2. 新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室, 阿拉尔 843300
2. Key Laboratory of Tarim Animal Husbandry Science and Technology, Xinjiang Production & Construction Corps, Alar 843300, China
初情期是动物获得繁殖能力的关键阶段[1-2],在动物生产上,培育初情期早的母畜可以节约饲养成本,增加母畜终生产仔数量,从而提高母畜利用率,也可以缩短世代间隔,加速育种进程[3-4]。
Lin28是一种高度保守的RNA结合蛋白,最早发现于秀丽隐杆线虫中,是调节线虫发育时间的异时性基因[5-7]。在哺乳动物中,该基因的同源基因有Lin28A和Lin28B两种,两者有77%的同源性,都含有两个RNA结合结构域:一个冷休克结构域和一对CCHC锌指结构域[8]。Lin28A和Lin28B具有相同的功能,呈现不同的细胞类型分布[9]。Lin28A、Lin28B可通过多种机制抑制let-7 miRNA的成熟过程,let-7 miRNA可以在转录后水平抑制Lin28A、Lin28B的翻译,降低Lin28A、Lin28B蛋白表达水平。另外,Lin28A、Lin28B还具有独立于miRNA的功能,可选择性地结合mRNA靶基因,从而直接刺激该基因的翻译过程[10-12]。Lin28A在小鼠、鸡胚胎发育早期和胚胎干细胞中广泛表达,而其在胚胎发育晚期和成年只在心肌、下丘脑、垂体、卵巢、睾丸中表达[9]。Lin28A在成年大鼠胎盘、睾丸、卵巢和垂体中高表达,在下丘脑中等程度的表达[13]。
研究发现,Lin28/let-7在动物初情期启动中发挥重要调控作用[9-10]。Moss等[14]研究发现,Lin28A基因调节线虫发育过程,Lin28A基因过表达,导致发育延迟,然而,Lin28A基因表达缺少,导致发育提前。Zhu等[15]发现,Lin28A基因过表达的转基因小鼠,阴门开口时间和初情期延迟,下丘脑、垂体、卵巢中过表达Lin28A基因,但let-7a或let-7g表达并未下降,且let-7水平并不影响下丘脑-垂体-性腺轴(HPGA)细胞的生长。Sangiao-Alvarellos等[16]研究发现,Lin28A mRNA在新生雌、雄大鼠下丘脑中大量表达,在幼年期至初情期的过渡中,表达急剧下降,而let-7a和let-7b在新生雌、雄大鼠下丘脑中表达很少,在幼年至青春期的过渡中,表达急剧上升。Grieco等[17]研究发现,与20日龄C57BL/6(B6)小鼠相比,25、30日龄和初情期后,C57BL/6(B6)小鼠卵巢中Lin28A mRNA表达显著下降,下丘脑中Lin28A mRNA表达也显著下降,但let7-a和let-7g miRNA在下丘脑、卵巢中均没有发生显著变化。Lin28A基因在下丘脑、卵巢等的表达呈发育性变化,且达到初情期时表达明显下降,let-7 miRNA表达变化显著或者没有发生显著变化,Lin28A可能通过调控let-7的方式或独立于let-7的方式对下丘脑-垂体-性腺轴(HPGA)进行调节,从而启动初情期到来。
多浪羊是新疆羊肉优良风味的典型代表,也是本地区主要地方绵羊品种和肉食来源。虽然在南疆相同的生态环境条件下,与其他地方绵羊品种相比,多浪羊具有独特的繁殖特点,是新疆典型的早熟品种,母羊3~4月龄达到初情期,常年发情、繁殖性能高[18-19],本研究以性早熟的多浪羊为研究对象,对其Lin28A基因cDNA进行克隆,采用Real-time PCR技术分析下丘脑、垂体、卵巢中Lin28A基因在初情期启动过程中的表达变化规律,以进一步揭示Lin28A基因在多浪羊初情期启动中的作用,为从遗传上缩短绵羊的初情期年龄提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 试验动物及样品采集选择饲养于南疆疆南牧业有限公司、饲养环境条件相同,体重相近,出生日期接近的未发情的雌性多浪羊为试验动物,自90日龄起对母羊进行初情期(第1次发情)观察,参照Dantas等[20]和Cao等[21]初情期鉴定方法,每天将性成熟公羊(包扎阴茎)放入母羊群中试情2次,发情母羊外部表现为精神不安,爱走动,静立接受公羊爬跨为发情标准,分别在初情期前(第1次发情前1周)、初情期、初情期后(第1次发情后1周)屠宰多浪羊各5只。在无菌条件下用专门处理过的手术器械快速采集下丘脑、垂体、卵巢组织,立即放入液氮保存。
