蛋白提取试剂盒(KGP250)购于南京凯基生物科技有限公司，4×蛋白上样缓冲液(P1016)、SDS-PAGE凝胶试剂盒(P1200-1/P1200-2)和ECL Plus超敏发光液试剂盒(PE0010)均购于索莱宝生物科技有限公司，其他试剂均为国产分析纯。
1.3 方法 1.3.1 免疫组织化学染色SP法石蜡切片经脱蜡，复水后，抗原修复，Hydrogen Peroxide Block孵育，Protein Block封闭，滴加稀释好的一抗(将1 mg·mL-1的抗体进行稀释，ERα为2.5 μg·mL-1，ERβ为3.0 μg·mL-1)、二抗(Biotinylated Goat Anti-polyvalent)和辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素复合物(streptavidin peroxidase)孵育之后，DAB显色，苏木精复染脱水，透明，封片，镜检。
1.3.2 Western blot按照全蛋白提取试剂盒说明书提取乳腺组织总蛋白，用4×蛋白上样缓冲液进行蛋白变性，SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，奶粉封闭，ERα、ERβ及β-actin的一抗分别为鼠单克隆(ab66102)、兔多克隆抗体(ab3577，bs-0061R)，ERα和ERβ的二抗分别为HRP标记的羊抗鼠(BA1050)和HRP标记的羊抗兔(BA1054)及β-actin为羊抗兔(BA1054)孵育之后，ECL试剂曝光，用凝胶图像成像分析系统(BIO-RAD)拍照，利用Image J软件分析条带结果。
1.4 数据分析每头动物随机选取5张免疫组织化学染色后的切片(免疫阳性产物为棕黄色，阴性对照切片中细胞核为蓝色)，10×40倍显微镜(日本，Nikon H600L)下随机选取10个视野拍照并使用Image proplu 6.0软件进行图像分析，在图像中减去背景色，选取常用参数；积分光密度(IOD)和阳性面积，其比值即平均光密度(mean density)，可用来评价阳性细胞染色程度，反映目标抗原的量。将曝光后胶片放入凝胶成像仪(BIO-RAD)进行拍照，保存，利用Image J软件测目的蛋白条带的灰度值，进行半定量分析，以目的基因的灰度值与管家基因β-actin的灰度值之比表示目的蛋白的表达水平。最后用SPSS 21.0进行单因素方差分析，分析结果用“平均数±标准差”来表示。P < 0.05表示差异显著；P < 0.01表示差异极显著。
2 结果 2.1 ERα和ERβ在牦牛乳腺组织内的分布从图 1可知，在牦牛泌乳中期和静止期乳腺组织中均有ERα的表达。泌乳中期乳腺组织内ERα大多分布于乳腺腺泡上皮细胞，少部分分布在小叶间结缔组织，偶见于血管内皮细胞(图 1A)，ERα在乳腺组织的细胞质和细胞核内均有分布，在泌乳中期乳腺腺泡上皮细胞胞质内多见ERα分布，少部分ERα分布在腺泡上皮细胞和小叶间结缔组织内脂肪细胞的细胞核，偶见于血管内皮细胞的细胞核(图 1A1)；静止期牦牛乳腺内的ERα大量分布于结缔组织中脂肪细胞及血管内皮细胞(图 1B)，细胞核内ERα主要分布于小叶间结缔组织内脂肪细胞及血管内皮细胞的细胞核，少数分布于腺泡上皮细胞的细胞质(图 1B1)。
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a.腺泡上皮细胞；b.导管上皮细胞；c.小叶间结缔组织内脂肪细胞；d.血管内皮细胞。下图同 a. Gland bubble epithelial cells; b. Duct epithelial cells; c. Fat cells in interlobular connective tissue; d. Vascular endothelial cells. The same as the following figure 图 1 泌乳中期和静止期牦牛乳腺组织中ERα的免疫组化分析 Figure 1 Immunohistochemical demonstration of ERα in yak mammary gland during mid-lactating and non-lactating period |
