畜牧兽医学报  2019, Vol. 50 Issue (1): 134-142. DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2019.01.016    PDF    
牛支原体EF-Tu基因的克隆表达、亚细胞定位及间接ELISA方法建立
王艳芳1,2, 周雅坪1, 郭婷1, 张新竹1, 吴倩1, 陈昕迪1, 郝永清1     
1. 内蒙古农业大学兽医学院, 呼和浩特 010018;
2. 包头医学院基础医学与法医学院, 包头 014040
摘要:旨在获得牛支原体延伸因子EF-Tu蛋白,分析其在牛支原体菌体内的分布情况,建立EF-Tu间接ELISA法,为进一步研究牛支原体EF-Tu的生物学功能提供理论依据,也为建立牛支原体有效的血清学诊断方法和亚单位疫苗的研制奠定基础。参照Uniprot数据库中M.bovis PG45株EF-Tu基因序列,应用Overlap PCR扩增获得EF-Tu基因并将其克隆至pMD19-T载体,测序正确后,构建pET32a-EF-Tu原核表达载体,转化大肠杆菌BL21表达菌,IPTG诱导表达,纯化后的表达产物免疫新西兰兔(New Zealand rabbit)制备多克隆抗体,利用间接ELISA测定高免血清抗体效价,用Western blot和间接ELISA法初步定位EF-Tu在菌体内的分布,通过优化反应条件,建立间接ELISA检测法。结果表明:重组蛋白EF-Tu约为66 ku,主要以可溶性形式表达;采用间接ELISA测定的多克隆抗体效价为1:6 400;Western blot和ELISA表明该蛋白在牛支原体细胞质和细胞膜中均有表达,且含量相当。利用EF-Tu建立的ELISA法具有很好的特异性和敏感性。通过原核表达系统成功得到牛支原体延伸因子的重组蛋白,该蛋白分布于菌体细胞质和膜表面,且含量基本相当。本研究所建立的EF-Tu ELISA法适合大规模的血清学诊断检测。
关键词牛支原体    原核表达    多克隆抗体    亚细胞定位    ELISA    
Cloning, Expression, Subcellular Localization and Indirect ELISA Method of EF-Tu Gene in Mycoplasma bovis
WANG Yanfang1,2, ZHOU Yaping1, GUO Ting1, ZHANG Xinzhu1, WU Qian1, CHEN Xindi1, HAO Yongqing1     
1. College of Veterinary Science, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China;
2. College of Preclinical and Forensic Medicine, Baotou Medical College, Baotou 014040, China
Abstract: The purpose of the present study was to establish an indirect enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) detection method via obtaining prokaryotic expression products of elongation factor Tu (EF-Tu) referring Mycoplasma bovis (M. bovis) and analyze its subcellular localization in M. bovis, which could provide theoretical basis for studying the biological function of EF-Tu in M. bovis and lays the essential foundation for establishing effective serological diagnosis method and construction of subunit vaccine against M. bovis. In this study, specific primers were designed referred to gene sequence of EF-Tu from M. bovis PG45 reported in Uniprot. And Overlap PCR-amplified products of EF-Tu of M. bovis was inserted into the pMD19-T vector. With right sequences, prokaryotic expression vector of pET32-EF-Tu was constructed and converted into Escherichia coli (BL21) competent cells. Then, the expression of target protein was induced with 1 mmol·L-1 of IPTG. After that, the recombinant protein of EF-Tu was purified via Ni-NTA affinity chromatography, with which New Zealand rabbits were immunized to prepare polyclonal antibodies, and the titer of antibody was measured by ELISA. Subsequently, subcellular localization of EF-Tu was analyzed using Western blot and ELISA. The indirect ELISA detection method was established by recombinant protein of EF-Tu. Results were as follows:Recombinant protein of EF-Tu showed an expected molecular mass of 66 kD and was expressed in soluble form. The antibody titer of rabbit serum was 1:6 400. The results of ELISA and Western blot showed that the recombinant protein of EF-Tu showed good immunogenicity, and elongation factor was detected in both cytoplasm and cell membrane of M. bovis with similar expression amounts. The indirect ELISA method for the detection of M. bovis established with EF-Tu showed good specificity and sensitivity. The recombinant protein of EF-Tu was successfully obtained, and elongation factor was expressed in both cytoplasm and cell membrane of M. bovis showing similar expression amounts. The indirect ELISA method showed great potential for serological diagnosis of M. bovis.
Key words: Mycoplasma bovis     prokaryotic expression     polyclonal antibody     subcellular localization     ELISA    