1.2 总RNA提取和cDNA的合成 1.2.1 总RNA提取采用TRIzol-酚-氯仿一步法提取上述采集的下丘脑、垂体、卵巢组织总RNA,利用紫外分光光度法和1%琼脂糖对总RNA浓度和质量进行检测,-20 ℃保存备用。
1.2.2 cDNA的合成按照反转录试剂盒的说明书进行,首先混合总RNA 2 μL(约2 μg),oligo (dT)18(0.25 μg·μL-1)2 μL,dNTPs (2.5 mmol·μL-1) 2 μL和RNase free H2O 7 μL,然后65 ℃ 5 min,冰浴2 min。再加入5×First-Strand Buffer 4 μL,DTT(0.1 mol·L-1) 1 μL,RNase inhibitor (40 U·μL-1)1 μL,SuperscriptTM Ⅲ反转录酶(200 U·μL-1) 0.6μL,最后加RNase free H2O水补足总体积到25 μL,按照55 ℃ 60 min,70 ℃ 15 min进行反转录。RT产物-20 ℃保存备用。
1.3 引物合成、PCR扩增根据NCBI中公布的绵羊Lin28A基因mRNA序列(XM_012153431.1)设计引物(表 1),利用垂体组织总RNA,反转录成cDNA, 扩增多浪羊Lin28A基因CDS序列和3′ UTR。RT-PCR反应程序: 95 ℃预变性5 min;95 ℃ 20 s, 60 ℃退火30 s, 35个循环;75 ℃ 5 min。将扩增出的PCR产物凝胶回收、克隆测序,然后用DNA Star软件组装,BLSAT进行序列对比和分析。
根据克隆得到的多浪羊Lin28A基因cDNA序列跨内含子设计引物(表 1),用Real-time PCR(qPCR)试剂盒检测Lin28A基因在下丘脑、垂体、卵巢中的表达量,以内参基因ACTB作为对照。根据miRbase中提供的miRNA成熟序列,设计引物,以U6作为内参基因。引物序列:let-7a F: 5′-GCTGAGGTAGTAGGTTGTATAGTT-3′;let-7b F: 5′-GTGAGGTAGTAGGTTGTGTGGT-3′;let-7a和let-7b的下游引物由Sino Gene One-step miRNA反转录试剂盒自带;U6 F: 5′-CTCGCTTCGGCAGCACATAT-3′,U6 R: 5′-AACGCTTCACGAAT-TTGCGT-3′。
qPCR反应体系:2×SG Green qPCR Mix 7.5 μL,10 μL· L-1的上下游引物各0.5 μL,1 μL cDNA,5.5 μL ddH2O;qPCR反应程序: 95 ℃预变性10 min;95 ℃ 20 s,60 ℃退火30 s,40个循环;95 ℃ 15 s,60 ℃ 30s,95 ℃ 15 s。
每个样品重复检测3次,定量完成后得到不同样本的Ct值,利用2-△△CT法计算Lin28A、let-7a及let-7b相对表达量[22]。
1.5 多浪羊Lin28A的生物信息学分析及数据分析采用DNAMAN version 6.0软件进行引物设计、氨基酸序列相似性比较。SignalP 3.0在线分析软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)分析信号肽;利用TMHMM软件进行跨膜区分析;Mega 5.0软件构建系统发育树。采用SPSS 21.0进行单因素方差分析,分析结果用“平均数±标准差”表示。P < 0.05表示差异显著;P < 0.01表示差异极显著。
2 结果 2.1 多浪羊Lin28A基因cDNA克隆与特征分析以多浪羊垂体组织总RNA为模板,通过RT-PCR、克隆测序获得了多浪羊Lin28A基因cDNA序列(GenBank登录号:MG708181),大小为3 581 bp,包括2 963 bp的3′UTR和618 bp的CDS。该CDS编码205个氨基酸(图 1),蛋白质分子量为22.37 ku,等电点为8.17。通过SMART数据库分析发现Lin28A蛋白含有一个N-末端CSD结构域和一对CCHC锌指结构域。
利用DNAman 6.0软件对多浪羊、人、家鼠、牛等物种的Lin28A氨基酸进行同源性比较(图 2),结果发现,多浪羊Lin28 A氨基酸序列与人、家鼠、牛和绵羊的同源性分别是87.56%、88.52%、92.68%和89.95%,与鸡、斑马鱼的同源性分别是76.10%和61.84%。用TMHMM软件分析预测Lin28A蛋白的跨膜区,发现Lin28A不是跨膜蛋白,说明它可能位于胞质或核中。
