畜牧兽医学报  2019, Vol. 50 Issue (1): 78-85. DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2019.01.010    PDF    
多浪羊Lin28A基因克隆及其在初情期启动过程中的表达研究
邢凤1,2, 高庆华1,2, 祁鑫1,2, 李庆瑾1,2, 李闯1,2     
1. 塔里木大学动物科学学院, 阿拉尔 843300;
2. 新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室, 阿拉尔 843300
摘要:旨在克隆绵羊Lin28A基因cDNA序列,探讨其在初情期启动过程中的表达规律和调控特性。本研究分别在初情期前(第1次发情前1周)、初情期、初情期后(第1次发情后1周)屠宰多浪羊各5只。采集下丘脑、垂体、卵巢组织,对其Lin28A基因cDNA进行克隆,利用DNAman 6.0软件对多浪羊Lin28A氨基酸与其他物种的Lin28A氨基酸序列进行同源性比较。采用Real-time PCR技术分析下丘脑、垂体、卵巢中Lin28A基因、let-7alet-7b在初情期启动过程中表达的变化规律。结果表明,多浪羊Lin28A cDNA序列为3 581 bp,包括2 963 bp的3'UTR和618 bp CDS;多浪羊Lin28A氨基酸与人、家鼠、牛和绵羊的同源性分别是87.56%、88.52%、92.68%和89.95%,与鸡、斑马鱼的同源性分别是76.10%、61.84%。在初情期前至初情期的过程中,下丘脑、卵巢中Lin28A表达显著降低(P < 0.05),let-7alet-7b的表达没有显著变化(P>0.05)。本研究结果对于揭示Lin28A基因在绵羊初情期启动中的作用及机制提供了科学依据。
关键词多浪羊    初情期    Lin28A    let-7a    let-7b    
Cloning and Expression of Lin28A Gene in the Onset of Puberty in Duolang Sheep
XING Feng1,2, GAO Qinghua1,2, QI Xin1,2, LI Qingjin1,2, LI Chuang1,2     
1. College of Animal Science, Tarim University, Alar 843300, China;
2. Key Laboratory of Tarim Animal Husbandry Science and Technology, Xinjiang Production & Construction Corps, Alar 843300, China
Abstract: The objectives of the present study were to clone the Lin28A cDNA of sheep, investigate its expression patterns and regulation properties during the onset of puberty in sheep. In this study, 5 Duolang sheep were slaughtered in the prepuberty (1 week before the first estrus), puberty and postpuberty (1 week after the first estrus), respectively, hypothalamus, pituitary and ovarian tissues were collected. The Lin28A cDNA of these tissues was cloned, the homology of the amino acids of Lin28A between Duolang sheep and other species were compared by DNAman 6.0. The expression patterns of Lin28A, let-7a and let-7b in hypothalamus, pituitary and ovary during the puberal transition in Duolang sheep were detected by real-time PCR.The results showed that the fragment of Lin28A cDNA was 3 581 bp which contained 2 963 bp of 3' UTR and 618 bp of the coding region.The deduced protein sequence of the Lin28A coding region shared 87.56%, 88.52%, 92.68%, 89.95%, 76.10% and 61.84% to that of human, house mouse, cattle, sheep, original chicken and zebrafish. The expression of Lin28A was significantly decreased in the hypothalamus and ovary from prepuberty to puberty (P<0.05), the expression levels of let-7a and let-7b did not change significantly (P>0.05).The results provided a foundation for revealing the function of Lin28A gene and its role in the onset of puberty in sheep.
Key words: Duolang sheep     puberty     Lin28A     let-7a     let-7b    

初情期是动物获得繁殖能力的关键阶段[1-2],在动物生产上,培育初情期早的母畜可以节约饲养成本,增加母畜终生产仔数量,从而提高母畜利用率,也可以缩短世代间隔,加速育种进程[3-4]

