2. 华中农业大学 动物医学院, 武汉 430070
2. College of Animal Science and Veterinary Medicine, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China
猪圆环病毒(PCV)为圆环病毒科，圆环病毒属成员，是目前发现的最小的动物病毒[1]，主要包括PCV1、PCV2、PCV3等三种基因型。自20世纪90年代初加拿大首次报道发现猪圆环病毒2型以来，其被证实能导致多种猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)，包括断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)[2]、猪皮炎肾病综合征(PDNS)[3]和猪呼吸道综合征(PRDC)[4]等，造成发病猪淋巴结肿大，生长变慢，黄疸，消瘦等临床症状和复杂的病理变化，给养猪业带来了巨大的经济损失。
MiRNA是一类长度在22 nt左右的内源性非编码小分子RNA，广泛存在于动物、植物和病毒中，能通过形成RNA诱导的沉默复合体(RISC)来调控基因的表达和翻译[5]；miRNA能够调节机体中30%~75%的mRNA转录本[6]，在神经系统发育、胆固醇代谢、机体免疫反应、细胞凋亡、细胞周期调节以及肿瘤的形成和发展中具有重要作用[7]。
目前关于PCV2感染猪或者细胞所引起的miRNA表达变化的研究较多[8-12]，且关于PCV2的转录组学研究和蛋白质组学研究已有大量的报道[13-16]，但是将PCV2感染所导致的差异miRNA、差异mRNA以及差异蛋白质进行综合分析的研究却尚未报道。本研究使用定量PCR方法筛选PCV2感染PK-15细胞后的差异表达miRNA，并参考分析已有的(GEO登录号：GSE71945)关于PCV2感染后的蛋白质组学研究结果，对PCV2感染PK-15细胞第12小时(12 hpi)的小分子互作网络进行简要分析，有助于推动PCV2与宿主之间互作关系的研究，揭示PCV2的致病机制。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 毒株及细胞猪圆环病毒2型WH株(GenBank登录号：FJ598044.1)由本实验室分离并保存；猪肾上皮细胞系(PK-15)，由本实验室保存。
1.1.2 主要试剂和仪器氯化钙、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾、无水乙醇、氯仿、异丙醇、醋酸钠等化学试剂购自国药集团化学制药有限公司；DMEM干粉(1815951)，0.25% Trypsin-EDTA(1868903)购自Gibco公司；TRIzol® Reagent(15596-026)购自Invitrogen公司；Recombinant DNase I(Rnase-free)(2270A)，PrimeScriptTM RT reagent Kit (Perfect Real Time)(RR037A)等购自大连宝生物公司；HieffTM qPCR SYBR® Green Master Mix (Low Rox Plus)购自上海翊圣生物科技有限公司；384孔PCR反应板、96孔PCR反应板以及S1000TM Thermal Cycler(PCR仪)购自美国Bio-Rad公司；ViiATM7实时荧光定量PCR仪为美国ABI公司产品；QuantStudioTM Real-Time PCR Software v1.3为Thermo Fisher公司产品。
1.1.3 主要软件和数据库DAVID为人类逆转录病毒学和免疫信息学实验室开发；miRBase为英国曼彻斯特大学开发；miRecords为美国明尼苏达大学开发；NCBI (National Center for Biotechnology Information)为美国国家生物技术信息中心；Microsoft Office为美国微软公司产品；Venny 2.1为西班牙国家生物技术中心开发；Cytoscape网络分析编辑软件(Shannon et al 2003)为美国国家普通医学科学研究所(NIGMS)开发。
1.1.4 定量引物的设计与合成参照Fang等[17]的茎环荧光定量PCR方法设计引物用于检测多个热点miRNA在PCV2感染组和未接种病毒组中的表达情况，引物具体名称和序列见表 1。本研究中所用引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
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表 1 用于miRNA定量检测的引物 Table 1 Primers used for miRNA quantitative detection |
