大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)是我国特有的珍稀濒危动物，为国家一级重点保护动物，是当之无愧的世界生物多样性保护旗舰物种[1]。野生大熊猫分布于我国四川、陕西和甘肃省的邛崃、岷山、大相岭、小相岭、凉山及秦岭山系[2-3]。西氏贝蛔虫(Baylisascaris schroederi)是野生及圈养大熊猫胃肠道内最常见的寄生虫，野生大熊猫感染率可达100%[4-5]。营养掠夺、幼虫移行损伤以及虫体造成的肠梗阻等机械损伤是该蛔虫危害大熊猫的主要方式[3, 6-7]。大熊猫西氏贝蛔虫病多伴随有肠道阻塞、内脏幼虫移行症(VLM)、胰腺炎和胆囊炎等，蛔虫感染是造成大熊猫死亡的主要原因之一[8-9]。因此，开展大熊猫的西氏贝蛔虫防控及相关研究对该物种的保护具有重要意义。
寄生虫的分泌蛋白能起到刺激宿主免疫、感染与寄生等关键作用[10]。迄今有关大熊猫西氏贝蛔虫功能基因的研究，仍然十分有限[9, 11-15]。同时，目前也尚无西氏贝蛔虫抗菌肽的相关研究报道。笔者在进行西氏贝蛔虫基因组与转录组研究过程中，通过分泌组学分析发现了一个高表达的抗菌肽类基因(scaffold126_size457045，未发表)，暂定名为BsABF基因(Baylisascaris schroederi antibacterial factor)。为进一步探讨该基因的分子特征及生物学功能，本研究通过克隆和原核表达西氏贝蛔虫BsABF基因，分析rBsABF的免疫原性以及该分泌蛋白在虫体内的分布，并通过抗菌试验初步评估其抗菌活性。
1 材料与方法 1.1 试验材料总RNA抽提试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒小量抽提试剂盒和HRP-DAB底物显色试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒、总蛋白提取试剂盒购自上海BestBio贝博生物有限公司；DNA Marker、Protein Marker、限制性内切酶(BamHⅠ、EcoRⅠ)、T4 DNA连接酶购自大连宝生物工程有限公司；羊抗兔HRP-IgG、羊抗兔FITC-IgG购自武汉博士德生物工程有限公司；兔抗熊猫HRP-IgG由四川成都正能生物科技有限公司帮助制备；逆转录试剂盒、Ni2+螯合亲和层析柱、HiTrap Protein A预装柱购自美国Bio-Rad公司。PCR引物合成和测序由成都擎科梓熙生物技术有限公司完成。
西氏贝蛔虫活虫采集于碧峰峡大熊猫基地及成都大熊猫基地，收集于熊猫呕吐物及排泄物，清洗后于液氮中保存待用。大熊猫源小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)和大肠杆菌(Escherichia coli)由本校动物微生物实验室颜其贵教授惠赠。大熊猫西氏贝蛔虫病阳性血清及阴性血清，均采集于成都大熊猫繁育研究基地。所有血清于-70 ℃保存待用。两只新西兰兔(3~4月龄、1.8~2.0 kg)购自达硕实验动物公司。
1.2 生物信息学分析以在线软件ExPaSy(http://www.expasy.org)预测蛋白相对分子质量、稳定性、亲疏水性等理化性质；以在线软件Signal IP预测其信号肽(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)；推导对应氨基酸序列后以NCBI BLAST匹配同源序列(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。用DNAMAN软件比较以下同源基因，同源基因来源：大熊猫西氏贝蛔虫BsABF基因(GenBank：scaffold126_size457045，未释放)、猪蛔虫同源基因(GenBank：BAA89493.1)、犬弓首蛔虫同源基因(GenBank：KHN74506.1)、锡兰钩口线虫同源基因(GenBank：EYC28886.1)、秀丽隐杆线虫同源基因(GenBank：BAA89492.1)以及捻转血矛线虫同源基因(GenBank：CDJ84719.1)。