从图 2可知，泌乳中期ERβ大多分布于腺泡上皮细胞，偶见于血管内皮细胞及脂肪细胞(图 2A)，其中在腺泡上皮细胞细胞质大量分布，偶见于血管内皮细胞及脂肪细胞的细胞核中(图 2A1)。静止期乳腺组织内的ERβ广泛分布于导管上皮细胞，小叶间结缔组织内间质细胞及血管内皮细胞(图 2B), ERβ在细胞质内的分布见于腺泡上皮细胞，但较泌乳中期乳腺内ERβ少，细胞核内的分布主要见于小叶间结缔组织内间质细胞及血管内皮细胞(图 2B1)。
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图 2 泌乳中期和静止期牦牛乳腺组织中ERβ的免疫组化分析 Figure 2 Immunohistochemical demonstration of ERβ in yak mammary gland during mid-lactating and non-lactating period |
免疫组化结果显示，ERα和ERβ在牦牛乳腺的不同发育期有明显的变化，泌乳中期ERα的平均光密度值(0.053±0.006)与静止期ERα的平均光密度值(0.078±0.013)比较，静止期显著高于泌乳中期(P < 0.05)；泌乳中期ERβ的平均光密度值(0.094±0.010)与静止期ERβ的平均光密度值(0.117±0.017)比较，差异不显著(P>0.05)(表 1)。
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表 1 泌乳中期和静止期牦牛乳腺组织内ERα和ERβ的平均光密度值 Table 1 The average optical density values of ERα and ERβ in yak mammary gland during mid-lactating and non-lactating period |
Western blot结果显示，ERα和ERβ的蛋白表达量在牦牛乳腺组织不同发育期有明显的变化(图 3A)，泌乳中期ERα的蛋白相对表达量与静止期比较，静止期显著高于泌乳中期(P < 0.05)；泌乳中期与静止期ERβ的蛋白相对表达量，差异不显著(P>0.05)(图 3B)。
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组内比较，不同字母表示差异显著(P < 0.05)，相同字母表示差异不显著(P>0.05) Compare within groups, different letters show significant difference (P < 0.05), the same letters show no significant difference (P>0.05) 图 3 泌乳中期和静止期乳腺组织内ERα、ERβ的Western blot结果(A)和蛋白水平相对表达量(B) Figure 3 Western blot results(A) and the relative expression (B) of ERα and ERβ in mammary gland during mid-lactating and non-lactating period |
雌激素是人及其他动物体内最重要的激素之一，其生理功能是通过雌激素受体实现的[6]。雌激素受体是一种甾体激素受体家族的一种核受体，它的分布有很大的组织特异性，包括中枢神经系统、心血管系统、免疫系统、泌尿生殖道、胃肠道、骨组织、肾、肺、子宫。此外，雌激素受体在正常乳腺及乳腺癌中均有表达[9]，可诱导乳腺上皮细胞的增生[10]，并通过介导雌激素对乳腺导管和腺泡的发育进行调控。目前发现，雌激素受体主要包括ERα和ERβ两种亚型。