牛支原体(Mycoplasma bovisM. bovis)可以引起牛关节炎、肺炎、流产等多种疾病[1-3]。1961年,在美国该病原首次从牛乳腺炎病例分离得到[4],牛支原体相关疾病给全世界养牛业带来了巨大的经济损失,严重阻碍养牛业健康、快速发展[5]。欧美地区每年由牛支原体引起的相关疾病导致的直接经济损失达1.6亿欧元;英国每年平均有15.7万头牛因各种肺炎死亡,由支原体造成的经济损失为3亿英镑左右[6-7];据调查,美国牛支原体感染率高达70%,引起的经济损失达1.1亿美元[8-9]。我国于2008年由辛九庆等[10]首次从牛呼吸道病料中分离到牛支原体,此后,在我国牛支原体病例的报道层出不穷,牛支原体蔓延速度,导致的经济损失逐年增长,已经对我国养牛业造成了严重威胁[11-13]。深入对牛支原体蛋白的研究,可为建立牛支原体有效的血清学诊断方法和研制亚单位疫苗提供理论依据。

延伸因子Tu(elongation factor Tu, EF-Tu)蛋白是比较保守的蛋白质,是生命活动中不可或缺的重要功能蛋白。前期研究发现,EF-Tu可以通过与EF-G、转运RNA形成一个复合体,从而控制核糖体蛋白的表达量,除此以外,EF-Tu还与信号传导和细胞黏附有关。EF-Tu可作为病原相关分子模式(pathogen associated molecular patterns, PAMPs)被模式识别受体所识别,进而启动宿主防御机制,激活信号通路,但其机制还不是很清楚[14-16]。Regula等[17]对多种微生物进行比较分析,发现EF-Tu在多种微生物中都占总蛋白的10%。有的研究还发现EF-Tu在细菌中作为一个毒力因子存在,可以帮助肺炎支原体(M. pneumonia)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginose)逃避宿主的细胞免疫,进而侵袭宿主[18-20]。迄今为止,关于牛支原体EF-Tu的研究仅有在实验室利用EF-Tu基因快速检测牛支原体感染病例的报道[21]。本研究应用Overlap PCR技术扩增牛支原体EF-Tu基因全序列,通过原核表达,纯化表达产物,免疫新西兰兔制备多克隆抗体,用Western blot和间接ELISA方法初步定位EF-Tu蛋白在牛支原体菌株中的分布,以期为深入研究M. bovis EF-Tu蛋白的生物学特性提供理论基础,为建立牛支原体有效的血清学诊断方法和亚单位疫苗的研制奠定基础。

1 材料与方法 1.1 菌种、表达载体及实验动物

牛支原体(Mycoplasma bovis, M. bovis)分离株为内蒙古农业大学微生物实验室分离、保存;克隆载体pMD19T购自宝生物(大连)工程有限公司(TaKaRa,大连);表达载体pET-32a(+)为内蒙古农业大学微生物实验室保存;大肠杆菌(Escherichia coli)感受态细胞Trans T1和BL21(DE3)购自北京全式金生物技术有限公司(Transgen, 北京);新西兰兔(New Zealand rabbit)购自北京富龙腾飞实验动物研究所。

1.2 试剂

PrimeSTAR HS DNA聚合酶、T4 DNA连接酶购自宝生物(大连)工程有限公司(TaKaRa, 大连);限制性核酸内切酶、SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate购自Thermo公司(美国);DNA Marker购自北京天根生化科技有限公司(北京);DNA纯化回收试剂盒、质粒小提试剂盒购自Axygen公司(美国);预染蛋白相对分子质量标准,EasySee Western Marker(25~90 ku),细胞质蛋白提取试剂盒,膜蛋白提取试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司(Transgen, 北京);Ni-NAT His Bind、BCA蛋白定量试剂盒、羊抗兔HRP IgG、兔抗牛HRP IgG、羊抗鼠HRP IgG购自生工生物工程(上海)股份有限公司;6×蛋白加样缓冲液购自碧云天生物技术有限公司(北京);胰蛋白胨、酵母提取物购自OXOID公司(英国);马血清购自草原绿野有限公司(呼和浩特);弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂购自Sigma公司(美国);四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine, TMB)显色试色液购自Promega公司(北京);其他常规试剂均为国产分析纯级产品。