1.3 目的基因BsABF的克隆、表达与纯化以除去信号肽序列的BsABF序列为模板设计特异性引物(上游引物5′-CGCGGATCCATCGACTTCTCCACATGCGC-3′，下划线处为BamHⅠ酶切位点；下游引物5′-CGCCTCGAGTTAGCGTCCCTTTCCCTTTTT-3′，下划线处为XhoⅠ酶切位点)。以cDNA为模板进行PCR扩增，反应条件为预变性95 ℃ 5 min，变性95 ℃ 40 s，退火58 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，35个循环，72 ℃延伸10 min，8 ℃储存。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测、琼脂糖凝胶回收试剂盒回收后克隆于pMD19-T载体，构建pMD19-T-BsABF重组质粒，经菌液PCR和双酶切鉴定后测序。对测序正确的pMD19-T-BsABF重组质粒、pET-32a(+)质粒双酶切后回收，经T4 DNA连接酶连接后转入大肠杆菌DH5α中构建pET-32a(+)-BsABF重组菌。PCR鉴定后测序，使用质粒小量抽提试剂盒提取测序正确的pET-32a(+)-BsABF重组质粒，转入表达菌BL21(DE3)中，菌液PCR鉴定后测序。扩大培养测序正确的pET-32a(+)-BsABF表达菌，并于1.0 mmol·L-1 IPTG、16 ℃条件下诱导12 h。诱导后的菌液经离心，收集菌体超声裂解，收集上清液并以Ni2+亲和层析方法纯化表达产物；重组蛋白纯化后通过BCA法测定其浓度。
1.4 兔抗rBsABF-IgG为制备rBsABF多克隆抗体，对两只新西兰兔进行皮下注射免疫。在免疫前采集兔健康血清作为对照血清。共进行四次免疫，每次免疫间隔两周。每次免疫蛋白量为200 μg，第一次与弗氏完全佐剂1:1混合，后三次与弗氏不完全佐剂1:1混合。对两种血清均使用HiTrap蛋白A亲和层析纯化。
1.5 免疫印迹和免疫荧光定位根据总蛋白提取试剂盒操作说明，取适量的西氏贝蛔虫充分研磨后，加入总蛋白提取液，用组织匀浆器匀浆至无明显肉眼可见固体，将组织匀浆吸入一预冷的干净离心管中，在4 ℃条件下振荡10~20 min，然后在4 ℃、1 000 g条件下离心15 min后，吸上清即得到粗蛋白，保存于-80 ℃备用。纯化后的rBsABF和西氏贝蛔虫虫体粗提蛋白经SDS-PAGE分离后电转至硝酸纤维素滤膜(NC膜)上，5%脱脂奶粉室温封闭2 h后分别使用大熊猫西氏贝蛔虫阳性血清及阴性血清(1:100稀释)，兔抗rBsABF-IgG、健康兔IgG(1:200稀释)作为一抗孵育rBsABF，使用兔抗rBsABF-IgG、健康兔IgG(1:200稀释)作为一抗孵育西氏贝蛔虫虫体粗提蛋白。充分洗涤后分别加入HRP标记兔抗熊猫二抗和羊抗兔HRP-IgG(1:2 000稀释)作为二抗室温孵育2 h，使用HRP-DAB底物显色试剂盒显色。
4%多聚甲醛固定的西氏贝蛔虫雌虫成虫经石蜡包埋、切片处理(4 μm·片-1)、光学显微镜下观察筛选得到结构完整的切片。切片经二甲苯脱蜡、梯度酒精水化、柠檬酸缓冲液热修复、3%H2O2氧化修复后滴加5%牛白蛋白溶液(BSA)室温封闭1 h，分别滴加兔抗rBsABF-IgG和兔阴性血清IgG(1:100稀释)作为一抗于4 ℃孵育过夜。洗涤后以羊抗兔FITC-IgG(0.1%伊文氏蓝1:100稀释)作为二抗，4, 6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色剂对虫体细胞核显色，甘油缓冲液封片后荧光显微镜下观察蛋白的分布并拍照记录。
1.6 抗菌活性测定参考Kato等[16]、Zhang等[17]及Chang等[18]的方法，于LB液体培养基培养大熊猫源菌；试验设置三组，分别为空白对照组(LB+PBS)、阴性对照组(菌液+PBS)及试验组(菌液+PBS+蛋白，蛋白终浓度分别为1.5、0.75、0.375、0.188、0.094 mg·mL-1)；每组三次重复。于37 ℃培养8 h，每隔1 h测量OD650 nm。
2 结果 2.1 BsABF基因的扩增和生物信息学分析BsABF完整序列长276 bp，ORF为276 bp，编码91个氨基酸，预测相对分子质量为9.38 ku；前19个氨基酸残基为信号肽，切除信号肽后蛋白大小约为7 ku。根据BLAST结果，BsABF序列与猪蛔虫序列(GenBank：BAA89493.1)相似性最高，为94%；与犬弓首蛔虫序列(GenBank：KHN74506.1)相似性为73%；与锡兰钩口线虫序列(GenBank：EYC28886.1)相似性为62%；与秀丽隐杆线虫序列(GenBank：BAA89492.1)相似性为62%；与捻转血矛线虫序列(GenBank：CDJ84719.1)相似性为61%(图 1)。
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信号肽段用蓝色长方块标出。抗原表位由绿色长方块标出 The signal peptide is marked with the blue box. B cell epitopes are showed with green boxes 图 1 BsABF多序列比较 Figure 1 Multiple sequence alignment of BsABF |
