2. 贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室, 贵阳 550025;
3. 贵阳市花溪区农业局, 贵阳 550025
2. Key Laboratory of Animal Genetics, Breeding and Reproduction in the Plateau Mountainous Region, Ministry of Education, Guizhou University, Guiyang 550025, China;
3. Bureau of Agriculture, Huaxi District, Guiyang 550025, China
新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)属于副黏病毒科禽腮腺炎病毒属成员，是一种有囊膜、含有单股负链不分节段基因组的RNA病毒，其基因组至少编码六种病毒蛋白[1]。基质蛋白(matrix protein, M)是NDV编码的一种非糖基化膜相关蛋白，位于病毒囊膜内表面，构成病毒核衣壳蛋白和囊膜连接的支架[2-3]。与大多数副黏病毒M蛋白一样，NDV M蛋白是一种多功能病毒蛋白，同时也是一种细胞核-细胞质穿梭蛋白：在NDV感染细胞早期，M蛋白可通过自身携带的双重核定位信号(nuclear localization signal，NLS)进入细胞核[4]；而在感染后期，M蛋白则通过携带的核输出信号(nuclear export signal, NES)以CRM-1非依赖的方式进入细胞质[5]。大量研究表明，携带NLS的病毒蛋白完成入核转运还需要宿主细胞内核转运受体蛋白的参与[6-7]。如Pryor等[8]研究发现登革热病毒NS5蛋白需要结合核转运受体蛋白importin α1，再与importin β1形成复合物进入细胞核；Pumroy等[9]研究发现A型流感病毒PB2蛋白进入细胞核需要importin α3和importin α7的协同作用；而Cai等[10]研究证实水痘-带状疱疹病毒ORF9蛋白的入核转运仅需要结合importin β1。
本课题组前期通过荧光共定位试验发现importin β1蛋白缺失体与NDV M蛋白共表达后导致M蛋白不能进入细胞核，并且免疫共沉淀试验显示importin β1蛋白能与M蛋白发生相互作用，暗示importin β1蛋白可能是NDV M蛋白入核转运的核转运受体蛋白[11]。由于免疫共沉淀试验不能反映蛋白之间的直接相互作用，因此需要进一步用其他试验来验证。目前，pull-down技术被广泛应用于蛋白在体外的直接相互作用研究[12]。因此，本研究通过构建NDV M基因和鸡importin β1基因的重组原核表达载体，利用原核表达系统获得重组蛋白，然后通过GST pull-down技术验证NDV M蛋白与鸡importin β1蛋白之间的相互作用。这些研究为进一步探讨鸡importin β1蛋白在M蛋白细胞核定位中的作用以及在NDV复制和致病中的作用奠定工作基础。
1 材料与方法 1.1 细菌和质粒大肠杆菌DH5α和BL21(DE3)感受态细胞由实验室保存；原核表达载体pGEX-6p-1、pET-32a(+)购自Invitrogen公司；构建的NDV M基因重组真核表达载体pCMV-HA-M[11]和鸡importin β1基因重组克隆质粒pCR2.1-importin β1[13]由笔者实验室保存。
1.2 主要试剂质粒小量提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒购自AxyGen公司；EcoRⅠ、XhoⅠ和BamHⅠ快速限制性内切酶、DNA marker、T4 DNA连接酶、谷胱甘肽-琼脂糖珠、蛋白重折叠试剂盒购自Thermo Fisher公司；IPTG、十二烷基硫酸钠(SDS)、甘氨酸、Tris、过硫酸铵、TEMED、Tween-20、考马斯亮蓝R-250、盐酸胍、抗His标签鼠单克隆抗体、蛋白酶抑制剂、DAB显色试剂盒(20×)购自康为世纪生物科技有限公司；蛋白酶抑制剂、30% Acr-Bis(29:1)、1.5 mmol·L-1 Tris-HCl(pH=8.8)、1.0 mmol·L-1 Tris-HCl(pH=6.8)、蛋白上样缓冲液、预染蛋白Marker、HRP标记羊抗小鼠IgG(H+L)购自碧云天生物技术有限公司；其他试剂均为国产分析纯。
1.3 引物设计根据GenBank中登录的NDV ZJ1株全基因序列(GenBank登录号：AF431744)，鸡importin β1基因序列(GenBank登录号：XM_015299473)，使用Primer Premier 5.0软件设计两对带酶切位点(下划线部分)的特异性引物，用于扩增NDV M基因和鸡importin β1基因的开放阅读框(表 1)。引物由上海生物工程有限公司合成。
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表 1 构建重组原核表达载体所用引物 Table 1 Primers used for the construction of recombinant plasmids |