1.3 M. bovis基因组的提取

M. bovis分离株接种到支原体PPLO液体培养基中(含有20%马血清),在37 ℃ 5% CO2培养箱中培养32 h后,取5 mL菌液,12 000 r·min-1低温高速离心20 min,无菌生理盐水洗涤3次,按支原体基因组提取试剂盒说明书提取支原体的基因组,-80 ℃保存。

1.4 EF-Tu基因的分析、优化扩增

参照Uniprot数据库中M. bovis PG45标准株Elongation factor Tu(E4PZX2)的蛋白序列,获得完整的基因序列。利用在线分析软件ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/)对EF-Tu蛋白的理化性质进行预测;利用SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测该蛋白的信号肽;利用TMHMM2.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)预测该蛋白的跨膜结构;利用PROSCAN (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_proscan.html)查找该蛋白功能位点;利用SOPMA (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)对该蛋白的二级结构进行在线分析。序列分析发现该蛋白序列中有1个色氨酸密码子(TGA)在大肠杆菌中为终止密码子,运用Overlap PCR技术扩增EF-Tu全序列(将序列中的TGA突变为同义密码子TGG),在引物上、下游分别加入BamHⅠ和SacⅠ酶切位点(表 1)。PCR反应体系均为:灭菌双蒸水31.5 μL、5×Prime STAR Buffer(Mg2+plus) 10 μL、dNTP Mixture 1 μL、10 μmol·L-1上、下游引物各1 μL、模板DNA 2 μL、Prime STAR HS DNA Polymerease 0.5 μL。PCR反应条件:94 ℃预变性5 min;94 ℃ 1 min,55 ℃ 45 s,72 ℃ 60 s,反应35个循环;72 ℃延伸10 min;反应程序结束后,在PCR管中加入2 μL普通的Taq E,轻轻振荡,混匀,瞬离,72 ℃反应20 min, 可以在PCR产物平末端添加A尾。PCR产物利用DNA回收试剂盒回收与pMD19-T载体进行连接,连接体系总体积为10 μL:灭菌双蒸水4 μL,SolutionⅠ 1 μL, 加A尾的EF-Tu PCR产物4 μL,pMD19T 1 μL,16 ℃过夜连接。取连接产物5 μL转化至大肠杆菌50 μL感受态细胞Trans T1,通过菌液PCR和双酶切鉴定为阳性的质粒送上海生工生物工程股份有限公司测序,通过NCBI在线比对,将测序正确的质粒命名为pMD19T-EF-Tu。

表 1 Overlap PCR扩增EF-Tu基因的引物序列 Table 1 Primer sequences of EF-Tu gene for Overlap PCR amplification
1.5 原核表达载体pET32a-EF-Tu的构建

将pMD19T-EF-Tu与pET32a(+)分别进行BamHⅠ和SacⅠ双酶切,体系均为20 μL:10×buffer 2 μL,质粒16 μL,BamHⅠ 1 μL,SacⅠ 1 μL。37 ℃水浴酶切1 h,DNA回收试剂盒回收EF-Tu及pET32a(+)酶切片段,经T4 DNA Ligase 16 ℃过夜连接,连接体系为20 μL:EF-Tu双酶切片段9 μL,pET32a(+)双酶切片段8 μL,buffer 2 μL,T4 DNA Ligase 1 μL。连接产物5 μL转化至大肠杆菌50 μL感受态细胞Trans T1中,菌液PCR和双酶切鉴定为阳性的质粒命名为pET32a-EF-Tu。

