2. 内蒙古农业大学 动物科学学院, 呼和浩特 010018;
3. 内蒙古农业大学 兽医学院, 呼和浩特 010018;
4. 内蒙古农业大学 职业技术学院, 包头 014109
2. College of Animal Science, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China;
3. College of Veterinary Medicine, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China;
4. Vocational and Technical College of Inner Mongolia Agricultural University, Baotou 014109, China
致病性大肠杆菌(pathogenic Escherichia coli，E. coli)对人类和畜禽的危害以及对养殖业造成的经济损失日益严重[1-3]。致病性E. coli对婴幼儿和新生幼畜禽的危害极大，其主要感染症状为腹泻，临床上的主要防治措施为抗生素治疗。但近年来，因抗生素滥用而显现的多种毒副作用(如病原菌耐药性的增加、抗生素残留、破坏肠道微生态等)而被人们所排斥[4-5]。因此，为了减少或禁止使用抗生素，科研工作者们开始致力于寻求抗生素替代品的研发。在此过程中，研究者们发现，蒙药具有抗菌消炎、提高机体免疫力，可解决抗生素无法解决的药物残留问题，且蒙药可通过维持内环境动态平衡而达到防治疾病的目的[6]。
目前，具有鲜明民族特色和神奇功效的蒙药因其地域性和民族性加之由于缺乏资金和人才，长期以来一直致力于人类疾病防治，而关于用作兽药的研究一直处于低级开发状态。前期研究发现，蒙药对各种血清型、各种来源的致病性E. coli有良好的体外抑菌作用，但对肠黏膜屏障的作用影响还未进行深入研究。因此，为探索和研究蒙药复方对体内病原菌的抗菌作用，笔者选取前期筛选出的体外抑菌效果最佳的蒙药复方，研究其对急性感染致病性E. coli O1大鼠小肠各段黏膜形态结构、血清D-乳酸和DAO含量以及对回肠黏膜的分泌型免疫球蛋白(sIgA)和肠三叶因子(ITF)含量的影响，即观察蒙药复方对致病性E. coli O1导致的肠黏膜损伤的保护作用，从而为蒙兽药的研发、应用和蒙药替代抗生素的可行性提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 菌株和药物O1血清型牛源野生致病性E. coli是内蒙古农业大学动物科学学院动物生产组实验室分离鉴定保存的致病性菌株。
蒙药复方阿如拉-7味散是内蒙古农业大学动物科学学院动物生产组实验室自制研发复方。阿如拉-7味散(朝您·哈日莫各、给喜古讷、阿如拉、当棍、毛好尔-查干、古日古木和浑钦，比例为2:1:2:2:2:2:2)中各单味蒙药分别进行粉碎，过100目药筛，按比例将单味蒙药粉进行混合，备用。阿如拉-7味散现用现配。
1.2 主要仪器生化培养箱(型号为JC-SPJ-480)，济南精诚实验仪器有限公司；酶标仪，美国BioTek公司；石蜡切片机(型号为YD-1508R)，浙江金华益迪医疗设备厂；光学显微镜(型号为XSP-8CA)，上海光学仪器厂；明美显微数码成像系统，日本Olympus公司。
1.3 主要试剂营养琼脂培养基、肉汤培养基等购自广东环凯微生物科技有限公司；生理盐水，曙红Y，苏木精染液，冰醋酸，无水乙醇，石蜡等购于上海国药试剂有限公司；D-乳酸和血清二胺氧化酶(DAO)、分泌型免疫球蛋白(sIgA)和肠三叶因子(ITF)ELISA试剂盒，购于南京博尔迪生物科技有限公司。
1.4 菌株的复苏与纯化致病性E. coli O1菌株使用前依次经麦康凯、伊红美蓝培养后经营养琼脂纯化3次，使得培养基上菌落生长状况及菌落形态特征趋于一致，并与典型菌落描述特征相符时即获得纯培养物。将获得的纯致病性E. coli O1接种于普通营养琼脂斜面上，37 ℃培养24 h，4 ℃冰箱保存备用。使用时将菌液配成80%最低致死量浓度(致病性E. coli O1对大鼠80%最低致死量浓度为1.50×1011 CFU·mL-1)。
1.5 试验动物与分组60只SD大鼠，6~8周龄，体重200 g±20 g，随机分为6组，分组情况及给药方案见表 1。除空白对照组外，其余5组在第4天末次给药/蒸馏水1 h后，腹腔注射80%最低致死量(minimum lethal dose，MLD)的E.coli O1，形成急性感染和炎症。
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表 1 试验方案 Table 1 Experimental protocol |
试验结束时观察各组大鼠的死亡情况，并计算保护率。保护率=(未治疗组死亡数-处理组死亡数)/未治疗组死亡数×100%[7]。