Lin28是一种高度保守的RNA结合蛋白,最早发现于秀丽隐杆线虫中,是调节线虫发育时间的异时性基因[5-7]。在哺乳动物中,该基因的同源基因有Lin28ALin28B两种,两者有77%的同源性,都含有两个RNA结合结构域:一个冷休克结构域和一对CCHC锌指结构域[8]。Lin28A和Lin28B具有相同的功能,呈现不同的细胞类型分布[9]Lin28ALin28B可通过多种机制抑制let-7 miRNA的成熟过程,let-7 miRNA可以在转录后水平抑制Lin28ALin28B的翻译,降低Lin28A、Lin28B蛋白表达水平。另外,Lin28ALin28B还具有独立于miRNA的功能,可选择性地结合mRNA靶基因,从而直接刺激该基因的翻译过程[10-12]Lin28A在小鼠、鸡胚胎发育早期和胚胎干细胞中广泛表达,而其在胚胎发育晚期和成年只在心肌、下丘脑、垂体、卵巢、睾丸中表达[9]Lin28A在成年大鼠胎盘、睾丸、卵巢和垂体中高表达,在下丘脑中等程度的表达[13]

研究发现,Lin28/let-7在动物初情期启动中发挥重要调控作用[9-10]。Moss等[14]研究发现,Lin28A基因调节线虫发育过程,Lin28A基因过表达,导致发育延迟,然而,Lin28A基因表达缺少,导致发育提前。Zhu等[15]发现,Lin28A基因过表达的转基因小鼠,阴门开口时间和初情期延迟,下丘脑、垂体、卵巢中过表达Lin28A基因,但let-7alet-7g表达并未下降,且let-7水平并不影响下丘脑-垂体-性腺轴(HPGA)细胞的生长。Sangiao-Alvarellos等[16]研究发现,Lin28A mRNA在新生雌、雄大鼠下丘脑中大量表达,在幼年期至初情期的过渡中,表达急剧下降,而let-7alet-7b在新生雌、雄大鼠下丘脑中表达很少,在幼年至青春期的过渡中,表达急剧上升。Grieco等[17]研究发现,与20日龄C57BL/6(B6)小鼠相比,25、30日龄和初情期后,C57BL/6(B6)小鼠卵巢中Lin28A mRNA表达显著下降,下丘脑中Lin28A mRNA表达也显著下降,但let7-alet-7g miRNA在下丘脑、卵巢中均没有发生显著变化。Lin28A基因在下丘脑、卵巢等的表达呈发育性变化,且达到初情期时表达明显下降,let-7 miRNA表达变化显著或者没有发生显著变化,Lin28A可能通过调控let-7的方式或独立于let-7的方式对下丘脑-垂体-性腺轴(HPGA)进行调节,从而启动初情期到来。

多浪羊是新疆羊肉优良风味的典型代表,也是本地区主要地方绵羊品种和肉食来源。虽然在南疆相同的生态环境条件下,与其他地方绵羊品种相比,多浪羊具有独特的繁殖特点,是新疆典型的早熟品种,母羊3~4月龄达到初情期,常年发情、繁殖性能高[18-19],本研究以性早熟的多浪羊为研究对象,对其Lin28A基因cDNA进行克隆,采用Real-time PCR技术分析下丘脑、垂体、卵巢中Lin28A基因在初情期启动过程中的表达变化规律,以进一步揭示Lin28A基因在多浪羊初情期启动中的作用,为从遗传上缩短绵羊的初情期年龄提供科学依据。

1 材料与方法 1.1 试验动物及样品采集

选择饲养于南疆疆南牧业有限公司、饲养环境条件相同,体重相近,出生日期接近的未发情的雌性多浪羊为试验动物,自90日龄起对母羊进行初情期(第1次发情)观察,参照Dantas等[20]和Cao等[21]初情期鉴定方法,每天将性成熟公羊(包扎阴茎)放入母羊群中试情2次,发情母羊外部表现为精神不安,爱走动,静立接受公羊爬跨为发情标准,分别在初情期前(第1次发情前1周)、初情期、初情期后(第1次发情后1周)屠宰多浪羊各5只。在无菌条件下用专门处理过的手术器械快速采集下丘脑、垂体、卵巢组织,立即放入液氮保存。