重组蛋白纯化后经SDS-PAGE显示为单一条带，大小约为27 ku左右(图 2)，符合预期(包含标签蛋白)。免疫印迹结果显示，rBsABF能够被兔抗rBsABF-IgG及大熊猫西氏贝蛔虫阳性血清单一识别，阴性对照组无条带，说明rBsABF免疫原性较好。以兔抗rBsABF-IgG识别西氏贝蛔虫粗蛋白提取物，显示有单一条带(图 2)。
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M.蛋白质相对分子质量标准；1.IPTG诱导大肠杆菌BL21表达重组BsABF；2.纯化后的rBsABF；3.兔抗rBsABF-IgG孵育rBsABF；4.健康兔IgG孵育rBsABF；5.大熊猫西氏贝蛔虫阳性血清孵育rBsABF；6.大熊猫西氏贝蛔虫阴性血清孵育rBsABF；7.兔抗rBsABF-IgG孵育西氏贝蛔虫粗蛋白提取物；8.健康兔IgG孵育西氏贝蛔虫粗蛋白提取物 M. Protein marker; 1. Lysate of IPTG-induced E. coli BL21 (DE3) expressing recombinant B. schroederi ABF (rBsABF); 2. Purified rBsABF; 3. Purified rBsABF incubated with rabbit anti-rBsABF-IgG; 4. Purified rBsABF incubated with native rabbit IgG; 5. Purified rBsABF incubated with panda positive sera; 6. Purified rBsABF incubated with panda nagative sera; 7. B. schroederi extracts incubated with rabbit anti-rBsABF-IgG; 8. B.schroederi extracts incubated with native rabbit IgG 图 2 rBsABF纯化及免疫印迹分析 Figure 2 Purification of rBsABF and Western blot analysis |
荧光免疫组化显示，BsABF蛋白主要分布于雌虫成虫表皮层，皮下肌肉层及肠道内壁，呈广泛分布；在生殖系统中，仅在虫卵分布较为明显(图 3)。
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A、B.兔抗rBsABF-IgG孵育(40×)，阳性试验组；C.兔抗rBsABF-IgG孵育(100×)，阳性试验组；D.健康兔IgG孵育(40×)，阴性对照组. Hd.角皮; Mu.肌肉; Gu.肠道; Ov.卵巢; Ow.卵巢壁; Ut.子宫; Eg.虫卵 A, B. Incubated with rabbit anti-rBsABF-IgG (40×), positive; C. Incubated with rabbit anti-rBsABF-IgG (100×), positive; D. Incubated with native rabbit IgG (40×), negative. Hd. Hypodermis; Mu. Muscle; Gu. Gut; Ov. Ovary; Ow. Ovary wall; Ut. Uterus; Eg. Eggs 图 3 BsABF蛋白在西氏贝蛔虫雌虫成虫虫体上的免疫荧光定位 Figure 3 Immunofluorescence localization of BsABF in adult female B. schroederi |
根据每小时所测得的菌液OD650 nm绘制折线图。在小肠结肠炎耶尔森菌试验组内，空白组数值恒定；阴性对照组与试验组折线几乎重叠，rBsABF没有表现出抗菌能力(图 4A)。在粪肠球菌试验组内，空白组数值恒定；阴性对照组折线高于试验组；在试验组内，0.75 mg·mL-1浓度时抗菌能力最好(图 4B)。在大肠杆菌试验组内，空白组数值恒定；阴性对照组折线高于试验组，在试验组内，1.5 mg·mL-1浓度时抗菌能力最好(图 4C)。
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A.小肠结肠炎耶尔森菌；B.粪肠球菌；C.大肠杆菌 A. Yersinia enterocolitica; B. Enterococcus faecalis; C. Escherichia coli 图 4 对小肠结肠炎耶尔森菌、粪肠球菌、大肠杆菌抗菌能力验证 Figure 4 The antimicrobial activity of BsABF to Yersinia enterocolitica, Enterococcus faecalis, Escherichia coli at different concentrations in vitro |