1.6 pET32a-Tu原核表达、鉴定及产物纯化

重组质粒pET32a-EF-Tu转化大肠杆菌表达菌BL21(DE3),挑单个菌落进行PCR鉴定,并扩大培养于5 mL LB(含100 μg·mL-1 Amp)液体培养基,过夜培养后,按照1:100接种于50 mL LB(含100 μg·mL-1 Amp)液体培养基中,37 ℃振荡培养至OD600 nm为0.7左右加入IPTG(终浓度为1 mmol·L-1) 37 ℃ 180 r·min-1,诱导5 h后,5 000 r·min-1离心10 min收集菌体,PBS洗涤3次,6 mL PBS回溶,超声波破碎15 min(功率为65%,超声5 s,间歇5 s),4 ℃ 12 000 r·min-1低温高速离心10 min后,取上清和沉淀进行SDS-PAGE。将上清过滤器,经镍柱亲和纯化,收集洗脱液,进行SDS-PAGE电泳。100 V电压湿转转膜45 min,将目的蛋白转至PVDF膜上。PVDF膜用5%脱脂乳室温摇床封闭5 h后,分别用Anti-His tag鼠源单克隆抗体和牛支原体标准阳性血清作为一抗4 ℃过夜结合,TBST漂洗3次,每次10 min,用HRP标记的山羊抗鼠IgG和兔抗牛IgG二抗室温摇床孵育1 h,TBST漂洗3次,每次10 min,用SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate试剂盒进行显色,鉴定目的蛋白是否表达,表达的目的蛋白是否具有组氨酸标签及表达蛋白是否具有反应原性。

1.7 EF-Tu多克隆抗体的制备及效价的测定

纯化的rM. bovis EF-Tu与等体积的弗氏完全佐剂混合、充分乳化后免疫2 kg左右的新西兰兔,按800 μg·只-1的剂量皮下多点注射,14 d后进行第2次免疫,400 μg·只-1的剂量免疫,此次用弗氏不完全佐剂,每周加强免疫1次,部位和剂量与第2次免疫一致,第4次免疫4 d后采血,分离血清,-20 ℃保存备用。将纯化后的重组EF-Tu蛋白用碳酸盐包被液稀释后,以0.5 μg·mL-1的包被量包被酶标板,利用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗体效价。

1.8 细胞质蛋白以及膜蛋白提取

将对数生长后期400 mL培养物,15 000 r·min-1离心15 min收集菌体,无菌生理盐水洗涤3次,平均分装到2个2 mL无菌无酶管中,分别用来提取细胞质蛋白和膜蛋白。提取过程参照全式金公司哺乳动物核与细胞质蛋白提取试剂盒以及哺乳动物膜蛋白提取试剂盒说明书。为了保证EF-Tu在膜蛋白和细胞质蛋白中含量具有可比性,提取液体积均按说明书比例调整为900 μL。

1.9 EF-Tu蛋白的亚细胞定位

取等体积牛支原体细胞质蛋白和膜蛋白,分别按比例加入6×蛋白上样缓冲液,混合后沸水浴10 min,12 000 r·min-1 5 min,取上清20 μL上样,进行SDS-PAGE电泳,电泳结束后用湿转法于100 V电压下转膜45 min,将目的蛋白转至PVDF膜上。PVDF膜用5%脱脂乳在摇床上封闭5 h,将膜孵育在兔抗rM. bovis EF-Tu高免血清中,4 ℃过夜,TBST洗3次,每次10 min,用HRP标记的山羊抗兔IgG二抗室温摇床孵育1 h,TBST洗3次,每次10 min,用SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate试剂盒进行显色,试验重复3次。

分别取5 μL细胞质蛋白和膜蛋白提取液与95 μL包被液混匀,3个平行,4 ℃包被酶标板过夜,PBST洗板5次,拍干后每孔加入200 μL 2%的牛血清白蛋白(BSA),37 ℃封闭2 h,PBST洗板5次后,拍干,37 ℃倒置干燥2 h后,每孔加入100 μL兔抗rM. bovis EF-Tu高免血清,37 ℃孵育1 h,用PBST洗板5次后,拍干,每孔加入100 μL HRP标记的山羊抗兔IgG二抗(1:4 000),37 ℃孵育1 h,用PBST洗板5次后,拍干,每孔加入100 μL TAB显色液,室温避光孵育10 min后加入50 μL终止液,测定OD450 nm值。试验数据应用SPSS 11.5统计软件处理,方差分析,P < 0.05为有统计学意义。

1.10 EF-Tu与牛支原体全菌蛋白ELISA的比较 1.10.1 反应条件优化

将纯化的EF-Tu重组蛋白用碳酸盐包被液稀释为0.25、0.5、1、2、4、8 μg·mL-1,包被96孔酶标板,4 ℃过夜包被,PBST洗板5次,37 ℃封闭2 h,PBST洗板5次,37 ℃干燥2 h,牛支原体阳性血清按照1:50、1:100、1:200、1:400、1:800稀释作为一抗,37 ℃反应1 h,PBST洗板5次,以兔抗牛IgG-HRP(1:6 000)为二抗,37 ℃反应1 h,PBST洗板5次,拍干,每孔加入100 μL TAB显色液,室温避光孵育10 min后加入50 μL终止液,测定OD450 nm值。每组3个平行,根据P/N值确定ELISA方法的最佳反应条件。