3.1 ERα在牦牛乳腺组织内的分布特点、阳性细胞分布及蛋白表达ERα主要表达于阴道、乳腺、子宫、骨和其他一些靶器官[11]。在牦牛的各种组织中，ERα在乳腺中表达量最高，子宫、输卵管及卵巢次之，心、肝、脾、肺、肾及睾丸相对表达量较低[8]。在大鼠乳腺中发现，ERα在初情期、泌乳期和泌乳后期乳腺中均有表达[12]。本研究通过分析免疫组化结果发现，在牦牛泌乳中期和静止期的乳腺组织内均有ERα分布，ERα在乳腺组织的细胞质和细胞核内均有分布，其中在泌乳中期乳腺腺泡上皮细胞胞质内多见ERα分布，静止期ERα主要分布于小叶间结缔组织内脂肪细胞及血管内皮细胞的细胞核，少数分布于腺泡上皮细胞的细胞质。这一结果与尹玉涛等[7]对济宁青山羊的研究结果一致。ERα主要在奶牛乳腺上皮细胞中表达；而小鼠和人乳腺组织的研究结果与本研究结果略有不同[13]。Shyamala等[5]研究发现，ERα在幼龄小鼠乳腺组织内只分布于乳腺基质细胞，性成熟后分布于基质和腺管上皮；徐鹰妮等[14]研究发现，人乳腺组织内ERα局限表达于乳腺腺泡上皮细胞的细胞核。ERα在不同哺乳动物乳腺组织内的分布差异，其原因可能是牦牛与济宁青山羊属于反刍动物，而反刍动物乳腺发育及泌乳机制与其他物种有所不同，具体机制还有待进一步研究。
ERα在乳腺导管和腺泡发育中起重要作用，ERα敲除的小鼠缺乏小叶腺泡结构[15]。研究表明，雌激素受体与雌激素结合之后通过诱导乳腺细胞分泌生长因子[16-17]影响乳腺发育。卵巢雌激素诱导乳腺上皮细胞的增生是由ERα介导的，雌激素首先与以寡聚糖形式存在于细胞质的雌激素受体结合，然后迅速从胞质转移到胞核内，与DNA序列上的反应元件特异性结合，增加细胞膜的通透性和细胞外液的聚集，同时增加血管的流动速度，从而激活激素依赖性基因的转录、翻译、促进细胞分裂、繁殖和生长[18]。本研究发现，在泌乳中期腺泡上皮细胞内ERα的表达较静止期多，由此可推测，ERα参与调控泌乳期乳腺腺泡上皮细胞的增殖。
本研究通过分析ERα蛋白相对表达量发现，在牦牛泌乳中期和静止期乳腺中ERα表达量表现为静止期显著高于泌乳中期，静止期ERα主要分布在结缔组织的脂肪细胞和血管内皮细胞内。泌乳结束后，乳腺在组织重塑和脂肪细胞开始重新填充的双重调控机制下重新恢复到妊娠期前性成熟状态。由此可推测，ERα在静止期的高表达可能是为乳腺结构重塑做准备。
3.2 ERβ在牦牛乳腺组织内的分布特点、阳性细胞分布及蛋白表达ERβ在牦牛的各种组织中都有表达，并且在卵巢中表达最高，子宫和输卵管次之，心、肝、脾、肺、肾、睾丸及乳腺表达较低[8]。大鼠妊娠期乳腺组织中多数细胞表达ERβ，泌乳期和泌乳后期都有ERβ的表达[13]。本研究发现，在牦牛泌乳中期和静止期乳腺组织内都有ERβ的表达，泌乳期ERβ多分布于细胞质，细胞核也少量表达，细胞质内的分布见于腺上皮细胞，细胞核内的分布主要见于小叶间结缔组织内脂肪细胞和血管内皮细胞。这一结果与在人乳腺组织内ERβ的分布一致[15]。ERβ的这种分布表明，ERβ在乳腺组织中起着重要的作用。
人乳腺组织70%~85%的小叶上皮细胞和导管上皮细胞的细胞核内都有ERβ的分布[19]，在小鼠乳腺中ERβ主要表达于腔上皮细胞和基底细胞，在脂肪细胞内低表达[5, 20]。本研究发现与静止期相比，泌乳中期乳腺内ERβ均大量表达于泌乳上皮细胞的细胞质中，而静止期的ERβ则大量表达于小叶间结缔组织内间质细胞及血管内皮细胞的细胞核中，表明ERβ可能参与乳腺组织的结构重塑过程，并在其中发挥作用。
此外，本研究发现牦牛泌乳中期和静止期乳腺中ERβ的光密度值和蛋白相对表达量均呈上升趋势，与Schams等[13]的研究相一致，断乳后荷斯坦奶牛体内有ERβ蛋白高表达，但是基因敲除小鼠试验中发现，妊娠期ERβ敲除小鼠乳腺发育正常[21]，表明ERβ对乳腺早期的发育不起作用，提示ERβ可能在牦牛静止期乳腺重塑的过程中起一定的作用。Saji等[22]在大鼠乳腺不同发育阶段也证实了ERβ蛋白含量明显比ERα高，由此推测，ERβ可能在泌乳后乳腺重塑的过程中所起的作用大于ERα。但在牦牛乳腺内，ERβ具体的作用机制是否与以上学者所分析结果一致，还有待进一步研究。
综上表明，两种雌激素受体在不同时期牦牛乳腺组织内均有表达，但二者发挥作用的侧重点可能有所不同，它们可能通过类似或不同的调控机制及信号传导通路与雌激素结合而发挥相应的作用。
4 结论通过观察牦牛乳腺雌激素受体的分布并测定其蛋白相对含量，发现ERα和ERβ在泌乳中期和静止期牦牛乳腺组织内均有表达且分布不同，提示雌激素受体不同亚型在牦牛乳腺发育及乳腺结构重塑中可能执行不同的功能。乳腺内雌激素受体的分布及含量随牦牛生理期的改变而发生变化，说明ERα和ERβ在组织内的分布及含量的改变对不同发育期牦牛乳腺生理作用有不同程度的影响。
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