登录GEO数据库，参考已有的PCV2感染PK-15细胞的芯片测序结果(GEO登录号：GSE71945)，使用NCBI数据库中的GEO2R分析工具，分析获取其中PCV2感染组PK-15细胞和未接种病毒组PK-15细胞在12 hpi时差异表达的mRNA，使用DAVID数据库中的Gene ID Conversion功能将所得的mRNA名称转换成Official Gene Symbol，并使用Functional Annotation Tool功能对差异表达的mRNA进行功能聚类和信号通路分析。
1.2.2 PCV2感染PK-15细胞差异表达miRNA 1.2.2.1PCV2WH感染PK-15细胞：将PCV2 WH株(107TCID50·mL-1)按照10 MOI接种PK-15细胞悬液，同时设置不接种病毒组，在12 hpi收取细胞，使用TRIzol® Reagent(15596-026)提取细胞总RNA，Nano Drop测定RNA浓度和纯度，琼脂糖凝胶电泳分析RNA降解程度以及是否有污染，每个样品设三个生物学重复。
1.2.2.2茎环定量PCR检测目的miRNA：使用Recombinant DNase I(Rnase-free)(2270A)去除细胞总RNA中的DNA，根据PrimeScriptTM RT reagent Kit (Perfect Real Time)(RR037A)说明书在特异性反转录引物的作用下反转录500 ng RNA，将所得的cDNA稀释成5 ng·μL-1，使用HieffTM qPCR SYBR® Green Master Mix (Low Rox Plus)检测各组cDNA中miR-10b、miR-128、miR-155、miR-21、miR-26a、miR-29b、miR-30a-5p、miR-361-3p、miR-378、miR-450-5p的量，使用QuantStudioTM Real-Time PCR Software v1.3导出荧光定量PCR结果，使用Microsoft office EXCEL处理试验结果，按照2-△△Ct法计算PCV2 WH株感染组和未接种病毒组之间上述miRNA的差异转录倍数。
1.2.3 差异表达miRNA和mRNA互作网络图 1.2.3.1差异表达miRNA的靶基因预测：使用miRecords数据库中的“Predicted Targets”功能用于预测差异表达miRNA靶基因。因为该数据库暂不提供物种猪的靶基因预测功能，故使用猪miRNA序列完全相同的相应人miRNA进行靶基因预测分析，选取超过两个数据库预测到的靶基因，即可获取miRNA的高置信度靶基因。
1.2.3.2差异miRNA和mRNA互作关系：使用Venny 2.1将差异表达miRNA的靶基因与具有相应趋势的差异表达mRNA取交集，例如：在12 hpi显著性上调的miRNA的预测靶基因与显著性下调的mRNA取交集，交集的mRNA即为高置信度的miRNA靶基因。使用Cytoscape软件分析以上所得的差异表达miRNA和差异表达mRNA的互作关系并绘制网络图。
2 结果 2.1 差异表达mRNA的筛选和分析将GEO2R筛选得到的差异mRNA转换成Gene list形式，相对于未接种病毒组，PCV2感染组中共158个差异mRNA，其中75个为显著性上调，83个为显著性下调，GO富集分析结果显示差异mRNA主要属于细胞质、细胞核和外泌体等细胞组分(cellular component)，主要分子功能(molecular function)为RNA聚合酶Ⅱ核心启动子近端区域序列特异性DNA结合、趋化因子活性、转录激活物活性和激酶活性等，主要参与免疫反应、炎症反应、ERK1/2级联反应和抗病毒应答等生物途径(biological process)；KEGG富集分析结果显示，差异mRNA主要参与甲型流感病毒感染、肿瘤相关通路、趋化因子和细胞因子通路介导的炎症、MAPK通路、NF-κB通路、Toll受体信号通路等信号通路。GO富集以及KEGG pathway分析结果见表 2。
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表 2 差异mRNA的GO分析和KEGG pathway分析 Table 2 The GO analysis and KEGG pathway analysis of differentially expressed mRNA |
PCV2感染组和未接种病毒组所提取的RNA浓度均高于200 ng·μL-1，OD260 nm/OD280 nm ≥1.8，琼脂糖凝胶电泳结果中可见28S、18S和5S三个条带且28S/18S条带亮度比值均接近2.0，说明RNA样品浓度、纯度和完整性都很高。琼脂糖凝胶电泳结果见图 1。
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图 1 总RNA琼脂糖凝胶电泳检测 Figure 1 Total RNA agarose gel electrophoresis detection |