1.10.2 特异性试验

利用建立的间接EF-Tu ELISA方法,分别对牛支原体标准阴、阳性血清和口蹄疫、副结核、牛布鲁菌病的阳性血清进行检测,评价EF-Tu的特异性。所用标准血清的来源见表 2

表 2 血清来源 Table 2 The source of serum
1.10.3 敏感性试验

将牛支原体阳性血清从1:200开始倍比稀释,以确定EF-Tu和全菌蛋白的敏感性。

1.10.4 临床样品的检测

本实验室已经建立了牛支原体全菌蛋白间接ELISA方法,与加拿大Biovet公司生产的牛支原体ELISA检测试剂盒进行了对比,两种方法的总符合率为95%[22]。分别利用EF-Tu和全菌蛋白作为包被抗原,对92份临床样本进行检测(临床样本来源见表 3),比较二者的符合率。

表 3 临床样本来源 Table 3 The source of clinical samples
2 结果 2.1 EF-Tu蛋白的分析及基因全序列的扩增

参照Uniprot数据库中M. bovis PG45株中Elongation factor Tu(E4PZX2)的蛋白序列,获得完整的基因序列开放阅读框,1 191 bp,编码397个氨基酸。利用primer5.0分析发现有1个终止密码子,位于601—603 bp处。采用ProtParam在线分析软件预测EF-Tu蛋白质的理化性质,推测该蛋白质的分子式为C1936H3099N527O586S13,相对分子质量43.6 ku,理论等电点为5.89,酸性蛋白质,不稳定参数32.95,推测EF-Tu蛋白为稳定蛋白。同时,该软件还预测出该蛋白的疏水性平均系数(grand average of hydropathicity,GRAVY)为-0.273,推测其为亲水性蛋白。利用TMHMM2.0 Server和SignalP4.1对EF-Tu进行分析发现,该蛋白没有跨膜结构域和信号肽。在SOPMA程序预测的EF-Tu氨基酸序列的二级结构中,α螺旋为33.84%,延伸链为26.77%,β转角为11.87%,不规则卷曲为27.53%。采用PROSCAN在线查找到EF-Tu的7个功能位点,发现1个N-糖基化位点,5个蛋白激酶C磷酸化位点,7个酪蛋白激酶II磷酸化位点,1个酪氨酸激酶磷酸化位点,7个豆蔻酰化位点,1个ATP/GTP结合位点,1个鸟嘌呤核苷酸结合位点。

从以上生物信息分析,EF-Tu蛋白适合全长克隆表达。通过Overlap PCR扩增获得牛支原体EF-Tu基因全长序列,其大小为1 191 bp,与预期大小相一致。将其克隆到pMD19T载体送上海生工生物公司测序,测序结果通过NCBI Blast,结果显示与牛支原体标准株PG45、NM2012株、HB0801株、CQ-W70株、Hubei-1株的相似性均为99%。1处TGA成功突变为TGG。

2.2 原核表达载体pET32a-EF-Tu的构建与表达

pET32a-EF-Tu重组质粒进行BamHⅠ和SacⅠ双酶切鉴定以及PCR鉴定,与预期结果一致,说明表达载体pET32a-EF-Tu构建成功(图 1)。

M1. DL2000 DNA相对分子质量标准;M2. DL5000 DNA相对分子质量标准; 1、2. pET32a-EF-Tu的BamHⅠ、SacⅠ双酶切产物 M1. DNA marker DL2000;M2. DNA marker DL5000;1, 2. Products from pET32a-EF-Tu digested with BamHⅠ, Sac 图 1 pET32a-EF-Tu的双酶切鉴定 Figure 1 BamH Ⅰ and Sac Ⅰ endonucleases digestion identification of vector pET32a-EF-Tu

将pET32a-EF-Tu重组质粒,转化BL21菌,涂板挑单菌落,经PCR鉴定正确后,将菌接种于AMP+抗性的LB培养基中,37 ℃振荡培养过夜,将培养好的菌液扩培于AMP+抗性的LB培养基中,37 ℃振荡培养至OD600 nm为0.6~0.8时加入IPTG至终浓度为1.0 mmol·L-1,37 ℃诱导表达5 h后收集菌体,超声破碎,取等量沉淀和上清进行SDS-PAGE电泳分析,与对照相比,重组蛋白有表达,其相对分子质量为66 ku,与预期大小一致,主要以可溶性形式表达(图 2)。