当生存环境发生变化、遭受细菌攻击时，无脊椎动物主要通过组织屏障、抗菌肽类物质(antimicrobial peptides, AMPs)等先天免疫成分进行自身防护[19-20]，以此适应环境变化，抵御外界细菌侵害。西氏贝蛔虫(无脊椎动物之一)组织屏障系由表皮层与较厚的肌肉层构成其组织屏障，可以有效地抵御外来入侵，同时大面积的表皮可进行电解质交换，从而维持其在肠道内的体液平衡。抗菌肽是一类由外源微生物诱导产生、发挥非特异性免疫功能的小分子多肽，具有抗细菌、真菌、抑制癌症细胞等活性，是先天性免疫的重要组成部分[21]，为抵御外源微生物的入侵提供了最初的防护[22]，同时还具有免疫刺激和免疫调节能力[23]。现已在哺乳动物、植物、昆虫等生物体内发现超过1 500种抗菌肽[24]，且某些种类已证明具有离体广谱抑制细菌、真菌活性[25-26]，以及破坏原生动物、病毒的能力[27-28]。抗菌肽可破坏细胞膜、抑制某些重要蛋白合成、干扰DNA复制、抑制酶活或干扰能量代谢等[29-31]，某些也具有肿瘤细胞毒性[32-34]。
由于抗菌肽生物学功能的多样性，如今已成为领域研究的重点与热点。在本研究中，笔者首次鉴定了一个西氏贝蛔虫的抗菌肽基因，并将其命名为BsABF，同时对其进行克隆、表达、纯化以及生物学特性的研究。BsABF基因与猪蛔虫同源基因序列相似性高达94%，表明其与猪蛔虫ASABF基因的生物学功能具有相似性。在对比的几个同源序列中，各物种信号肽后存在一部分高保守区域，这部分可能构成抗菌肽的活性位点，同时可能与其抗菌活性有关。西氏贝蛔虫抗菌肽编码91个氨基酸，预测相对分子质量小于10 ku，相对分子质量大小决定了其在蛋白运输过程中的难易程度，与蛋白的结合能力也有密切联系。
兔抗rBsABF-IgG与大熊猫阳性血清均能识别重组蛋白rBsABF，表明该蛋白具有良好的反应性。免疫定位结果显示BsABF蛋白在西氏贝蛔虫雌虫体壁、肠道及虫卵广泛分布，这与猪蛔虫ASABF分布相似[35]。西氏贝蛔虫成虫生活在肠道中，以宿主肠道内容物为食[36]，体壁、消化系统与子宫均与其消化道环境直接接触，最容易受到肠道内细菌的侵袭，该蛋白在这些部位的广泛分布与西氏贝蛔虫的自身防护有关。BsABF存在于蛔虫抵抗细菌的第一层防线，并发挥其抗菌能力，保护西氏贝蛔虫不受细菌侵害。在蛔虫虫卵成熟排出后，虫卵内丰富的BsABF蛋白可抵抗大熊猫粪便及外界环境中的细菌，保护虫卵的生存与发育。
在生活史中存在多菌环境的寄生虫大多带有抗菌肽基因，且宿主、寄生虫与微生物形成了相互作用的系统[37]。以模式生物秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)为例，其abf-2蛋白主要分布于咽部，重组蛋白则对革兰阳性菌、革兰阴性菌及酵母均有杀菌活性[16]。猪蛔虫天然蛋白(cecropin P1、P2、P3、P4)具有广谱杀菌活性，对某些细菌及真菌有抗菌活性[38]。另一类抗菌肽ASABF(Ascaris suum antibacterial factor)天然蛋白也表现出了强抗菌活性[39]。由于大熊猫物种珍贵，获取西氏贝蛔虫的数量有限，为天然BsABF蛋白的获取带来很大困难，同时体外原核表达易于获得大量的重组蛋白，因此本研究采用西氏贝蛔虫重组蛋白rBsABF测定其抗菌活性。
大熊猫以竹为主食，肠道消化大量的纤维需要丰富的菌落群体，肠道菌群的构成可能与大熊猫的饮食、消化等有关。在圈养大熊猫及野生大熊猫肠道内优势菌群为肠杆菌及肠球菌，其中大肠杆菌检出率为100%[40]。在本研究中，笔者选用大熊猫源三个肠道优势菌(包括小肠结肠炎耶尔森菌、粪肠球菌和大肠杆菌)作为抗菌活性测定对象；抗菌试验结果表明，该蛋白对粪肠球菌和大肠杆菌均具有一定的抗菌活性，且都具有浓度依赖性，对粪肠球菌的最佳抑菌蛋白浓度为0.75 mg·mL-1，对大肠杆菌的最佳抑菌蛋白浓度为1.5 mg·mL-1，蛋白抑菌浓度的差异可能与细菌结构对于抗菌物质的敏感性及抗菌肽蛋白的选择性有关[41]。本研究首次鉴定了西氏贝蛔虫抗菌肽基因，初步探究了其生物学特性，并通过体外抑菌试验研究了其抑菌活性，为深入研究该蛔虫抗菌肽与大熊猫肠道菌群的相互作用以及抗菌肽类药物的开发提供了参考。
4 结论首次鉴定大熊猫西氏贝蛔虫BsABF基因，初步对其生物学特性进行分析。重组蛋白rBsABF具有良好的免疫反应性，BsABF蛋白主要分布于西氏贝蛔虫雌虫成虫的体壁、肠道及虫卵等部位，这与西氏贝蛔虫的自身防御密切相关。抑菌试验表明重组蛋白rBsABF具有一定的抗菌活性，为今后深入研究该蛋白的功能特性奠定了基础。
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