茎环定量PCR结果显示，在PCV2感染后第12小时，miR-10b、miR-128、miR-155-5p、miR-21、miR-29b和miR-361-3p等在PCV2感染组和未接种病毒组之间均显著性差异表达，除miR-361-3p显著下调外，其他miRNA均显著上调。各miRNA差异表达情况见图 2。
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*. P < 0.05; **. P < 0.01; ***. P < 0.001 图 2 PCV2感染后第12小时差异miRNA的定量检测 Figure 2 Stem-loop qPCR for differentially expressed miRNAs at 12 hpi |
使用miRecords数据库中的“Predicted Targets”功能预测miR-10b、miR-128、miR-155-5p、miR-21、miR-29b、miR-361-3p的靶基因，选择超过两个数据库预测到的靶基因，发现其分别有7 105、9 741、7 451、7 183、7 971、8 793个靶基因，与PCV2感染所导致的差异表达mRNA分别有30、55、49、41、44、43个交集，该交集中具有相应表达趋势的mRNA极有可能为差异miRNA的靶基因。交集mRNA名称及其差异表达倍数见表 3。
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表 3 差异miRNA靶基因与差异mRNA的交集 Table 3 The intersection of differentially expressed miRNA target genes and differentially expressed mRNA |
分析交集表达mRNA中具有相应表达趋势的部分，发现miR-10b、miR-128、miR-155-5p、miR-21、miR-29b等显著性上调的miRNA在其中分别对应21、30、25、21、20个显著性下调的mRNA，显著性下调的miR-361-3p对应15个显著性上调的mRNA。差异miRNA和mRNA之间的对应关系如图 3。
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矩形框代表miRNA，圆形框代表mRNA；红色代表显著性上调，绿色代表显著性下调 The rectangular box represents miRNA, the circular box represents mRNA, red represents significant up-regulation, and green represents significant down-regulation 图 3 PCV2感染第12小时时的差异miRNA和mRNA互作网络 Figure 3 Differentially expressed miRNA and mRNA interaction network at 12 hpi |
PCV2感染动物机体后，在淋巴组织中大量增殖并破坏淋巴小结结构，导致淋巴组织损伤，随后损伤的部位被正常组织所取代[18-19]，进而造成淋巴滤泡破坏和白细胞减少，造成机体免疫抑制[20]，导致多种圆环病毒相关疾病(PCVAD)，主要包括断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎和肾病综合征(PDNS)、肉芽肿性肠炎等，同时还易导致其他病原的并发感染和继发感染。miRNA可以形成RNA诱导的沉默复合体来调控基因表达和翻译；许多研究显示，miRNAs在机体的先天免疫应答和获得性免疫反应中起重要作用。miRNA能调控模式识别受体，如TLR等，进而影响巨噬细胞和抗原呈递细胞功能[21]；miRNA还能调控巨噬细胞和抗原呈递细胞的活化、共刺激信号强度以及B细胞、T细胞的发育和功能[22-24]。PCV2感染和miRNA表达紊乱均能导致机体免疫系统功能和其他系统功能的变化，导致机体病态的出现。
Núñez-Hernández等[8-9]使用高通量测序技术探索PCV2感染猪中是否能找到PCV2所编码的miRNA，结果显示PCV2感染猪后并未找到PCV2编码的miRNA，但该研究表明PCV2感染能导致猪肠系膜淋巴结中miRNA的差异表达；Hong等[10]研究发现PCV2 ORF1、ORF2、ORF3均能引起猪肾上皮细胞中大量的miRNA差异表达；Zhang等[11]检测发现PCV2感染导致莱芜猪和约克夏/长白二元猪的肺中大量miRNA表达紊乱，影响猪的呼吸系统功能，同时宿主miRNA(ssc-miR-122)能抑制PCV2 DNA复制和Cap蛋白表达；miR-15a在PCV2所导致的宿主细胞的细胞周期阻滞中起重要的调节作用，其能使细胞周期的G0/G1期延长[12]；在3D4/A1细胞中过表达miR-30a-5p，能靶向作用于14-3-3基因，增强细胞自噬水平进而促进PCV2的感染[25]。