1.2 总RNA提取和cDNA的合成 1.2.1 总RNA提取

采用TRIzol-酚-氯仿一步法提取上述采集的下丘脑、垂体、卵巢组织总RNA,利用紫外分光光度法和1%琼脂糖对总RNA浓度和质量进行检测,-20 ℃保存备用。

1.2.2 cDNA的合成

按照反转录试剂盒的说明书进行,首先混合总RNA 2 μL(约2 μg),oligo (dT)18(0.25 μg·μL-1)2 μL,dNTPs (2.5 mmol·μL-1) 2 μL和RNase free H2O 7 μL,然后65 ℃ 5 min,冰浴2 min。再加入5×First-Strand Buffer 4 μL,DTT(0.1 mol·L-1) 1 μL,RNase inhibitor (40 U·μL-1)1 μL,SuperscriptTM Ⅲ反转录酶(200 U·μL-1) 0.6μL,最后加RNase free H2O水补足总体积到25 μL,按照55 ℃ 60 min,70 ℃ 15 min进行反转录。RT产物-20 ℃保存备用。

1.3 引物合成、PCR扩增

根据NCBI中公布的绵羊Lin28A基因mRNA序列(XM_012153431.1)设计引物(表 1),利用垂体组织总RNA,反转录成cDNA, 扩增多浪羊Lin28A基因CDS序列和3′ UTR。RT-PCR反应程序: 95 ℃预变性5 min;95 ℃ 20 s, 60 ℃退火30 s, 35个循环;75 ℃ 5 min。将扩增出的PCR产物凝胶回收、克隆测序,然后用DNA Star软件组装,BLSAT进行序列对比和分析。

表 1 基因克隆及定量PCR引物 Table 1 Primer sequences of gene cloning and qPCR
1.4 多浪羊Lin28Alet-7alet-7b表达分析

根据克隆得到的多浪羊Lin28A基因cDNA序列跨内含子设计引物(表 1),用Real-time PCR(qPCR)试剂盒检测Lin28A基因在下丘脑、垂体、卵巢中的表达量,以内参基因ACTB作为对照。根据miRbase中提供的miRNA成熟序列,设计引物,以U6作为内参基因。引物序列:let-7a F: 5′-GCTGAGGTAGTAGGTTGTATAGTT-3′;let-7b F: 5′-GTGAGGTAGTAGGTTGTGTGGT-3′;let-7alet-7b的下游引物由Sino Gene One-step miRNA反转录试剂盒自带;U6 F: 5′-CTCGCTTCGGCAGCACATAT-3′,U6 R: 5′-AACGCTTCACGAAT-TTGCGT-3′。

qPCR反应体系:2×SG Green qPCR Mix 7.5 μL,10 μL· L-1的上下游引物各0.5 μL,1 μL cDNA,5.5 μL ddH2O;qPCR反应程序: 95 ℃预变性10 min;95 ℃ 20 s,60 ℃退火30 s,40个循环;95 ℃ 15 s,60 ℃ 30s,95 ℃ 15 s。

每个样品重复检测3次,定量完成后得到不同样本的Ct值,利用2-△△CT法计算Lin28Alet-7alet-7b相对表达量[22]

1.5 多浪羊Lin28A的生物信息学分析及数据分析

采用DNAMAN version 6.0软件进行引物设计、氨基酸序列相似性比较。SignalP 3.0在线分析软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)分析信号肽;利用TMHMM软件进行跨膜区分析;Mega 5.0软件构建系统发育树。采用SPSS 21.0进行单因素方差分析,分析结果用“平均数±标准差”表示。P < 0.05表示差异显著;P < 0.01表示差异极显著。

