2. 高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室, 贵阳 550025;
3. 六盘水市草地工作站, 六盘水 553001
2. Key Laboratory of Animal Genetics, Breeding and Reproduction in the Plateau Mountainous Region of Ministry of Education, Guiyang 550025, China;
3. The Grass Workstation of Liupanshui City, Liupanshui 553001, China
肝X受体(liver X-activated receptors α，LXRα)是核受体LXRs基因的亚型之一，是调节胆固醇和脂肪酸代谢的重要调控因子，其主要通过与对应配体结合而被激活表达，从而促进相应靶基因的表达，调控机体胆固醇的转化及三酰甘油合成等脂质代谢，其被认为是重要的脂质传感器[1]。目前的研究已证实，LXRα表达能有效抑制心血管疾病和降低动脉粥样硬化的发生，属于核受体家族成员转录因子，主要通过与配体结合从而调控相应靶基因的表达，并且LXRα可通过其激动剂与抑制剂的调控从而参与调节机体胆固醇的转化及三酰甘油合成等脂质代谢[2-4]。LXRα RNAi不仅可抑制LXRα蛋白及mRNA的表达，还可降低胆固醇调控元件结合蛋白1c(sterol regulatory element binding protein 1c, SREBP1c)的表达，大鼠肝细胞中的脂肪积累也因此降低[5]。有研究表明，甜菜碱能上调大鼠肝中LXRα和PPARα的表达及缓解内质网应激，起到改善肝脂质堆积、糖异生和炎症的作用[6]。近年来的研究发现，藏猪肝miR-1低度表达可能是通过增加LXRα表达来促进脂质合成和累积[7]。随着研究不断深入，有关LXRα的调控机制和功能不断被揭示，研究证明，LXRs激动剂可刺激肝内较大的富含三酰甘油的极低密度脂蛋白(VLDL)微粒的产生，同时使小鼠血浆中和肝细胞内的三酰甘油的浓度和含量明显增加；缺失LXRα的小鼠，其三酰甘油的含量是野生型小鼠的1/4[8-9]。另外一项研究表明，LXRα可以通过调节胆固醇7α-羟化酶(CYP7α1)基因的表达来调控胆固醇的流出[10]。有研究证实，在前体细胞分化过程中，LXRα基因表达明显增加[11]。当阻断LXRα表达后脂肪细胞分化受阻[12]。LXRα基因敲除使得小鼠的脂肪组织脂质沉积明显减少[13]。这些都说明LXRα参与脂肪细胞的分化过程，LXRα是调节胆固醇和脂肪酸代谢的重要调控因子。有关LXRα基因功能的研究受到各个生命学科领域的广泛关注，但是针对该基因在家禽的研究上比较少，尤其是在细胞水平上的研究鲜有报道，导致鸭LXRα基因的功能机制一直处在待揭示状态。
本研究通过构建鸭LXRα基因的真核过表达载体，转染鸭原代肝细胞和PC3细胞，从细胞水平上探索鸭LXRα基因的表达调控效应，为亟待解决的家鸭脂肪过度沉积的问题奠定理论基础。
1 材料与方法 1.1 试验动物10周龄健康无病的樱桃谷肉鸭及种蛋均来自贵州大学科研鸭场。10周龄健康无病的樱桃谷肉鸭用于提取肝组织总RNA。种鸭蛋放入温度为37 ℃，湿度60%的孵化箱进行孵化，第7天时进行照蛋，剔除无精蛋、死胎蛋，其余继续孵化用于鸭原代肝细胞的分离培养。
1.2 主要材料质粒小量抽提试剂盒、T-载体PCR产物克隆试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒购自上海生工生物股份有限公司；无内毒素质粒小提试剂盒购自OMEGA公司；大肠杆菌感受态细胞DH5α购自大连TaKaRa公司；引物、脂质体3000、Trizol及异丙醇购自Invitrogen公司；氯仿由贵州大学动物科学学院试剂采购中心订购；胰酶、OPTI-MEM、DMEM高糖培养基购自HyClone公司；胎牛血清购自Gibco公司；PC3细胞购自中国科学院上海细胞库；三酰甘油、总胆固醇、高密度脂蛋白及低密度脂蛋白检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所有限公司；His标签检测试剂盒购自上海江莱生物科技有限公司。
1.3 鸭原代肝细胞的制备参照本课题组前期的研究[14]制备鸭原代肝细胞。将孵化至适当胚龄的胚蛋清洗消毒，经碘酒和75%酒精擦洗鸭胚表面后，在无菌条件下取出胚胎，放入盛有PBS的无菌平皿中清洗至无血迹为止；剖开腹部取出肝，置于PBS缓冲液中轻轻清洗，以保证去除肝组织上的其他附属物；用眼科剪将清洗干净的肝组织剪碎，5倍体积胶原酶Ⅳ于37 ℃水浴消化35 min，每隔5 min吹打混匀；用等体积血清培养基终止消化，200目细胞筛过滤，滤液转移至10 mL无酶离心管中，800 r·min-1离心5 min；弃上清，血清培养基悬浮细胞，冰水混合物中冰浴8 min，800 r·min-1离心5 min，重复此步骤一次；加DMEM完全培养基，形成肝细胞悬液，轻轻吹打均匀，用血细胞计数板计数肝细胞量，0.4%台盼蓝染色试验判断肝细胞存活率。按试验设计需要调整肝细胞密度接种到培养瓶，于37 ℃，5% CO2培养箱中进行培养。
