, XU Kui, WEI Yinghui, QIU Yiqing, ZHANG Xiuling, WANG Bingyuan, LIU Zhiguo, MU Yulian
, LI Kui
Patatin样磷脂酶域蛋白(pantatin-like phospholipase domain containing protein, PNPLA)家族属于新型脂肪酶家族，该家族成员的特点是N末端含有高度保守的Patatin结构域。Patatin部分结构包含二联体形式的催化中心，通过X射线晶体衍射技术确定其为二联体三维结构，该结构N端中存在由α螺旋β折叠链构成的用于分解脂肪的脂酶特殊结构区域，并包含特征性的保守序列Gly-X-Ser-X-Gly(氨基酸位置为Gly45-Gly49)[1]，这种特殊的Patatin结构使得该家族成员具有非特异性磷脂酶/酰基转移酶活性，能够促进甘油三酯的水解[2]。Wilson等[3]利用生物信息学等技术，对人的PNPLA家族序列进行比对，发现该家族包含10个成员，分别命名为PNPLA1~PNPLA10。PNPLA家族成员3′C端有两种不同的分子序列与脂滴相关联：1)由亲水基团组成的具有保守性的LD靶向结构域(LD targeting motif, LTM)；2)包含40个疏水残基的甘油三酯脂肪酶，说明该家族成员以不完全相同的方式参与甘油三酯的水解。Lake等[2]首次证实PNPLA5属于新型脂肪酶PNPLA家族，其N端含有特异性保守结构域。PNPLA5基因含有Patatin结构域，却具有种属表达特异性，主要表现：ob/ob小鼠肝及肺组织高表达；人脑组织中表达量较高，肝内表达量相对较低[3]；雄性大鼠睾丸、附睾组织中高表达，雌性大鼠子宫及卵巢组织中表达量较高[4]；在鸡DNA或蛋白序列数据库中均没有找到类似于人方面已知的同源基因，同时在鸡的表达序列标签数据库中也没有找到相关的表达序列标签，推测PNPLA5可能在鸡的体内不表达[5]。PNPLA5基因通过3′末端的LTM精氨酸残基靶向脂滴，表现出酯酶活性[6-7]，其过表达能够降低细胞内甘油三酯水平[2]。PNPLA5 mRNA在野生型和PNPLA3-/-小鼠的肝组织中表达量相似，但在PNPLA3-/-小鼠的脂肪组织中表达量增加，高脂高糖诱导刺激小鼠肝组织中PNPLA5表达量显著增加达到与PNPLA3相似水平，PNPLA5可能部分弥补了PNPLA3的缺陷，表明PNPLA5的表达可能在调控脂肪代谢的过程中发挥重要作用。PNPLA5基因缺失引起雄性大鼠血清总胆固醇(total cholesterol, TC)、甘油三酯(triglyceride, TG)和高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol, HDL-C)含量显著升高，表明PNPLA5基因与脂代谢相关，其缺失可能导致脂代谢紊乱[4]。脂代谢紊乱能够引起雄性生殖系统发育迟缓、睾酮水平下降、精子畸形率升高、精子运动性能及顶体反应水平降低，最终导致生殖功能障碍。本实验室前期研究初步发现，PNPLA5基因影响了大鼠的妊娠率，但其分子机制尚不清楚。为进一步探讨该基因与雄性繁殖的关系，本研究以PNPLA5敲除型雄性大鼠为试验动物模型，旨在研究PNPLA5基因对雄性大鼠繁殖性能的影响，可能为家畜繁殖研究提供重要的参考依据。
1 材料与方法 1.1 试验动物PNPLA5敲除型大鼠由中国医学科学院医学实验动物研究所制备，SD雌鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。野生型及PNPLA5敲除型大鼠均饲养在北京大学医学部实验动物科学部。大鼠自由饮水、摄食，动物房内12 h昼夜循环，温度控制在室温(25 ℃左右)。普通饲料(华阜康公司，北京)喂养野生型和PNPLA5敲除型大鼠。
1.2 主要试剂DNA提取试剂盒、高纯度总RNA快速提取试剂盒及反转录试剂盒均购自北京百泰克生物技术有限公司；E×Taq酶、DNA marker、5×buffer均购自TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司；HBSS购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；蛋白酶K、Trizol购自Life technologies公司；4%多聚甲醛购自康为世纪有限公司；细胞色素C(cytochrome C，Cytc)及细胞色素C氧化酶亚基Ⅳ(cytochrome C oxidase subunit Ⅳ，COX Ⅳ)抗体均购自Cell Signaling Technology公司；引物由天一辉远生物科技有限公司合成。