以重组质粒pCMV-HA-M和pCR2.1-importin β1为模板，分别用NDV M基因和鸡importin β1基因的特异性引物进行PCR扩增。1%琼脂糖凝胶电泳完成后，将PCR产物切胶回收，并与原核表达载体pGEX-6p-1、pET-32a(+)分别双酶切，胶回收后连接并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取单菌落培养后提取质粒并双酶切鉴定，将鉴定正确的重组原核表达载体送上海Invitrogen公司测序。
1.5 重组蛋白的诱导表达将测序正确的重组原核表达载体pGEX-6p-M、pET-32a-importin β1、空载体pGEX-6p-1和pET-32a(+)分别转化BL21(DE3)感受态细胞，挑取单克隆于含有氨苄的LB液体培养基中培养过夜。每个重组蛋白的原核表达试验分为三组，将菌液按1:100的比例扩大培养，当菌液OD600 nm达到0.4~0.6时，第一组加入终浓度分别为0.1、0.5、1.0、1.5 mmol·L-1的IPTG诱导4 h；第二组加入相同终浓度IPTG，分别诱导2、3、4、5 h；第三组加入相同终浓度IPTG，分别放置于37、30、25 ℃诱导4 h。将收集的菌落用PBS洗涤3次，用适量PBS重悬，加入蛋白酶抑制剂后用高压细胞破碎仪裂解细菌。离心分离上清和沉淀，沉淀用适量PBS重悬，再分别加入蛋白上样缓冲液，于100 ℃水浴10 min，最后用SDS-PAGE检测重组蛋白的表达。
1.6 包涵体蛋白的复性SDS-PAGE电泳检测发现GST-M重组蛋白在菌体内主要以包涵体形式存在，为了获得具有活性的GST-M重组蛋白，按照蛋白重折叠试剂盒Pierce® Protein Refolding Kit对GST-M重组蛋白进行变性和复性，具体操作如下：用6 mol·L-1盐酸胍、50 mmol·L-1 Tris(pH=8.0)溶解包涵体，4 ℃过夜，制备浓度分别为5和0.5 mg·mL-1的重组蛋白储备溶液；取18个EP管并标记，将基础重折叠缓冲液加入对应管中；再将EDTA、GSH、GSSG和ddH2O加入每个管中，使每管溶液终体积达到950 μL；再将所有离心管和变性的蛋白储备溶液置于4 ℃冷却；将10 μL 0.5 mg·mL-1的GST-M重组蛋白溶液分别加入1~9号管，将10 μL 5 mg·mL-1的GST-M重组蛋白溶液加入10~18号管，每次添加后立即涡旋振荡，置于冰上冷却，重复以上步骤，直到每个管中加入50 μL蛋白溶液；最后将EP管置于4 ℃重折叠18~24 h后用谷胱甘肽-琼脂糖珠纯化GST-M重组蛋白以检验重折叠效果。
1.7 NDV M蛋白与鸡importin β1蛋白的相互作用鉴定 1.7.1 GST pull-down试验以GST-M重组蛋白为诱饵蛋白、His-importin β1重组蛋白为猎物蛋白进行pull-down试验，具体步骤如下：从“1.6”中选出3种适合GST-M重组蛋白复性的缓冲液进行蛋白复性操作；将100 μL谷胱甘肽-琼脂糖珠用10倍体积的洗涤缓冲液(50 mmol·L-1 Tris，150 mmol·L-1 NaCl，pH=8.0)平衡，离心后弃缓冲液；取1 mL复性后的GST-M重组蛋白溶液加入到谷胱甘肽-琼脂糖珠，于室温孵育3 h；用适量洗涤缓冲液洗涤谷胱甘肽-琼脂糖珠，1 200 r·min-1离心2 min，弃掉上清，重复洗涤3次。分别取制备好的His-importin β1重组蛋白上清(10 mg·mL-1)50、100、150 μL，分别加入适量洗涤缓冲液，使其体积达到200 μL，然后加入到上述已结合GST-M重组蛋白的谷胱甘肽-琼脂糖珠中，室温孵育3 h；用适量洗涤缓冲液洗涤谷胱甘肽-琼脂糖珠，1 200 r·min-1离心2 min，弃上清；重复洗涤3次。最后向谷胱甘肽-琼脂糖珠中加入50 μL蛋白上样缓冲液，100 ℃水浴10 min，于-80 ℃保存备用。
1.7.2 Western blotting试验按常规操作将处理好的上述蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，随后将目的蛋白转印至PVDF膜，转印时恒定电流(100 mA)湿转1 h。转印完成后将PVDF膜用5%脱脂奶粉4 ℃封闭过夜，然后加入1:3 000稀释的抗His标签鼠单克隆抗体，4 ℃孵育12 h；TBST漂洗PVDF膜3次后加入1:1 000稀释的HRP标记羊抗小鼠二抗，室温孵育2 h；TBST漂洗3次后，用DAB进行显色。
2 结果 2.1 目的基因的PCR扩增根据NDV M基因和鸡importin β1基因序列设计两对特异性引物，以重组质粒为模板分别扩增NDV M基因和鸡importin β1基因ORF，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果获得大小分别为1 095和2 268 bp的条带，与预期片段大小相符，而未加模板的PCR反应不能扩增出目的基因片段(图 1)。
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M. DNA相对分子质量标准；1.目的基因PCR产物；2.阴性对照 M. DNA marker; 1. PCR product of target gene; 2. Negative control 图 1 NDV M基因(A)、鸡importin β1基因(B)PCR扩增结果 Figure 1 PCR amplification of NDV M gene (A) and chicken importin β1 gene (B) |