1.7 取材与处理试验第7天对各组大鼠进行心脏采血(分离血清检测D-乳酸和DAO活性)后立即颈椎脱臼处死，外科手术方法打开腹腔，迅速取出十二指肠、空肠和回肠各2 cm左右，迅速用4 ℃生理盐水冲洗内容物，放入10%福尔马林中固定。另取回肠黏膜，待检测sIgA和ITF含量。
1.8 切片制备及观察常规制备石蜡切片，厚6 μm连续切片，每隔5张切片取1张，进行常规HE染色。在光学显微镜下对制备好的石蜡切片进行病理组织学观察，并用明美显微数码成像系统拍照，测量小肠绒毛高度，隐窝深度以及肌层厚度。本试验中每个肠段取不连续的3张切片，每张切片选取5个最长绒毛、最深隐窝及最厚肌层进行记录。
1.9 血清D-乳酸、DAO和回肠黏膜sIgA和ITF含量检测详细步骤按ELISA试剂盒说明书进行。
1.10 数据处理所有数据用x±s表示。采用SAS 9.0统计软件ANOVA对数据进行方差分析，P < 0.05为有显著性差异。
2 结果 2.1 保护率测定由表 2可知，环丙沙星组与阿如拉-7味散中剂量组大鼠的保护率一致，为50.0%；阿如拉-7味散高和低剂量组保护率分别为37.5%和25.0%。
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表 2 试验结束时各组大鼠剩余情况 Table 2 Survival rats in each group at the end of the experiment |
由图 1~3可以看出，空白对照组大鼠十二指肠、空肠和回肠的绒毛排列整齐、紧密，且无上皮细胞脱落，其黏膜完整(图 1~3A)。未治疗组大鼠十二指肠和空肠绒毛矮短并水肿，而回肠出现绒毛和上皮细胞断裂脱落，为损伤最严重的小肠段(图 1~3B)。环丙沙星组小肠各段(图 1~3C)接近空白对照组小肠各段形态。阿如拉-7味散高、低剂量组大鼠小肠各段(图 1~3D、F)出现不同程度的绒毛肿胀及部分脱落，但回肠与未治疗组相比绒毛和上皮细胞断裂脱落有所好转，而十二指肠和空肠无明显变化。阿如拉-7味散中剂量组大鼠小肠各段形态(图 1~3E)与环丙沙星组和空白对照组相比，小肠组织形态接近或更好。由此可知，阿如拉-7味散对感染致病性E. coli O1大鼠损伤的肠黏膜形态有一定的改善或修复作用，其中中剂量效果最佳。
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A.空白对照组；B.未治疗组；C.环丙沙星组；D.阿如拉-7味散高剂量组；E.阿如拉-7味散中剂量组；F.阿如拉-7味散低剂量组。下图同 A. Control group; B. Untreated group; C. Ciprofloxacin group; D. Arula-7 powder high dosage group; E. Arula-7 powder medium dosage group; F. Arula-7 powder low dosage group. The same as below 图 1 各组大鼠十二指肠组织形态变化(HE染色, 200×) Figure 1 Morphology changes of the duodenum in rats of each group (HE staining, 200×) |
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图 2 各组大鼠空肠组织形态变化(HE染色, 200×) Figure 2 Morphology changes of the jejunum in rats of each group (HE staining, 200×) |
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图 3 各组大鼠回肠组织形态变化(HE染色, 200×) Figure 3 Morphology changes of the ileum in rats of each group (HE staining, 200×) |
由图 4可知，未治疗组小肠各段绒毛长度与空白对照组相比均显著减小(P < 0.05)，表明感染E. coli O1会严重损害肠黏膜；环丙沙星组和阿如拉-7味散中剂量组十二指肠、空肠和回肠的绒毛长度与空白对照组相比均无显著差异(P>0.05)，表明其治疗效果显著；与未治疗组相比，阿如拉-7味散高、低剂量组十二指肠和空肠绒毛长度无显著增加(P>0.05)，而回肠绒毛长度比未治疗组显著增高(P < 0.05)。