1.3 PNPLA5基因敲除鼠鉴定采集大鼠脚趾，将组织剪碎，加入20 μL蛋白酶K及200 μL裂解液，55 ℃摇床水浴消化过夜。严格按照DNA提取试剂盒说明书提取DNA，将提取的DNA按照以下扩增体系进行扩增：E×Taq 10 μL，PNPLA5-F 0.2 μL，PNPLA5-R 0.2 μL，ddH2O 8.6 μL，DNA 1 μL，共20 μL。上游引物(PNPLA5-F)：5′-CAGCACCAAGGCTGAGGAGT-3′；下游引物(PNPLA5-R)：5′- ATGAGTTCATCCCGAGTGGC-3′。扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共34个循环；72 ℃ 10 min。扩增产物由2%琼脂糖凝胶电泳分离扩增片段，凝胶成像系统拍照，同时将PCR产物送北京天一辉远生物科技有限公司测序。
1.4 RT-PCR检测PNPLA5基因表达量为了检测PNPLA5基因的敲除效果，笔者在RNA水平检测该基因的表达量。将采集的睾丸组织经液氮研磨成粉，放入装有Trizol的EP管中，按照高纯度总RNA快速提取试剂盒说明书提取RNA，提取的RNA用NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, USA)测其浓度。每个样品取1 μg，经反转录试剂盒反转成cDNA，将cDNA进行RT-PCR扩增。扩增体系：目的基因为E×Taq 10 μL，PNPLA5-F 0.2 μL，PNPLA5-R 0.2 μL，ddH2O 8.6 μL，cDNA 1 μL，共20 μL；内参基因扩增体系：E×Taq 10 μL，GAPDH-F 0.2 μL，GAPDH-R 0.2 μL，ddH2O 8.6 μL，cDNA 1 μL，共20 μL。引物序列见表 1，PCR扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共34个循环；72 ℃ 10 min。扩增产物经3%琼脂糖凝胶电泳分离条带，凝胶成像系统拍照。
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表 1 RT-PCR引物序列 Table 1 Primer sequences for RT-PCR |
选取3月龄野生型与PNPLA5敲除型雄性大鼠各10只，按照1雄1雌合笼，合笼次日检查雌鼠有无阴道栓，若没有发现阴道栓则进行阴道涂片检查有无精子，当看到雌鼠阴部出现阴道栓或显微镜观察发现精子的当天则为妊娠的第1天，将受孕雌鼠单笼饲养。直到第7天仍没有见阴道栓或阴道抹片没有发现精子的雌鼠也要单笼饲养，记录雌鼠见栓、妊娠情况及产仔数。如果该雌鼠到22 d时还没有产仔，则解剖检查其子宫内是否有仔鼠，若没有仔鼠则认定为未成功妊娠。与雌鼠交配的雄鼠休息2 d，再与另外一只雌鼠合笼，每只雄鼠按以上描述反复进行4个繁殖周期，记录每只雌鼠及雄鼠的繁殖情况[8]。
1.6 大鼠精子运动性能分析颈椎脱臼处死大鼠，立即取其附睾尾置于37 ℃预热的HBSS液中，弃去周围脂肪组织，沿其纵轴切割4刀，置于预热的精子获能液中，37 ℃培养箱中孵育2 min。将附睾尾置于另一预热的精子获能液中，37 ℃、5% CO2培养箱孵育30 min，使精子充分游出。计算机辅助精子分析仪(computer aided sperm analysis, CASA)分析精子运动性能。
1.7 Western blot检测精子线粒体功能相关蛋白的表达水平收集的精子置于蛋白裂解液中，使用超声波破碎仪破碎精子细胞，冰上孵育30 min。按照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书操作，测其蛋白浓度。将蛋白样品与蛋白变性buffer混匀，99 ℃加热10 min，以使蛋白质热变性。将总蛋白为20 μg的样品溶液进行电泳分离(胶配制浓度为12.5%)，蛋白质经电泳分离转移到硝酸纤维素膜上(200 mA电流转膜2 h)。转移后取出滤膜，放入盛有用TBST配制成的5%脱脂奶粉液内，放在摇床上室温封闭滤膜2 h，将滤膜放入由TBST配制成1:1 000的一抗稀释液中，放在摇床上室温孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min。用1:3 000稀释的二抗与滤膜温育，在摇床上孵育40 min，TBST洗膜3次，每次10 min，化学发光仪显色拍照，β-actin为内参蛋白。
1.8 大鼠睾丸组织的HE染色睾丸组织浸入4%多聚甲醛中，室温固定过夜，切成约3 mm组织块。酒精、二甲苯脱水，石蜡包埋，切片机上连续切片，将切下来的5~7 μm组织切片进行展片，捞片，贴在多聚赖氨酸包被的防脱载玻片上。二甲苯脱蜡至水，苏木素-伊红染色，显微镜下观察拍照。