M.预染蛋白质相对分子质量标准;1. IPTG诱导pET-32a(+)空载体重组菌;2. IPTG诱导pET32a-EF-Tu重组菌全菌;3. IPTG诱导pET32a-EF-Tu重组菌上清;4. IPTG诱导pET32a-EF-Tu重组菌沉淀 M. Protein molecular weight marker; 1. Product from pET-32a(+) after IPTG induction; 2. Product from pET32a-EF-Tu after IPTG induction; 3. Product from pET32a-EF-Tu after IPTG induction (supernatant); 4. Product from pET32a-EF-Tu after IPTG induction (inclusion body) 图 2 重组EF-Tu蛋白的SDS-PAGE电泳分析 Figure 2 SDS-PAGE analysis of the recombinant protein EF-Tu

将诱导的重组菌上清进行SDS-PAGE,分别以Anti-His tag鼠源单克隆抗体和牛支原体标准阳性血清作为一抗,Western bolt显色后在66 ku处有单一的条带,说明目的蛋白表达成功,带有组氨酸标签,表达的重组蛋白具有反应活性(图 3)。

M.预染蛋白质相对分子质量标准;1. His单克隆抗体(鼠源);2.牛支原体阳性血清 M. Protein molecular weight marker; 1. His monoclonal antibody (rat source); 2. M. bovis positive serum 图 3 Western bolt分析重组蛋白 Figure 3 Western bolt analysis of recombinant protein

将诱导重组菌的上清过镍柱,用washing buffer和elution buffer洗柱子,分别收集液体,进行SDS-PAGE电泳,elution buffer第1次洗脱液中有大量目的蛋白洗脱下来,但有杂带,elution buffer第2次洗脱的蛋白比较纯(图 4)。

M.预染蛋白质相对分子质量标准;1.流穿液;2.Washing buffer第1次洗脱;3. Washing buffer第2次洗脱;4. Elution buffer第1次;5. Elution buffer第2次;6. Washing buffer洗脱 M. Protein molecular weight marker; 1. Fluid penetrating fluid; 2. Washing buffer 1; 3. Washing buffer 2; 4. Elution buffer 1; 5. Elution buffer 2; 6. Washing buffer 图 4 纯化重组蛋白 Figure 4 Purification of recombinant protein
2.3 多克隆抗体的制备

第4次免疫4 d后心脏采血,分离血清,利用间接ELISA测定抗体效价,测定结果显示,抗体效价为1:6 400。

2.4 EF-Tu蛋白的亚细胞定位

经Western blot分析,兔抗rM. bovis EF-Tu多抗血清能与膜蛋白和细胞质蛋白中的EF-Tu发生特异性结合,条带大小为44 ku(图 5)。分别包被5 μL细胞质蛋白和膜蛋白提取液,进行间接ELISA检测,OD450 nm没有显著差异,P>0.05(图 6),说明EF-Tu在细胞质及膜表面均有分布,含量相当。

1.细胞质蛋白提取液;2.膜蛋白提取液 1. Cytoplasmic protein extract; 2. Membrane protein extract 图 5 EF-Tu亚细胞定位Western blot分析 Figure 5 EF-Tu subcellular localization on Western bolt analysis
图 6 EF-Tu亚细胞定位ELISA检测 Figure 6 EF-Tu subcellular localization on ELISA test
2.5 EF-Tu与牛支原体全菌蛋白ELISA的比较

经方阵滴定试验,确定EF-Tu重组蛋白与全菌蛋白最佳包被浓度为0.5 μg·mL-1,检测血清最佳稀释比为1:100。全菌蛋白最佳包被浓度为1 μg·mL-1,检测血清最佳稀释比为1:100。用EF-Tu 0.5 μg·mL-1浓度包被酶标板,分别对牛支原体标准阴、阳性血清、口蹄疫、副结核、牛布鲁菌病的阳性血清进行检测,发现EF-Tu ELISA仅对牛支原体阳性血清呈阳性结果,牛支原体阴性血清及其他阳性血清均为阴性结果,说明利用EF-Tu重组蛋白建立的ELISA具有特异性。将牛支原体阳性血清从1:100进行倍比稀释,当血清稀释到1:800时,EF-Tu包被的酶标板OD值仍然大于0.5。全菌蛋白包被的酶标板的敏感性较差,血清稀释到1:400时,OD值仍然大于0.5,血清稀释到1:800时,OD值小于0.5。