2 结果 2.1 多浪羊Lin28A基因cDNA克隆与特征分析

以多浪羊垂体组织总RNA为模板,通过RT-PCR、克隆测序获得了多浪羊Lin28A基因cDNA序列(GenBank登录号:MG708181),大小为3 581 bp,包括2 963 bp的3′UTR和618 bp的CDS。该CDS编码205个氨基酸(图 1),蛋白质分子量为22.37 ku,等电点为8.17。通过SMART数据库分析发现Lin28A蛋白含有一个N-末端CSD结构域和一对CCHC锌指结构域。

图 1 多浪羊Lin28A编码区及氨基酸序列 Figure 1 Duolang sheep Lin28A cDNA and deduced amino sequences
2.2 Lin28A序列同源性与系统发育分析

利用DNAman 6.0软件对多浪羊、人、家鼠、牛等物种的Lin28A氨基酸进行同源性比较(图 2),结果发现,多浪羊Lin28 A氨基酸序列与人、家鼠、牛和绵羊的同源性分别是87.56%、88.52%、92.68%和89.95%,与鸡、斑马鱼的同源性分别是76.10%和61.84%。用TMHMM软件分析预测Lin28A蛋白的跨膜区,发现Lin28A不是跨膜蛋白,说明它可能位于胞质或核中。

人(NP_078950.1);家鼠(NP_665832.1);牛(NP_001179986.1);绵羊(AEY81218.1);鸡(AAZ38895.2);斑马鱼(NP_957385.1).下同 Human(NP_078950.1); House mouse(NP_665832.1); Cattle(NP_001179986.1); Sheep(AEY81218.1); Chicken(AAZ38895.2); Zebrafish(NP_957385.1). The same as below 图 2 不同物种Lin28A氨基酸序列比较结果 Figure 2 Comparation of Lin28A amino acid sequence among different species

利用SignalP 3.0软件进行信号肽分析,发现多浪羊Lin28A蛋白无信号肽。利用多浪羊Lin28A蛋白质序列与GenBank数据库中其它物种的Lin28A蛋白质序列,构建了NJ系统进化树(图 3),表明多浪羊与牛、绵羊聚在一起;人、家鼠形成了亲缘关系较近的另一支;鸡、斑马鱼与其它哺乳动物的亲缘关系较远。

图 3 利用Neighbor-Joining对Lin28A进行进化树分析 Figure 3 Phylogenetic rooted tree analysis of Lin28A proteins by the Neighbor-Joining method
2.3 多浪羊初情期启动过程中Lin28Alet-7alet-7b表达分析

对多浪羊Lin28Alet-7alet-7b在下丘脑、垂体及卵巢中的表达情况进行qPCR分析(图 4)。图 4可以看出,多浪羊初情期前下丘脑与卵巢中Lin28A表达量较高,从初情期前至初情期的过程中,下丘脑、卵巢中Lin28A基因表达显著下降(P < 0.05),但初情期至初情期后,Lin28A表达没有显著变化(P>0.05)。初情期前和初情期多浪羊垂体中Lin28A表达量较低,从初情期至初情期后垂体中Lin28A表达量极显著升高(P < 0.01)。

不同的大写字母表示同一组织在不同阶段间差异极显著(P < 0.01);不同的小写字母表示同一组织在不同阶段间差异显著(P < 0.05) Different uppercase letters indicate that the expression in the same tissue are very significantly different at different stages (P < 0.01). Different lowercase letters indicate that the expression in the same tissue are significant differences at different stages(P < 0.05) 图 4 多浪羊Lin28Alet-7alet-7b在下丘脑、垂体、卵巢中的表达量 Figure 4 Lin28A, let-7a, let-7b relative expression levels in hypothalamus, pituitary and ovary of Duolang sheep