将提取的重组质粒pGEX-6p-M和pET-32a-importin β1分别用EcoRⅠ/XhoⅠ、XhoⅠ/BamHⅠ进行双酶切，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。结果获得大小约为4 984 bp的pGEX-6p-1载体片段和大小约为1 095 bp的M基因片段(图 2A)，以及大小约为5 900 bp的pET-32a(+)载体片段和大小约为2 268 bp的importin β1基因片段(图 2B)。将重组原核表达载体pGEX-6p-M、pET-32a-importin β1送生物公司测序，测序结果表明M基因和importin β1基因按正确的编码框插入到载体中，且未发生碱基突变，说明重组原核表达载体构建成功。
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M. DNA相对分子质量标准；1.空载体双酶切产物；2.重组质粒的双酶切鉴定 M. DNA marker; 1. Double enzyme digestion of empty plasmid; 2. Double enzyme digestion of recombinant plasmid 图 2 重组质粒pGEX-6p-M(A)、pET-32a-importin β1(B)的双酶切鉴定 Figure 2 Identification of pGEX-6p-M (A) and pET-32a-importin β1 (B) by double restriction endonuclease digestion |
将重组原核表达载体pGEX-6p-M、pET-32a-importin β1以及空载体pGEX-6p-1、pET-32a(+)分别转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达后通过SDS-PAGE鉴定，结果表明：重组原核表达载体pGEX-6p-M经过诱导表达后在68 ku左右出现目的条带，并且GST-M重组蛋白主要以包涵体形式存在(图 3A)；而重组原核表达载体pET-32a-importin β1经过诱导表达后在97 ku左右出现目的条带，但His-importin β1重组蛋白在包涵体和上清中都存在(图 3B)。
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M.预染蛋白相对分子质量标准；1.重组蛋白上清；2.重组蛋白沉淀；3.标签蛋白(GST或His) M.Prestained protein marker; 1. Supernatant; 2. Precipitation; 3. Tag protein (GST or His) 图 3 重组蛋白GST-M(A)、His-importin β1(B)的SDS-PAGE检测 Figure 3 SDS-PAGE analysis of the recombinant protein GST-M(A) and His-importin β1 (B) |
为了获得大量的重组蛋白，对重组蛋白原核表达条件中的IPTG浓度、诱导温度和诱导时间进行了优化。结果表明，当IPTG终浓度为0.1 mmol·L-1、温度为37 ℃、诱导时间为5 h时GST-M重组蛋白的表达量高(图 4)。而当IPTG浓度为0.1 mmol·L-1、温度为37 ℃、诱导时间为4 h时，His-importin β1重组蛋白的表达量高(图 5)。
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A. IPTG终浓度优化(M.预染蛋白相对分子质量标准；1~4. IPTG终浓度分别为0.1、0.5、1.0、1.5 mmol·L-1；5.空载体pGEX-6p-1); B.诱导时间优化(M.预染蛋白相对分子质量标准；1~4.诱导时间分别为2、3、4、5 h；5.空载体pGEX-6p-1); C.诱导温度优化(M.预染蛋白相对分子质量标准；1~3.诱导温度分别为37、30、25 ℃；4.空载体pGEX-6p-1) A. Optimization of the IPTG concentration (M. Prestained protein marker; 1-4. The IPTG concentrations were 0.1, 0.5, 1.0, 1.5 mmol·L-1, respectively; 5. Empty vector of pGEX-6p-1); B. Optimization of induction time (M. Prestained protein marker; 1-4. The induction time were 2, 3, 4, 5 h, respectively; 5.Empty vector of pGEX-6p-1); C. Optimization of induction temperature (M. Prestained protein marker; 1-3. The induction temperature were 37, 30 and 25 ℃, respectively; 4. Empty vector of pGEX-6p-1) 图 4 GST-M重组蛋白的原核表达条件优化 Figure 4 Optimization of prokaryotic expression conditions of GST-M recombinant protein |