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同一肠段不同组柱状图上标的字母不同表示差异显著(P < 0.05)。下图同 In the same intestine segments of each group, the different letter on the top of histograms mean significant difference (P < 0.05). The same as below 图 4 各组大鼠小肠绒毛长度的变化 Figure 4 Villus length of the small intestine of rats in each group |
由图 5可知，除阿如拉-7味散低剂量组外其余4组的十二指肠隐窝深度与未治疗组相比无显著差异(P>0.05)，而各组空肠和回肠隐窝深度均有显著差异(P < 0.05)。
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图 5 各组大鼠小肠隐窝深度的变化 Figure 5 Crypt depth of the small intestine of rats in each group |
由图 6可知，除阿如拉-7味散高剂量组外其余4组十二指肠绒毛长度/隐窝深度(V/C)与未治疗组相比均显著提高(P < 0.05)；而空肠V/C值各组间均有显著差异(P < 0.05)；与未治疗组相比，各组回肠V/C值均显著提高(P < 0.05)。
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图 6 各组大鼠小肠绒毛长度/隐窝深度的变化 Figure 6 The villus length/crypt depth of the small intestine of rats in each group |
由图 7可知，与未治疗组相比，各处理组十二指肠和空肠肌层厚度均显著提高(P < 0.05)，而各组间回肠肌层厚度无显著差异(P>0.05)。
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图 7 各组大鼠小肠肌层厚度的变化 Figure 7 Muscular layer thickness of the small intestine of rats in each group |
由表 3可知，除环丙沙星组外其余各组与空白对照组相比D-乳酸含量均显著增高(P < 0.05)，其中增高幅度最大的为阿如拉-7味散低剂量组，增高幅度最小的为阿如拉-7味散中剂量组；除阿如拉-7味散高、中剂量组外其余3组与空白对照组相比DAO含量均显著增高(P < 0.05)，其中增高幅度最大的为未治疗组，增高幅度最小的为环丙沙星组。
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表 3 各组大鼠血清D-乳酸和DAO含量的变化(x±s) Table 3 Changes of serum D-lactic acid and DAO levels of rats in each group (x±s) |
由表 4可知，未治疗组与空白对照组相比大鼠回肠黏膜sIgA含量显著降低(P＜0.05)，而与未治疗组相比，除阿如拉-7味散低剂量组外其余给药组大鼠回肠黏膜sIgA含量显著增加(P＜0.05)。由此可见，阿如拉-7味散能够提高感染致病性E.coli O1大鼠肠黏膜的特异性免疫功能。
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表 4 各组大鼠回肠黏膜sIgA和ITF含量的变化(x±s) Table 4 Changes of ileal mucosa sIgA and ITF levels of rats in each group(x±s) |
未治疗组与空白对照组相比大鼠回肠黏膜ITF含量显著降低(P < 0.05)；各给药组大鼠回肠黏膜ITF含量与未治疗组相比均显著提高(P < 0.05)，其中阿如拉-7味散中剂量和环丙沙星组ITF含量与空白对照组无显著性差异(P>0.05)。由此可见，阿如拉-7味散能够显著改善或修复受损的肠黏膜化学屏障，其中中剂量效果最佳。
3 讨论本研究中，阿如拉-7味散中剂量对感染致病性E. coli O1大鼠有一定的保护效果。研究报道，传统蒙药复方巴布-7对4种血清型混合大肠杆菌感染小鼠有较好的保护性，其保护率比环丙沙星高，达到87.5%[8]。战永波[9]研究发现，蒙药复方对奶牛乳源致病性大肠杆菌和金黄色葡萄球菌两种混合菌感染小鼠的保护率可达75%。本试验中蒙药复方阿如拉-7味散对感染牛源野生致病性E. coli O1大鼠有保护性，其中中剂量的保护效果最好，保护率达50%，与抗生素环丙沙星相当。但保护率远不如以上两个报道的结果，其原因可能与复方成分的不同、致病菌来源与其毒力的不同和试验中采用的动物种类的不同等条件均有关。