利用SignalP 3.0软件进行信号肽分析,发现多浪羊Lin28A蛋白无信号肽。利用多浪羊Lin28A蛋白质序列与GenBank数据库中其它物种的Lin28A蛋白质序列,构建了NJ系统进化树(图 3),表明多浪羊与牛、绵羊聚在一起;人、家鼠形成了亲缘关系较近的另一支;鸡、斑马鱼与其它哺乳动物的亲缘关系较远。
对多浪羊Lin28A、let-7a、let-7b在下丘脑、垂体及卵巢中的表达情况进行qPCR分析(图 4)。图 4可以看出,多浪羊初情期前下丘脑与卵巢中Lin28A表达量较高,从初情期前至初情期的过程中,下丘脑、卵巢中Lin28A基因表达显著下降(P < 0.05),但初情期至初情期后,Lin28A表达没有显著变化(P>0.05)。初情期前和初情期多浪羊垂体中Lin28A表达量较低,从初情期至初情期后垂体中Lin28A表达量极显著升高(P < 0.01)。
由图 4可知,在多浪羊初情期启动的过程中,let-7a、let-7b在下丘脑、垂体、卵巢中的表达无显著变化(P>0.05);let-7a和let-7b在垂体中表达逐渐升高,但没有达到显著水平(P>0.05)。let-7a和let-7b在下丘脑、卵巢中表达具有一定的变化,但是没有明显的规律,均没有达到显著水平(P>0.05)。
3 讨论Lin28最早是在研究秀丽隐杆线虫幼虫发育过程中被发现的,能够抑制let-7的生物合成[23-24]。目前,多种脊椎动物的Lin28A cDNA序列已被克隆出来[25]。本研究对多浪羊Lin28A基因cDNA进行克隆及序列分析,分析结果发现,多浪羊Lin28A基因cDNA 3′ UTR很长,与人、猪、小鼠等Lin28A的3′UTR相似[16]。对多浪羊Lin28A氨基酸序列与人、家鼠、牛、绵羊的同源性进行了比较,结果发现,多浪羊Lin28A氨基酸序列与人、家鼠、牛、绵羊的同源性很高,均在85%以上,说明在哺乳动物中Lin28A是高度保守的。系统发育树表明,多浪羊与哺乳动物的进化水平更为接近,与鱼类和两栖类较远,综上表明,Lin28A基因在进化的过程中符合物种进化规律,其功能比较稳定。
研究发现,Lin28A基因过表达的线虫发育延迟;Lin28A基因低表达的线虫发育提前[9]。Lin28A基因过表达的转基因小鼠阴门开口时间和初情期延迟[23]。线虫和转基因小鼠的研究表明,Lin28A低表达会导致初情期的提前,而过表达Lin28A会导致初情期的延迟。
新生大鼠下丘脑中Lin28A大量表达,在向初情期的过渡过程中,Lin28A表达急剧下降,而let-7a和let-7b在新生期到初情期的发育过程中,表达急剧上升[17]。在C57BL/6(B6)小鼠幼年期至初情期的发育过程中,下丘脑与卵巢中Lin28A mRNA表达均显著下降,但let7-a和let-7g在下丘脑、卵巢中均没有发生显著变化。本研究发现在多浪羊初情期前至初情期的过渡过程中,下丘脑、卵巢中Lin28A表达显著降低,与前人的研究结果一致[15, 17]。下丘脑是调节青春期启动的中枢,下丘脑中Lin28A的低表达可以促进动物启动初情期[25]。本研究发现在初情期前至初情期的过程中,垂体中Lin28A表达显著升高,与Grieco等[17]研究结果一致,Lin28通路在垂体中的作用可能是未来的一个重要研究领域。
Lin28与let-7之间有双重负反馈调节作用[26],let-7 miRNA可以在转录后水平抑制Lin28的翻译,降低Lin28蛋白表达水平,Lin28也可通过多种机制抑制let-7 miRNA的成熟过程。Lin28可以let-7依赖和let-7非依赖的方式调节发育[27]。本研究发现,在多浪羊初情期启动的过程中,下丘脑和卵巢Lin28A表达显著降低,而let-7a、let-7b mRNA的表达均没有下降,与Sangiao-Alvarellos等[16]、Gaytan等[13], Grieco等[17]研究结果一致。
4 结论本研究结果表明,多浪羊Lin28A cDNA序列为3 581 bp,包括2 963 bp的3′ UTR和618 bp CDS;多浪羊Lin28A氨基酸与人、家鼠、牛和绵羊的同源性分别是87.56%、88.52%、92.68%和89.95%, 与鸡、斑马鱼的同源性是76.10%、61.84%。在多浪羊初情期前至初情期的过程中,下丘脑、卵巢中Lin28A表达显著降低(P < 0.05),然而,let-7a、let-7b的表达没有显著变化(P>0.05)。本研究结果对于揭示Lin28A基因在绵羊初情期启动中的作用及机制提供了科学依据。
[1] |
邢凤, 廖秋萍. 哺乳动物初情期启动相关基因研究进展[J]. 家畜生态学报, 2017, 38(7): 1–4.