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A. IPTG终浓度优化(M.预染蛋白相对分子质量标准；1~4. IPTG终浓度分别为0.1、0.5、1.0、1.5 mmol·L-1); B.诱导时间优化(M.预染蛋白相对分子质量标准；1~4.诱导时间分别为2、3、4、5 h); C.诱导温度优化(M.预染蛋白相对分子质量标准；1~3.诱导温度分别为25、30、37 ℃) A. Optimization of the IPTG concentration (M. Prestained protein marker; 1-4. The IPTG concentrations were 0.1, 0.5, 1.0, 1.5 mmol·L-1, respectively); B. Optimization of induction time (M. Prestained protein marker; 1-4. The induction time were 2, 3, 4, 5 h, respectively); C. Optimization of induction temperature (M. Prestained protein marker; 1-3. The induction temperature were 25, 30 and 37 ℃, respectively) 图 5 His-importin β1重组蛋白的原核表达条件优化 Figure 5 Optimization of prokaryotic expression conditions of His-importin β1 recombinant protein |
对GST-M重组蛋白包涵体进行变性和复性，复性后用谷胱甘肽-琼脂糖珠与GST-M重组蛋白复性样品混合孵育3 h，洗涤后弃上清，加入PBS和蛋白上样缓冲液后于100 ℃水浴10 min，同时将溶解但未进行复性的GST-M重组蛋白作为对照。包涵体复性结果表明，复性后的GST-M重组蛋白能被谷胱甘肽-琼脂糖珠结合(图 6，1~3泳道)，而GST-M重组蛋白包涵体不能被谷胱甘肽-琼脂糖珠结合(图 6，4泳道)，说明GST-M重组蛋白进行包涵体复性后才具有活性。
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M.预染蛋白相对分子质量标准；1~3.复性后的GST-M重组蛋白纯化结果；4. GST-M重组蛋白包涵体纯化结果 M. Prestained protein marker; 1-3. Purification of the renaturated GST-M recombinant protein; 4. Purification of the GST-M inclusion body 图 6 GST-M重组蛋白包涵体的复性结果检测 Figure 6 Renaturation analysis of the GST-M recombinant protein inclusion body |
将GST pull-down试验获得的蛋白复合物进行SDS-PAGE检测，结果发现GST-M重组蛋白组在约68和97 ku位置分别出现GST-M重组蛋白和His-importin β1重组蛋白条带(图 7A，1~3泳道)，而标签蛋白GST组仅出现GST蛋白(图 7A，4泳道)。使用抗His标签鼠单克隆抗体和HRP标记羊抗小鼠二抗进行Western blotting检测，结果发现GST-M重组蛋白能结合不同浓度的His-importin β1重组蛋白(图 7B，1~3泳道)，而标签蛋白GST不能结合His-importin β1重组蛋白(图 7B，4泳道)。以上结果说明NDV M蛋白与鸡importin β1蛋白在体外发生直接的相互作用。
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A.蛋白相互作用的SDS-PAGE检测(M.预染蛋白相对分子质量标准；1~3.蛋白相互作用产物; 4.阴性对照); B.蛋白相互作用的Western blotting检测(M.预染蛋白相对分子质量标准；1~3. His-importin β1重组蛋白; 4.阴性对照) A. SDS-PAGE analysis of the interacting proteins (M. Prestained protein marker; 1-3. The products of the interacting proteins; 4. Negative control); B. Western blotting analysis of the interacting proteins (M. Prestained protein marker; 1-3. His-importin β1; 4. Negative control) 图 7 NDV M蛋白与鸡importin β1蛋白相互作用验证 Figure 7 Verification of the interaction between NDV M protein and chicken importin β1 protein |
