猪链球菌(Streptococcus suis，SS)是一种革兰阳性菌，在全球范围内广泛流行，严重危害生猪养殖业。根据细菌荚膜多糖分子的组成及构型差异，将猪链球菌分为30个血清型(1-31、33和1/2、Chz^[1])，其中，1、2、7、9型在猪链球菌病疫情中分离率较高^[2]。猪链球菌可感染猪引起脑膜炎、败血症、关节炎等，也可感染人引起脑膜炎、感染性休克，严重时可致人死亡^[3-4]，近年来其感染人的事件时有报道。在越南和泰国，猪链球菌感染致成人脑膜炎报道较多^[5-6]，而在我国香港，猪链球菌是引起人细菌性脑膜炎的第三大病原^[7]。猪链球菌病脑膜炎发病型往往病程短、神经症状明显、致死率高，人感染愈后会留下特异性后遗症，如永久性听力受损、前庭功能障碍等^[8]。因此，脑膜炎型的猪链球菌的研究和流行病学调查具有重要的公共卫生学意义。本研究从患脑膜炎仔猪的脑组织中分离到一株猪链球菌，动物试验证实该菌株能够引起单一的脑膜炎症状，其致病性是猪链球菌强毒株HA9801^[9]、05ZYH33^[10]、GZ0565^[11]等的10⁵倍左右。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 病料来源

病料采集于某生猪养殖场，该场断乳仔猪暴发脑膜炎疫情，采集处于濒死期的9只仔猪的心、肝、脾、肺、淋巴结及脑组织用于病原分离。

1.1.2 主要试剂和仪器

THB (Todd-Hewitt broth)培养基购自美国BD公司；无菌绵羊血购自江苏省疾控中心；猪链球菌标准血清由青岛市疾病控制中心惠赠；抗生素购自北京鼎国生物技术有限公司；基因组DNA提取试剂盒购自Omega公司；2×Rapid Taq Master Mix购自南京诺唯赞生物科技有限公司；PCR仪购自美国BIO-RAD公司。

1.1.3 实验动物

BALB/c小鼠，5周龄，雌性，由扬州大学比较医学中心提供。

1.2 方法 1.2.1 细菌的分离与镜检

无菌采集濒死期仔猪的心、肝、脾、肺、淋巴结及脑组织，用接种环蘸取病料，划线接种于含5%绵羊血的THB平板，将平板倒置于37 ℃ CO₂培养箱中，24 h后观察菌落形态，并挑取可疑菌落进行革兰染色鉴定。

1.2.2 猪链球菌种属特异性及血清型鉴定

使用细菌全基因组提取试剂盒提取WH1609全基因组。以此为模板，用16S rRNA通用引物16S-F、16S-R扩增WH1609 16S rRNA特异性片段。PCR程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物送公司测序，测序结果在NCBI上用BLAST比对。以WH1609基因组为模板，分别以水、已确定的猪链球菌为阴、阳性对照，用gdh基因特异性引物gdh-F、gdh-R及recN基因特异性引物recN-F、recN-R扩增猪链球菌特异性片段，PCR程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 10 min，PCR产物进行核酸凝胶电泳。试验所用引物见表 1。

用玻片凝集试验对WH1609进行血清型鉴定。在平板上挑WH1609单菌落，接种于含有1%血清的THB液体培养基中，培养至对数期(OD_600nm值约为0.6)，5 000 r·min^-1离心10 min，弃上清，用灭菌生理盐水洗两遍，随后用相同体积的生理盐水重悬沉淀。将重悬液分别与猪链球菌的33种标准血清进行玻片凝集试验。采用PBS作为阴性对照，本实验室保存的各血清型菌株为阳性对照，观察干净无油载玻片上是否有凝集现象。选用猪链球菌2型、7型、9型特异性引物作进一步验证。

1.2.3 电镜形态观察

将细菌1:50接种于5 mL THB液体中培养至对数期，5 000 r·min^-1离心10 min，弃上清，用PBS洗两遍(重悬时力度要小)，随后沿壁加入1 mL 2.5%戊二醛以固定菌体，送至南京军区总医院病理室电镜中心进行透射电镜观察。

1.2.4 MLST分型

选取WH1609基因组中7个看家基因：dpr、mutS、cpn60、thrA、recA、aroA、gki的核酸序列(WH1609基因组已送公司测序获得全基因组序列)^[12]，通过MLST数据库(http://ssuis.mlst.net)进行比对，根据这7个看家基因的序列号获得等位基因谱(STs), 即对其进行多位点序列分型(multiple locus sequence typing，MLST)。