1.9 数据分析应用Excel对数据进行初步处理，采用SPSS20进行统计分析，所有数据均以“平均值±标准差”表示，P < 0.05表示差异显著, P < 0.01表示差异极显著。
2 结果 2.1 大鼠基因型鉴定为了后续试验，笔者对大鼠的基因型进行了鉴定。结果表明，在229 bp处仅有1条带为PNPLA5敲除型大鼠，824 bp处仅有1条带为野生型大鼠，229与824 bp处均有条带为PNPLA5杂合型大鼠(图 1)。测序分析表明，与野生型大鼠相比，敲除型大鼠序列缺失595 bp，造成移码突变，终止密码子提前终止(图略)。
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M.100 bp DNA ladder maker；1、2、4、8.敲除型；5.野生型；3、6、7、9.杂合型 M.100 bp DNA ladder maker; 1.2.4.8.Knockout; 5.Wild type; 3.6.7.9.Heterozygous 图 1 PCR检测大鼠基因型 Figure 1 Identification the genotype of rats by PCR |
RT-PCR检测结果发现，野生型大鼠睾丸组织中PNPLA5基因表达量较高且条带较单一，而敲除型大鼠未检测到条带(图 2)，表明PNPLA5基因敲除效果较为理想。
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M.100 bp DNA ladder marker；1、2.野生型；3~5.PNPLA5敲除型 M.100 bp DNA ladder marker; 1, 2.Wild type(WT); 3-5.PNPLA5 knockout (KO) 图 2 RT-PCR检测结果 Figure 2 RT-PCR test results |
选取3月龄野生型及PNPLA5敲除型雄鼠各10只，分别与80日龄野生型雌鼠合笼，统计雌鼠的妊娠率(产仔雌鼠数与见栓雌鼠数的百分率)及产仔数(只有成功产仔的雌鼠才被记录)。统计分析表明，与野生型雄鼠相比，PNPLA5基因敲除雄鼠与野生型雌鼠配种后，雌鼠的妊娠率极显著降低(P < 0.01), 平均产仔数有下降趋势，但差异不显著(P>0.05)。(表 2)
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表 2 不同类型PNPLA5雄性大鼠与野生型雌鼠交配的繁殖数据 Table 2 Reproductive data of different PNPLA5 male rats mate with wild type femal rats |
精子运动性分析发现，PNPLA5基因敲除分别导致精子曲线运动速度(curvilinear velocity, VCL)显著降低(P < 0.05)及渐进运动精子的百分率(percentage of sperm with progressive movement, progressive)极显著降低(P < 0.01)。敲除型大鼠精子的平均轨迹速度(average path velocity，VAP)、直线运动速度(straight line velocity，VSL)和横向振幅(lateral amplitude, ALH)有下降趋势，但变化均不显著(P>0.05)(图 3)。
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*.P < 0.05；**.P < 0.01；ns.P>0.05，图 4B同 *.P < 0.05; **.P < 0.01; ns.P>0.05.The same as Fig. 4B 图 3 大鼠精子运动能力分析 Figure 3 Sperm motility analysis in rats |
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A.Cytc、COX Ⅳ蛋白Western blot分析；B.相对灰度值分析 A.Western blot analysis of Cytc and COX Ⅳ; B.Relative gray value analysis 图 4 Cytc与COX Ⅳ蛋白表达水平检测 Figure 4 Detection of Cytc and COX Ⅳ expression levels |
Western blot结果显示，与野生型大鼠相比，PNPLA5敲除型大鼠精子中Cytc蛋白表达量下调，COX Ⅳ蛋白表达量上调(图 4A)，统计分析表明，Cytc、COX Ⅳ蛋白表达量均没有发生显著变化(P>0.05)(图 4B)。