综上，PCV2感染能导致动物机体或者宿主细胞中miRNA表达紊乱，并且病毒与miRNA之间相互作用，共同影响机体正常的生命活动，促进疾病进程。本研究中发现PCV2感染能导致miR-10b、miR-128、miR-155-5p、miR-21、miR-29b、miR-361-3p等在PK-15细胞中显著性差异表达，与Hong等[10]针对不同的PCV2 ORF区对PK-15细胞miRNA表达谱的影响相比，笔者发现在PCV2感染第12小时的PK-15细胞以及ORF2稳定表达的PK-15细胞中miR-361-3p均呈显著下调的表达趋势，miR-29b在PCV2感染、ORF2和ORF1稳定表达的PK-15细胞中均呈现显著上调的表达趋势。miR-361-3p在非小细胞肺癌的致病过程中起重要作用，其能直接靶向SH2B1基因进而影响肿瘤的增殖和代谢[26]，此外，miR-361-3p以及miR-625的低表达是肺部良性肿瘤和肺部恶性肿瘤的血液检测标志物[27]。miR-29b在多种癌症的发生和发展中起重要的调控作用[28]，影响表观遗传调节、细胞的增殖、分化和凋亡、转移和癌症免疫；miR-21还能通过调节DNA甲基化影响猪或者鼠的胚胎发育[29-30]，但是miR-29b在PCV2感染和致病进程中的作用仍有待进一步的研究和验证。
转录组学和蛋白质组学等是目前常用的研究病原与宿主间相互作用的手段，其能有效定量宿主中基因和蛋白的表达量变化，目前关于PCV2感染的猪、PK-15细胞和肺泡巨噬细胞的蛋白组学均有报道。PCV2感染能导致宿主或者细胞内大量关键基因和蛋白质的表达紊乱。Fernandes等[31]研究发现，PCV2感染能显著改变猪淋巴结和肺中大量的免疫反应和炎症相关基因的表达；PCV2感染还能导致猪肺泡巨噬细胞中炎症相关基因以及细胞凋亡抑制基因显著性上调表达，影响细胞的正常生命进程[32]。Zhang等[14]使用双向凝胶电泳偶联基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(two-dimensional gel electrophoresis coupled with matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，2-DE coupled with MALDI-TOF/TOF)在PCV2感染的肺泡巨噬细胞和PK-15细胞中分别发现21个和34个宿主编码的蛋白质发生显著性差异表达变化，并且这些蛋白质在细胞骨架构成、压力反应、生物大分子合成、信号转导和泛素蛋白酶体途径等生命进程中起重要作用；樊慧英(Fan)等[33]使用细胞培养氨基酸稳定同位素标记技术(stable isotope labelling with amino acids in cell culture，SILAC)和质谱分析发现PCV2感染能导致PK-15细胞中163个蛋白质发生显著性表达量变化，其中79个上调、84个下调，差异表达蛋白质主要参与底物运输、细胞骨架变化和应激反应等；刘杰(Liu)等[16]应用二维液相色谱(two-dimensional liquid chromatography-tandem mass spectrometry，2-D LC/MS)偶联同位素标记相对和绝对定量技术(isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ)鉴定PCV2感染对PK-15细胞蛋白质表达的影响，发现196个宿主蛋白质表达量显著性差异表达，差异表达蛋白质主要参与细胞成分构成和分子结合、信号转导、细胞黏附等生物进程。Wen等[34]使用微芯片杂交技术鉴定PCV2感染以及猪圆环病毒样病毒P1各个编码区表达质粒转染对PK-15细胞中蛋白质表达的影响，得到大量可供分析和研究的数据，本研究选取其中PCV2感染组和未接种病毒组的数据进一步分析，挖掘到158个表达量发生显著性变化的mRNA，富集分析发现其主要具有激活趋化因子活性、DNA结合和激酶活性等分子功能，参与免疫反应、炎症反应和MAPK级联反应等生物途径。进一步分析本研究中的差异表达miRNA和mRNA之间的关系发现，每个miRNA具有调控多个mRNA和蛋白质的能力，能参与多条生物途径，同样每条生物途径或者某个mRNA均接受多个不同的miRNA调控，如：溶质载体家族7成员2(SLC7A2)基因能编码阳离子氨基酸转运体2(CAT2)，调控精氨酸、赖氨酸和鸟氨酸的转运[35]，在PCV2感染后表达量显著降低，其能受到miR-10b、miR-128、miR-155-5p、miR-21、miR-29b等多个miRNA的调控，同时，每个miRNA均能调控成百上千的基因，影响宿主的生命活动，导致疾病的发生和发展。
4 结论PCV2感染能干扰PK-15细胞中多种miRNA的表达并造成mRNA表达谱紊乱，差异表达的miRNA和mRNA之间相互作用，共同影响细胞正常的生命进程。
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