1.2.5 药敏试验

根据美国临床和实验室标准协会(Clinical and laboratory standards institute, CLSI)标准测定WH1609的最小抑菌浓度(minimal inhibit concentration, MIC)^[13]。首先将抗生素配成浓度为2.56 mg·mL^-1的母液，用0.22 μm的进口滤器除菌，-20 ℃保存备用。在平板上挑单菌落，接种于含有1%血清的THB液体培养基中，培养至对数期，用THB液体将菌液稀释1 000倍。取圆底96孔板，在每行第一个孔中加入180 μL稀释好的菌液，剩余每孔加入100 μL稀释好的菌液。接着在第一孔加入20 μL提前配好的抗生素母液，吹打混匀，取100 μL混合物至第二孔，依次重复，直至最后一孔，使药液依次倍比稀释为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 μg·mL^-1。每种药物做3个重复。将加完样品的96孔板置于37 ℃ CO₂培养箱中培养20 h后观察结果，MIC值以最后一个没有细菌生长的孔所对应的抗生素浓度作为参考。

1.2.6 小鼠毒性试验

本研究采用BALA/c小鼠作为感染模型。将WH1609划线于含5%绵羊血的THB平板，放置CO₂培养箱中培养12~16 h，挑取单菌落接种于THB液体培养基中，培养至对数期，5 000 r·min^-1离心10 min，弃上清，用PBS洗三遍，随后用PBS调整菌液浓度设立8个梯度：5×10⁸~5×10¹ CFU·mL^-1。将80只BALB/c小鼠随机平均分为8组，每组选择一个梯度进行攻毒试验。每只小鼠腹腔注射0.2 mL稀释好的菌液，另外准备6只小鼠腹腔注射0.2 mL PBS作为空白对照。攻毒后每天两次观察小鼠发病情况、临床症状及死亡数量直至攻毒后第7天。本试验重复三次，以Reed-Muench法计算半数致死量(LD₅₀)。随后将20只BALB/c小鼠随机平均分为2组，试验组腹腔注射10倍LD₅₀的菌液(菌液体积为0.2 mL)，空白组腹腔注射0.2 mL PBS。攻毒后每天两次观察小鼠死亡情况直至攻毒后第10天。

1.2.7 组织病理学观察

将攻毒后濒死小鼠及空白对照组小鼠处死固定，取脑组织用多聚甲醛固定，送公司制作病理切片。

2 结果 2.1 细菌的分离与镜检

患病仔猪的脑组织呈弥散性出血(图 1A)，其他脏器无明显病变。从心、肝、脾、淋巴结及脑组织中分离病原，经37 ℃ CO₂培养箱培养24 h，只有接种脑组织的THB血平板上长有白色微透明、光滑湿润、边缘整齐、直径1~2 mm、呈α溶血的单菌落(图 1B)。革兰染色为阳性链球菌，呈链状分布视野(图 1C)，将该链球菌命名为WH1609。

2.2 猪链球菌种特异性及血清型鉴定

用16S rRNA通用引物扩增得到的片段经测序比对，发现WH1609中16S rRNA与NCBI上猪链球菌16S rRNA序列相似性达到99%；用特异性引物gdh-F、gdh-R及recN-F、recN-R扩增得到的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，分别在688及336 bp处出现特异性条带(图 2)，由此鉴定WH1609属于猪链球菌属。

血清凝集试验结果显示WH1609与猪链球菌9型标准血清发生反应，说明WH1609属于猪链球菌9型。

2.3 电镜观察

电镜结果显示WH1609有荚膜状结构，细菌周围有许多絮状物质(图 3)，关于这些絮状物质的功能，笔者将做进一步研究。

2.4 MLST分型

MLST分型结果表明WH1609中的mutS是一个新的等位基因，其余6个看家基因均属于不同的序列号，提示WH1609是属于未报道的新ST型。将NCBI上其他的几株9型进行MLST分型，比较发现WH1609只与D12有两个相同的等位基因，说明WH1609与D12在进化关系上可能最为接近。基于猪链球菌核心基因制作系统发育树(图 4)，进化树分析结果也表明WH1609在亲缘关系上与D12最为接近，与MLST分型结果一致。在相近的进化树分支中，包括GZ0565等9型菌株的进化关系较为接近。

2.5 药敏试验

药敏试验结果显示WH1609对环丙沙星、链霉素、红霉素、多黏菌素B、溶菌素重度耐药，对阿米卡星、乳酸链球菌素、D环丝氨酸、四环素中度耐药，对青霉素、万古霉素及氨苄西林较敏感，具体结果见表 2。研究发现，猪链球菌除了对β内酰胺类抗生素耐药率仍维持在较低的水平外，对四环素类、大环内酯类、氟喹诺酮类等抗菌药的耐药率的变化较大^[14]，与该菌株的耐药性结论较为一致。结论提示猪链球菌新临床分离株的多重耐药现象较为严重，建议加强临床抗生素的使用管理，合理用药，避免产生细菌耐药株。