分别用EF-Tu 0.5 μg·mL-1浓度包被酶标板和1 μg·mL-1全菌蛋白包被酶标板,对92份临床血清样品进行检测,2个重复,结果显示全菌蛋白ELISA检出阳性血清84份、阴性血清8份,EF-Tu ELISA法检出阳性血清79份、阴性血清13份,阳性符合率为94%,阴性符合率为61.5%,共同检出阳性血清78份、阴性血清7份,两种方法的总符合率为(78+7)/92=92.4%。

3 讨论

自2008年我国首次从牛呼吸道病料中分离到牛支原体病原后,全国各地不断有关于牛支原体病例的报道,牛支原体已经严重威胁我国养牛业发展。支原体是目前发现的可进行自我复制,没有细胞壁,可在培养基中生长的最小生物,支原体膜蛋白具有维持支原体形态及其新陈代谢等作用,并在感染宿主过程中都起着关键作用。

延伸因子EF-Tu负责蛋白质合成中肽链的延伸,是细胞膜骨架的重要组成蛋白,是生物体重要的多功能蛋白[15]。本试验克隆得到EF-Tu基因的全长序列,测序结果与牛支原体标准株PG45、NM2012、HB0801、CQ-W70、Hubei-1株比对,相似性均为99%,说明EF-Tu基因比较保守,可以作为遗传进化分子标靶,这也是汤宇娇等[21]利用Tu基因作为牛支原体感染病例实验室快速检测的依据。尹正军等[23]在分析绵羊肺炎支原体延伸因子Tu基因的分子特性时,也提出tuf基因比16S rRNA基因更适合作为绵羊肺炎支原体进化关系的分子靶标。

目前,绵羊支原体EF-Tu蛋白的研究比较多。许健等[24]利用双向电泳及免疫印迹方法对绵羊肺炎支原体分离株的抗原蛋白进行筛选,并用质谱进行鉴定,筛到3个主要抗原蛋白点,其中2个为延伸因子。Zhang等[25]通过原核表达的绵羊肺炎支原体EF-Tu蛋白能与病羊的血清发生反应,证明了EF-Tu具有免疫原性。蒋菲[26]验证了EF-Tu蛋白为绵羊肺炎支原体膜相关蛋白,原核表达的EF-Tu重组蛋白可诱导小鼠产生较强的体液免疫应答与细胞免疫应答,为绵羊肺炎支原体亚单位疫苗研究提供试验依据。包世俊等[27]对滑液支原体膜蛋白进行研究,筛选鉴定出8个蛋白质点,其中3个点为延伸因子EF-Tu。基于以上研究,本试验用原核表达牛支原体EF-Tu蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体,测得效价为1:6 400,应用Western blot和ELISA对M.bovis EF-Tu在菌体内的分布进行研究。为了具有可比性,本试验保证膜蛋白和细胞质蛋白提取液体积一致,SDS-PAGE上样量一致。结果表明,EF-Tu蛋白分布于牛支原体的细胞质及膜表面,且分布量相当,这与其他已报道的支原体蛋白定位结果一致[28-29]

本试验从重组蛋白EF-Tu为包被抗原,通过棋盘滴定法确定最佳的抗原包被量和检测抗体稀释倍数。利用EF-Tu重组蛋白建立的ELISA对临床样品进行检测,与牛支原体全菌蛋白建立的ELISA相比较,本研究所建立的ELISA具有很好的特异性和敏感性,适合大规模的血清学诊断检测,为我国畜群牛支原体感染的监测提供了可靠的方法。研究结果也为进一步研究M. bovis EF-Tu生物学功能提供依据,也为亚单位疫苗的研制奠定基础。

4 结论

本研究利用Overlap PCR扩增获得EF-Tu基因的全长序列并构建pET32a-EF-Tu原核表达载体,经IPTG诱导,66 ku的重组蛋白以可溶性形式表达。通过Western blot和间接ELISA法发现EF-Tu在牛支原体细胞质和膜蛋白中均有表达,且含量相当。通过优化反应条件,建立牛支原体检测间接ELISA法,该方法具有很好的特异性和敏感性,适合大规模的血清学诊断检测。

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