副黏病毒是一类有囊膜、含有单股负链不分节段基因组的RNA病毒，能对人和动物的健康产生较大的危害。大多数副黏病毒[如人呼吸道合胞体病毒(human respiratory syncytial virus, HRSV)、仙台病毒(Sendai virus, SeV)、尼帕病毒(Nipah virus, NiV)和NDV]，其M蛋白可通过自身携带的NLS和NES进行细胞核-细胞质穿梭，这个过程对副黏病毒基因组的复制转录以及病毒粒子的装配和出芽非常重要[2, 7]。在以上副黏病毒中，目前国外研究人员对HRSV M蛋白核质穿梭的分子机制阐释得较为清楚，即在HRSV感染细胞早期，M蛋白通过其NLS在细胞质中识别和结合importin β1蛋白，然后在Ran蛋白的协助下穿过核膜进入细胞核[14]；而在病毒感染后期，M蛋白则通过NES与CRM-1蛋白结合进入细胞质[15]。有研究证实NDV M蛋白中存在1个由两簇碱性氨基酸组成的NLS[4]和3个由疏水性氨基酸组成的NES[5]，并且发现3个NES均以CRM-1非依赖的方式介导M蛋白完成出核过程[5]。但是到目前为止，国内外研究人员对NDV M蛋白的入核转运机制仍不清楚。
大量的研究结果表明，病毒蛋白完成入核转运除了需要自身携带的NLS，还依赖于细胞内的核转运受体蛋白参与这一过程[6-7]。如人免疫缺陷病毒1型Tat蛋白和Rev蛋白携带的NLS均需要被importin β1蛋白识别和结合才能进入细胞核[16]；人博卡病毒NP1蛋白携带两种NLS，可以通过importin α/β1或importin β1依赖的方式进入细胞核[17]；而牛流行热病毒α1蛋白NLS则需要被importin β1和importin 7共同结合来完成α1蛋白的入核转运[18]。NDV M蛋白是一种在病毒进化过程中较为保守的结构蛋白之一[19]。Duan等[20]对不同基因型和不同毒力NDV M蛋白比较分析发现，组成M蛋白NLS的碱性氨基酸十分保守，并且在病毒感染早期M蛋白均能大量聚集在细胞核，M蛋白的这种细胞核定位特征与NDV基因型和毒力没有关系。笔者课题组前期的研究结果暗示importin β1蛋白是介导NDV M蛋白细胞核定位的核转运受体蛋白[11]，但是两者在体外的相互作用还未得到证实。目前，pull-down技术被广泛应用于蛋白质之间的相互作用研究。与酵母双杂交、免疫共沉淀技术相比，pull-down技术能反映两个蛋白在体外的直接相互作用，但需要重组蛋白在细菌体内以可溶性形式表达才有活性[12]。本研究中笔者对两个蛋白进行原核表达时发现GST-M重组蛋白主要以包涵体形式存在，不能被谷胱甘肽-琼脂糖珠结合，但是经过变性和复性处理后，获得了有活性的重组蛋白；进一步利用GST pull-down试验证实NDV M蛋白与鸡importin β1蛋白在体外具有直接的相互作用。由于蛋白质入核转运需要通过其NLS与importin α或importin β结合，而M蛋白NLS在不同基因型和不同毒力NDV中保守，因此，NDV M蛋白与鸡importin β1蛋白的相互作用没有毒株特异性。
近年来，许多研究表明，病毒蛋白细胞核定位对病毒的复制增殖和致病性有重要作用[21]。例如，猪繁殖与呼吸综合征病毒NP蛋白的细胞核定位可抑制宿主细胞的抗病毒免疫应答以及促进病毒在细胞内的有效复制[22]；HRSV和麻疹病毒(measles virus, MeV)M蛋白的细胞核定位可抑制宿主细胞基因转录和蛋白质的合成，有利于病毒基因组的复制和转录以及子代病毒粒子的产生[23-24]；A型流感病毒H5N1 NS1蛋白的细胞核定位虽然对病毒的复制和致病性不是必需的，但是在抵抗细胞抗病毒应答方面非常重要，而H1N1流感病毒NS1蛋白的细胞核定位则对抗病毒免疫应答以及病毒的复制和致病性均有重要作用[25]。目前，在副黏病毒家族成员中，仅HRSV和MeV M蛋白细胞核定位的功能得到明确的阐释。本研究确定了NDV M蛋白与importin β1蛋白之间的相互作用，进一步证实importin β1蛋白是NDV M蛋白入核转运的核转运受体蛋白，这为后续利用RNA干扰技术敲减DF-1细胞中importin β1蛋白表达，并通过蛋白组学方法筛选和验证NDV感染细胞后的差异蛋白，进而阐明NDV M蛋白细胞核定位的功能奠定了重要基础。
4 结论成功构建NDV M基因和鸡importin β1基因的重组原核表达载体pGEX-6p-M、pET-32a-importin β1，并在大肠杆菌BL21(DE3)中实现正确表达。利用蛋白重折叠试剂盒获得了有活性的GST-M重组蛋白，通过GST pull-down技术证实NDV M蛋白与鸡importin β1蛋白在体外具有直接的相互作用。
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