XING F, LIAO Q P. Advances on related genes at the onset of puberty for mammals[J]. Journal of Domestic Animal Ecology, 2017, 38(7): 1–4. DOI: 10.3969/j.issn.1673-1182.2017.07.001 (in Chinese) |
[2] |
曹贵玲.SSH筛选济宁青山羊性早熟相关基因及KiSS-1、GPR54、Lin28B基因的研究[D].北京: 中国农业科学院, 2011.
CAO G L.Screening of sexual precocity related genes in Jining grey goat using SSH and study on KiSS-1, GPR54 and Lin28B genes[D].Beijing: Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2011. (in Chinese) http://cdmd.cnki.com.cn/article/cdmd-82101-1011159126.htm |
[3] | KALTIALA-HEINO R, KOSUNEN E, RIMPELÄ M. Pubertal timing, sexual behaviour and self-reported depression in middle adolescence[J]. J Adolesc, 2003, 26(5): 531–545. DOI: 10.1016/S0140-1971(03)00053-8 |
[4] | GOLUB M S, COLLMAN G W, FOSTER P M D, et al. Public health implications of altered puberty timing[J]. Pediatrics, 2008, 121(S3): S218–S230. |
[5] | SHYH-CHANG N, DALEY G Q. Lin28:Primal regulator of growth and metabolism in stem cells[J]. Cell Stem Cell, 2013, 12(4): 395–406. DOI: 10.1016/j.stem.2013.03.005 |
[6] | THORNTON J E, GREGORY R I. How does Lin28 let-7 control development and disease?[J]. Trends Cell Biol, 2012, 22(9): 474–482. DOI: 10.1016/j.tcb.2012.06.001 |
[7] | GUO Y Q, CHEN Y X, ITO H, et al. Identification and characterization of lin-28 homolog B (LIN28B) in human hepatocellular carcinoma[J]. Gene, 2006, 384: 51–61. DOI: 10.1016/j.gene.2006.07.011 |
[8] |
韩威, 苏一军, 朱云芬, 等. 文昌鸡性成熟启动前后下丘脑c-Myc/LIN28B/let-7a通路表达规律分析[J]. 畜牧兽医学报, 2016, 47(4): 709–715.
HAN W, SU Y J, ZHU Y F, et al. Analysis on changes of hypothalamic c-Myc/LIN28B/let-7a pathway transcription during puberty onset in Wenchang chicken[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2016, 47(4): 709–715. (in Chinese) |
[9] | YOKOYAMA S, HASHIMOTO M, SHIMIZU H, et al. Dynamic gene expression of Lin-28 during embryonic development in mouse and chicken[J]. Gene Expr Patterns, 2008, 8(3): 155–160. DOI: 10.1016/j.gep.2007.11.001 |
[10] | SANGIAO-ALVARELLOS S, MANFREDI-LOZANO M, RUIZ-PINO F, et al. Testicular expression of the Lin28/let-7 system:Hormonal regulation and changes during postnatal maturation and after manipulations of puberty[J]. Sci Rep, 2015, 5: 15683. DOI: 10.1038/srep15683 |
[11] |
陈超, 陈菊祥. Lin28基因功能的研究进展[J]. 第二军医大学学报, 2011, 32(2): 206–208.
CHEN C, CHEN J X. Function of Lin28:An advance[J]. Academic Journal of Second Military Medical University, 2011, 32(2): 206–208. (in Chinese) |
[12] |
刘雪荣, 田文洪, 董小岩, 等. 过表达Lin28a/Lin28b对let-7家族活性的影响[J]. 病毒学报, 2011, 27(6): 533–541.