2.6 小鼠致病性试验

试验组小鼠在攻毒12 h后陆续发生死亡，感染后24 h，发病小鼠出现眼部症状，眼睑湿润肿大，有白色渗出，眼结膜潮红(图 5A)，并出现典型的转圈、共济失调、神经性抽搐等症状。空白对照组小鼠直至试验结束(7 d)未见死亡及异常。统计死亡小鼠的总数量(表 3)，算得LD₅₀为1.89×10²CFU·mL^-1。以10倍LD₅₀的剂量攻毒小鼠，攻毒24 h内死亡5只，48 h内死亡8只，4 d内试验组小鼠全部死亡；空白对照组小鼠未见死亡及异常(图 5C)。根据现有的文献报道，猪链球菌强毒株的半数致死量为1×10⁶~1×10⁸CFU·mL^-1，而WH1609通过腹腔仅仅注射不足200个细菌就能引发小鼠严重的脑膜炎症状，其毒力为经典强毒株毒力的10⁴~10⁶倍，这些数据提示WH1609为猪链球菌强毒株。

2.7 组织病理学观察

解剖死亡小鼠发现空白对照组小鼠脑组织形态正常，感染小鼠脑部有明显的脑膜炎症状，脑组织水肿、出血、充血，表面存在胶冻样物质(图 5B)。脑组织病理切片的结果显示，空白对照组小鼠的神经元排列紧密，胶质细胞形态正常(图 6A)，感染WH1609菌株的小鼠的神经纤维松散无序，血管附近有大量中性粒细胞浸润(图 6B)，脑组织多层结构间出现化脓带，脑组织溶解并出现化脓灶，神经细胞坏死，周围可见小胶质细胞，为典型的噬神经元细胞现象(图 6C)。

3 讨论

猪链球菌是猪的一种重要的细菌病原，猪链球菌的感染在猪群中比较普遍，几乎所有猪场都存在携带猪链球菌的动物，但发病率较低。在大部分猪场，该病的发病率一般小于5%，严重暴发时若缺乏适当的治疗则死亡率较高。猪链球菌病在临床上主要表现为败血症及脑膜炎，此外也会出现心内膜炎、肺炎和关节炎。急性败血症及脑膜炎型病程短，死亡率高；关节炎或淋巴结脓肿型传播缓慢，发病率和死亡率低，但可在猪群中长期流行。自2005年四川暴发猪链球菌疫情以来，我国各地关于猪链球菌感染或发病的报道时常出现。但在近几年的流行病学调查中，并未发现类似WH1609的超强毒力菌株，现有的研究报道中也未发现与其毒力相近似的菌株，故引起WH1609超强毒力的分子机制有待研究。自2005年从上海发病猪体内首次分离到猪链球菌9型后^[15]，9型毒株的检出率呈逐年上升趋势^[16]。倪艳秀等^[17]从正常屠宰猪的扁桃体中分离到一株致病性9型毒株；王淑杰^[18]对东北地区各猪场猪链球菌的感染情况进行调查，从发病猪中分离到1株9型毒株，所以猪链球菌9型作为致病性血清型值得引起重视。作为致病菌，WH1609有进一步研究的价值。

近年来，对于猪链球菌的研究在动物模型方面以及毒力评价方面的研究成果较多。但缺乏单一症状的动物模型和感染菌株。Williams等^[19]最先提出用小鼠建立动物模型，BALB/c小鼠进行猪链球菌的毒力评价在近年来也时有报道^[20-21]。本次试验中WH1609对BALB/c小鼠表现出高致病性，感染小鼠后小鼠会出现转圈、共济失调等神经症状，剖检后也可见小鼠脑组织出现明显的水肿、出血，这些病理现象都与猪临床发病的症状非常吻合，说明WH1609在小鼠上能成功复制脑膜炎模型，且小鼠毒力试验结果表明，WH1609感染小鼠后仅引起单一的脑膜炎症状，所以相比于其他菌株，WH1609更适合用作猪链球菌致脑膜炎机制的研究。现有研究表明细菌性脑膜炎是通过血源传播，所以猪链球菌感染致脑膜炎主要包括以下几个阶段：首先猪链球菌以较低水平的菌量在宿主黏膜表面定植，如呼吸道及胃肠道黏膜，并进入血液；其次在血液中存活并大量增殖形成严重的菌血症；最后穿过血脑屏障侵入脑膜和中枢神经系统，损伤神经元最终诱发脑膜炎。但是这些过程具体的分子机制尚不清楚，有待进一步研究。

4 结论

从患脑膜炎仔猪的脑组织中分离到一株猪链球菌，血清型为9型，有明显的荚膜状结构，命名为WH1609。多位点序列分型表明WH1609属于一个新的ST型。WH1609对多种抗生素耐药，对万古霉素、青霉素及氨苄西林敏感。WH1609感染小鼠可出现明显的脑组织病变。其在BALB/c小鼠的半数致死量为已发现的猪链球菌强毒株的10⁵倍以上。