2.6 大鼠睾丸组织病理性检测HE染色结果表明，野生型大鼠睾丸各阶段生精细胞由基底向管腔依次排列在曲细精管中(图 5A); 而PNPLA5敲除大鼠睾丸组织结构疏松，曲细精管中各阶段生精细胞排列紊乱，初级精母细胞、次级精母细胞、延长型精子等脱落至管腔(图 5B)，表明PNPLA5基因缺失引起雄性大鼠睾丸组织发生明显病理变化。
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A.野生型大鼠(WT)；B.PNPLA5敲除型大鼠(KO)。红色箭头表示初级精母细胞；蓝色箭头表示次级精母细胞；绿色箭头表示延长型精子 A.Wild type rats (WT); B.PNPLA5 knockout rats(KO).Red arrow. Primary spermatocyte; Blue arrow.Secondary spermatocyte; Green arrow.Elongating sperm 图 5 大鼠睾丸组织病理切片HE染色 Figure 5 The rat testis pathological section by HE staining |
PNPLA5属于新型脂肪酶PNPLA家族，其N端含有高度保守的Patatin结构域，具有脂酶活性。Lange等[9]报道，PNPLA5与低密度脂蛋白胆固醇水平相关，是除LDLR、PCSK9之外能引起家族性高胆固醇血症的新基因。定位于脂滴中的PNPLA5能够在脂滴自噬初期促进自噬体膜的形成，增加自噬能力[10]，过表达PNPLA5会降低脂滴内储存的甘油三酯含量[2]。关于PNPLA5的研究主要集中在细胞方面，个体方面研究较少。为进一步研究PNPLA5基因的功能，本实验室前期制备了PNPLA5基因敲除型大鼠。本研究中通过PCR、测序及RT-PCR的方法检测基因位点的修饰情况，PCR、测序分析表明，两个靶向位点之间产生片段缺失，RT-PCR检测发现，PNPLA5在野生型大鼠睾丸中表达量较高，而敲除型大鼠睾丸组织内未检测到该基因表达，说明成功得到了PNPLA5敲除型大鼠。Liu等[4]检测3月龄PNPLA5敲除型与野生型雄性大鼠的血脂指标，发现PNPLA5基因缺失引起雄性大鼠血清中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平显著升高，表明PNPLA5的表达水平与血脂代谢相关。血脂代谢异常造成精子功能紊乱，降低精液质量参数、精子能动性及精子获能能力[11-12]。Fan等[13]研究发现，高脂饮食诱导肥胖型雄性小鼠配种后雌鼠的妊娠率显著降低，但平均产仔数没有显著变化，发现高脂诱导破坏小鼠血睾屏障的完整性，导致精子顶体反应水平显著降低，最终引起雄鼠繁殖性能下降，推测血睾屏障的破坏可能是引起繁殖性能降低的原因之一。本研究扩大了繁殖性能检测的样本数，结果发现，PNPLA5基因敲除型雄性大鼠与野生型雌鼠配种后，雌鼠的妊娠率显著降低，进一步确认PNPLA5基因与雄性繁殖相关，但平均产仔数没有显著变化，与上述表型一致[13]，推测其原因可能与血睾屏障的完整性相关，因此，血睾屏障的检测是下一步研究的重点。精子运动性能分析发现，PNPLA5敲除大鼠精子运动性能指标VCL及Progressive显著降低。精子线粒体功能状态直接影响到精子是否有足够的运动能量来源，与男性不育的产生相关[14]。本研究检测了精子线粒体功能相关蛋白Cytc及COX Ⅳ的蛋白含量，结果显示，其蛋白表达量没有显著差异，提示精子运动性能降低可能不是Cytc和COX Ⅳ导致，其具体原因需进一步研究证实。
雄性繁殖性能降低常常伴随睾丸组织萎缩[15]，生精小管及基膜组织结构完整性的破坏，生精上皮细胞脱落，空泡化[16-17]精子发生紊乱[18-19]等病理变化。Wang等[20]报道，BRD7的敲除导致小鼠睾丸延长型精子细胞退化，引起精子发生阻滞，从而影响雄性小鼠的繁殖性能。雄性生殖细胞特异性敲除亨廷顿基因小鼠的睾丸管腔出现空泡化表型，曲细精管中圆形精子排列紊乱，大量多核细胞脱落于管腔中，导致雄性小鼠不育[21]。本研究发现，PNPLA5基因敲除鼠睾丸组织形态结构发生变化，主要表现为曲细精管中各阶段生精细胞排列紊乱，初级精母细胞、次级精母细胞、延长型精子等脱落至管腔中，推测大鼠睾丸组织病理变化可能是影响其繁殖性能的原因之一。
4 结论本研究以PNPLA5敲除型雄性大鼠为试验动物模型，发现PNPLA5基因敲除引起雄性大鼠睾丸上皮细胞脱落及精子运动性能降低，从而可能引起雄性生殖性能下降。
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