LIU X R, TIAN W H, DONG X Y, et al. Effects of Lin28a and Lin28b on let-7 family activity[J]. Chinese Journal of Virology, 2011, 27(6): 533–541. (in Chinese) |
[13] | GAYTAN F, SANGIAO-ALVARELLOS S, MANFREDI-LOZANO M, et al. Distinct expression patterns predict differential roles of the miRNA-binding proteins, Lin28 and Lin28b, in the mouse testis:Studies during postnatal development and in a model of hypogonadotropic hypogonadism[J]. Endocrinology, 2013, 154(3): 1321–1336. DOI: 10.1210/en.2012-1745 |
[14] | MOSS E G, LEE R C, AMBROS V. The cold shock domain protein LIN-28 controls developmental timing in C.elegans and is regulated by the lin-4 RNA[J]. Cell, 1997, 88(5): 637–646. DOI: 10.1016/S0092-8674(00)81906-6 |
[15] | ZHU H, SHAH S, SHYH-CHANG N, et al. Lin28a transgenic mice manifest size and puberty phenotypes identified in human genetic association studies[J]. Nat Genet, 2010, 42(7): 626–630. DOI: 10.1038/ng.593 |
[16] | SANGIAO-ALVARELLOS S, MANFREDI-LOZANO M, RUIZ-PINO F, et al. Changes in hypothalamic expression of the Lin28/let-7 system and related microRNAs during postnatal maturation and after experimental manipulations of puberty[J]. Endocrinology, 2013, 154(2): 942–955. DOI: 10.1210/en.2012-2006 |
[17] | GRIECO A, RZECZKOWSKA P, ALM C, et al. Investigation of peripubertal expression of Lin28a and Lin28b in C57BL/6 female mice[J]. Mol Cell Endocrinol, 2013, 365(2): 241–248. DOI: 10.1016/j.mce.2012.10.025 |
[18] |
侯文通.
中国西北重要地方畜禽遗传资源[M]. 北京: 中国农业出版社, 2010.
HOU W T. Important genetic resources of the native domestic animals in northwestern China[M]. Beijing: China Agriculture Press, 2010. (in Chinese) |
[19] |
卢萍平, 邢凤, 刘博丹, 等. Lin28B基因表达与绵羊初情期启动的关系研究[J]. 家畜生态学报, 2014, 35(9): 14–17.
LIU P P, XING F, LIU B D, et al. Lin28B gene expression and its role in the onset of puberty of sheep[J]. Acta Ecologiae Animalis Domastici, 2014, 35(9): 14–17. DOI: 10.3969/j.issn.1673-1182.2014.09.003 (in Chinese) |
[20] | DANTAS A, SIQUEIRA E R, FERNANDES S, et al. Influence of feeding differentiation on the age at onset of puberty in Brazilian Bergamasca dairy ewe lambs[J]. Arq Bras Med Vet Zootec, 2016, 68(1): 22–28. DOI: 10.1590/1678-4162-8278 |
[21] | CAO G L, FENG T, CHU M X, et al. Subtraction suppressive hybridisation analysis of differentially expressed genes associated with puberty in the goat hypothalamus[J]. Reprod Fertil Dev, 2015, 28(11): 1781–1787. DOI: 10.1071/RD14434 |
[22] | LIVAK K J, SCHMITTGEN T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the method[J]. Methods, 2001, 25(4): 402–408. DOI: 10.1006/meth.2001.1262 |
[23] | HEO I, JOO C, CHO J, et al. Lin28 mediates the terminal uridylation of Let-7 precursor microRNA[J]. Mol Cell, 2008, 32(2): 276–284. DOI: 10.1016/j.molcel.2008.09.014 |
[24] | VISWANATHAN S R, DALEY G Q, GREGORY R I. Selective blockade of microRNA processing by Lin28[J]. Science, 2008, 320(5872): 97–100. DOI: 10.1126/science.1154040 |
[25] | OJEDA S R, DUBAY C, LOMNICZI A, et al. Gene networks and the neuroendocrine regulation of puberty[J]. Mol Cell Endocrinol, 2010, 324(1-2): 3–11. DOI: 10.1016/j.mce.2009.12.003 |
[26] | RYBAK A, FUCHS H, SMIRNOVA L, et al. A feedback loop comprising lin-28 and let-7 controls pre-let-7 maturation during neural stem-cell commitment[J]. Nat Cell Biol, 2008, 10(8): 987–993. DOI: 10.1038/ncb1759 |
[27] | TSIALIKAS J, ROMER-SEIBERT J. LIN28:Roles and regulation in development and beyond[J]. Development, 2015, 142(14): 2397–2404. DOI: 10.1242/dev.117580 |