图 4可知,在多浪羊初情期启动的过程中,let-7alet-7b在下丘脑、垂体、卵巢中的表达无显著变化(P>0.05);let-7alet-7b在垂体中表达逐渐升高,但没有达到显著水平(P>0.05)。let-7alet-7b在下丘脑、卵巢中表达具有一定的变化,但是没有明显的规律,均没有达到显著水平(P>0.05)。

3 讨论

Lin28最早是在研究秀丽隐杆线虫幼虫发育过程中被发现的,能够抑制let-7的生物合成[23-24]。目前,多种脊椎动物的Lin28A cDNA序列已被克隆出来[25]。本研究对多浪羊Lin28A基因cDNA进行克隆及序列分析,分析结果发现,多浪羊Lin28A基因cDNA 3′ UTR很长,与人、猪、小鼠等Lin28A的3′UTR相似[16]。对多浪羊Lin28A氨基酸序列与人、家鼠、牛、绵羊的同源性进行了比较,结果发现,多浪羊Lin28A氨基酸序列与人、家鼠、牛、绵羊的同源性很高,均在85%以上,说明在哺乳动物中Lin28A是高度保守的。系统发育树表明,多浪羊与哺乳动物的进化水平更为接近,与鱼类和两栖类较远,综上表明,Lin28A基因在进化的过程中符合物种进化规律,其功能比较稳定。

研究发现,Lin28A基因过表达的线虫发育延迟;Lin28A基因低表达的线虫发育提前[9]Lin28A基因过表达的转基因小鼠阴门开口时间和初情期延迟[23]。线虫和转基因小鼠的研究表明,Lin28A低表达会导致初情期的提前,而过表达Lin28A会导致初情期的延迟。

新生大鼠下丘脑中Lin28A大量表达,在向初情期的过渡过程中,Lin28A表达急剧下降,而let-7alet-7b在新生期到初情期的发育过程中,表达急剧上升[17]。在C57BL/6(B6)小鼠幼年期至初情期的发育过程中,下丘脑与卵巢中Lin28A mRNA表达均显著下降,但let7-alet-7g在下丘脑、卵巢中均没有发生显著变化。本研究发现在多浪羊初情期前至初情期的过渡过程中,下丘脑、卵巢中Lin28A表达显著降低,与前人的研究结果一致[15, 17]。下丘脑是调节青春期启动的中枢,下丘脑中Lin28A的低表达可以促进动物启动初情期[25]。本研究发现在初情期前至初情期的过程中,垂体中Lin28A表达显著升高,与Grieco等[17]研究结果一致,Lin28通路在垂体中的作用可能是未来的一个重要研究领域。

Lin28与let-7之间有双重负反馈调节作用[26]let-7 miRNA可以在转录后水平抑制Lin28的翻译,降低Lin28蛋白表达水平,Lin28也可通过多种机制抑制let-7 miRNA的成熟过程。Lin28可以let-7依赖和let-7非依赖的方式调节发育[27]。本研究发现,在多浪羊初情期启动的过程中,下丘脑和卵巢Lin28A表达显著降低,而let-7alet-7b mRNA的表达均没有下降,与Sangiao-Alvarellos等[16]、Gaytan等[13], Grieco等[17]研究结果一致。

4 结论

本研究结果表明,多浪羊Lin28A cDNA序列为3 581 bp,包括2 963 bp的3′ UTR和618 bp CDS;多浪羊Lin28A氨基酸与人、家鼠、牛和绵羊的同源性分别是87.56%、88.52%、92.68%和89.95%, 与鸡、斑马鱼的同源性是76.10%、61.84%。在多浪羊初情期前至初情期的过程中,下丘脑、卵巢中Lin28A表达显著降低(P < 0.05),然而,let-7alet-7b的表达没有显著变化(P>0.05)。本研究结果对于揭示Lin28A基因在绵羊初情期启动中的作用及机制提供了科学依据。

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