临床上，关于中草药对大肠杆菌所导致的腹泻取得良好治疗效果的例子很多，而关于蒙药复方的研究极少。研究发现，中草药复合制剂对感染肠毒素大肠杆菌引起的仔猪腹泻有显著的治愈率，且对小肠黏膜形态结构有保护作用[10]；王东旭[11]研究报道，白头翁散可显著降低大肠杆菌性仔猪黄白痢及死亡率。陈鹏举[12]研究发现，由穿心莲、黄芩和野菊花组成的穿黄散可显著提高人工感染和自然感染大肠杆菌鸡的治愈率。关于蒙药复方对致病性E. coli所致腹泻或其余疾病方面的研究极少。肠黏膜不仅是消化吸收营养物质的基本结构，更是肠道屏障功能的结构基础[13-14]。小肠绒毛高度、隐窝深度、V/C值、肠壁厚度等指标可反映肠黏膜组织学形态，是衡量机体健康与否和小肠消化吸收功能的重要指标[15]。隐窝是存在于小肠绒毛间的绒毛新细胞来源，而绒毛高度/隐窝深度(绒腺比)综合反映小肠的功能状态[16]。本研究发现，蒙药复方阿如拉-7味散可对致病性E. coli O1引起的肠黏膜损伤起到良好的修复作用，与中草药有相同的治疗效果，其中阿如拉-7味散中剂量对损伤黏膜的修复效果与抗生素环丙沙星效果相当。而阿如拉-7味散高、低剂量组的效果远不如中剂量组，其原因可能为药物浓度过高会产生副作用，浓度过低起不到疗效。而中剂量为最适宜剂量。蒙药具有抗菌消炎、提高机体免疫力等作用，其对肠道的损伤修复可能通过提高大鼠自身免疫机能使其逐渐恢复，其机制有待于进一步研究。
D-乳酸是细菌发酵的代谢产物。因哺乳动物体内无D-乳酸脱氢酶，因而，如在血液中检测出D-乳酸，表明肠黏膜生物屏障受损。因此，血液D-乳酸含量变化可反映肠黏膜是否受损或通透性是否增加[17]。本研究中，阿如拉-7味散各剂量组与未治疗组相比，D-乳酸含量显著提高，虽其效果不及环丙沙星，但在3个剂量组中以中剂量效果最好，表明致病性E. coli O1感染大鼠后导致黏膜受损并使其通透性增加，而蒙药复方阿如拉-7味散对肠黏膜具有一定的保护作用。
当肠黏膜上皮细胞受损时，哺乳动物肠黏膜上层绒毛细胞胞质中具有高度活性的细胞内酶——二胺氧化酶(DAO)释放量增加，进入细胞间隙、淋巴管和血流，使血浆DAO升高。DAO活性在外周血中稳定，因此是反映黏膜上皮细胞成熟度和完整性的血浆标志物[18]。本研究中，阿如拉-7味散中剂量组的DAO含量与空白对照组无显著性差异，与未治疗组差异显著。由此可知，致病性E. coli O1感染时，肠黏膜上皮细胞受损，血液中DAO含量增加；用蒙药复方阿如拉-7味散治疗后DAO活性降低，表明黏膜上皮细胞损伤程度降低，起到保护肠黏膜的作用，其中阿如拉-7味散中剂量效果最佳。
肠三叶因子(intestinal trefoil factor，ITF)是组成肠黏膜化学屏障的重要组成成分，是一种黏液，由肠道杯状细胞分泌。ITF一方面促进肠黏膜细胞增殖，另一方面与肠黏液中的黏蛋白相结合，从而对肠黏膜屏障起稳定和维护作用。因此，在肠道修复和减轻损伤方面有着重要意义[19]。分泌型免疫球蛋白(sIgA)主要分布在黏膜或浆膜表面，是肠黏膜表面主要免疫效应分子，是机体黏膜防御系统的主要成分。sIgA是机体防止病原微生物入侵的第一道防线，因其可与糖蛋白相互配合，将有害菌包绕使其限制于黏液层中，并随黏液层的更新和流动将包绕的病原菌排除[20]。研究报道，ITF可显著提高肠上皮细胞的存活率，并降低受损肠黏膜炎症程度[21]。孙必强等[22]研究表明，七味白术散可显著提高肠道菌群失调小鼠肠黏膜sIgA的表达。苏敏等[23]研究报道，肠安Ⅱ号方可显著提高肠易激综合征大鼠肠管内壁黏液中sIgA水平。本研究中，未治疗组与空白对照组相比回肠黏膜ITF含量显著降低(P < 0.05)，各药物处理组与未治疗组相比回肠黏膜ITF含量均显著升高(P < 0.05)，其中阿如拉-7味散中剂量组和环丙沙星组与空白对照组相比，回肠黏膜ITF含量无显著性差异(P>0.05)。表明阿如拉-7味散尤其是中剂量，能够提高回肠黏膜ITF含量，从而促使ITF与糖蛋白结合形成凝胶，增强肠黏膜防御功能，促进肠上皮细胞增殖、移行，加速损伤修复，保持肠黏膜的完整性，从而减轻免疫所致的肠道炎症反应。当大鼠感染致病性E. coli O1时回肠黏膜sIgA含量与空白对照组相比显著下降(P < 0.05)，阿如拉-7味散各剂量组与未治疗组相比回肠黏膜sIgA含量均显著提高(P < 0.05)。由此认为，致病性E. coli O1能引起肠道局部免疫功能受损，而阿如拉-7味散能够减轻或修复此种损伤。
4 结论蒙药复方阿如拉-7味散可明显改善或修复因感染致病性E. coli O1而导致的肠黏膜损伤，其中中剂量0.54 g·kg-1效果最佳。
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