1.4 鸭LXRα基因真核过表达载体的构建 1.4.1 总RNA提取与cDNA合成采集10周龄健康无病的樱桃谷鸭的肝组织，通过Trizol-氯仿-异丙醇RNA提取法提取肝RNA，置-80 ℃冰箱保存备用，按照Thermo Fisher cDNA逆转录试剂盒操作规程，合成第一链cDNA，置-80 ℃冰箱保存备用。
1.4.2 引物设计及LXRα基因CDS区扩增根据NCBI登录的鸭LXRα 基因(GenBank：FJ966078.2)序列及pEGFP-N3载体信息设计携带酶切位点和HIS标签的特导引物，引物序列为F：5′-GAAGATCTATGCATCATCACCATCACCATGGGAAGAGGGTGGCAAGTGTA-3′ (Bgl Ⅱ)，R：5′-GGGGTACCGTCCTGCACATTCGGTCGGT-3′(Kpn Ⅰ)；引物中加粗字体的碱基分别是上下游引物中加入的保护碱基和起始密码子，斜体碱基分别为引入上下游引物的酶切位点，酶切位点名称分别在括号中标注，下划线区域为HIS-tag，非斜体区域为引物原始序列。LXRα 基因扩增产物总计1 015 bp，其中CDS区序列为975 bp，编码325个氨基酸。反应体系(50 μL)：TaKaRa Ex Taq (5 U·μL-1) 0.25 μL，10×Ex Taq Buffer 5 μL，dNTP Mixture (各2.5 mmol·L-1) 4 μL，浓度为10 μmol·L-1的上下游引物各1 μL，cDNA 3 ng，灭菌双蒸水补足至50 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性7 min；95 ℃变性65 s，60.2 ℃退火70 s，72 ℃延伸80 s，35个循环；72 ℃终延伸7 min；4 ℃保存。
1.4.3 pEGFP-N3-LXRα真核过表达载体的构建利用PCR产物琼脂糖胶回收试剂盒回收LXRα基因CDS区PCR产物，pUCm-T克隆试剂盒克隆，直接测序验证克隆结果，质粒小提试剂盒提取pUCm-T-LXRα克隆重组质粒，Bgl Ⅱ、Kpn Ⅰ双酶切并回收目的片段，同样利用Bgl Ⅱ、Kpn Ⅰ对真核表达载体pEGFP-N3进行双酶切并回收，T4连接酶连接带有Bgl Ⅱ、Kpn Ⅰ粘性末端的LXRα基因和pEGFP-N3，连接温度为16 ℃，时间为16 h，转化DH5α感受态大肠杆菌，12 h后挑取单菌落37 ℃恒温摇床200 r·min-1摇菌12~14 h，测序验证，用无内毒素质粒提取试剂盒提取质粒，双酶切验证，将验证正确的质粒置于-20 ℃冰箱保存备用。
1.5 pEGFP-N3-LXRα重组质粒转染鸭原代肝细胞及PC3细胞复苏冷冻的PC3细胞，将其铺板至培养瓶培养，待PC3细胞及1.3中的肝细胞长满，0.25%胰蛋白酶消化重新接种至24孔板，置37 ℃，5% CO2培养箱培养，待细胞密度达到80%后准备转染。
1.6 鸭肝细胞脂质性状和HIS标签表达量测定根据细胞转染的情况，使用三酰甘油、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白及总胆固醇测定试剂盒测定细胞内相应的脂质指标，鸭HIS标签检测试剂盒检测HIS组蛋白在细胞内的表达量，所有测定规程严格按照试剂盒规程执行。试验共设9个试验组，每组3个重复，每个重复表达量对应一个脂质性状含量。
1.7 数据统计分析使用SPSS17.0统计软件中的T检验对组间的数值进行相关性分析，P < 0.01表示极显著相关；计量资料以“平均数±标准误(x±s.e.)”表示。
2 结果 2.1 鸭原代肝细胞的分离培养及活性检测分离鸭胚肝细胞得到圆形、透亮的单个细胞(图 1A)，台盼蓝染色检测分离的肝细胞存活率达90%以上，可用于后续细胞培养试验(图 1B)。
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A.原代肝细胞初分离观察；B.台盼蓝检测原代肝细胞活力，红色箭头表示死亡细胞 A. The observation of primary hepatocytes separation; B. The Trypan blue was used to detect the vitality of the primary hepatocytes, and the red arrows indicated the dead cells 图 1 鸭原代肝细胞初分离及台盼蓝染色(100×) Figure 1 Primary hepatocyte separation and Trypan blue staining of duck(100×) |
肝细胞接种培养12 h后，倒置显微镜下观察，少量细胞贴壁(图 2A)。24 h后换取新鲜培养液，细胞贴壁率呈现增加趋势，细胞形态呈长梭状(图 2B)。继续培养至48 h，部分贴壁细胞开始增殖分裂，肝细胞几乎处于完全贴壁状态，可进行后续的转染试验(图 2C)。
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图 2 鸭原代肝细胞生长情况观察(200×) Figure 2 Morphological observation of duck primary hepatocytes(200×) |
根据设计的引物对LXRα基因CDS区进行PCR扩增，1%凝胶电泳进行检测，回收与预期试验效果相符合的片段，将回收产物与pUCm-T载体连接；将测序验证正确的LXRα-pUCm-T与pEGFP-N3同时进行双酶切，T4连接酶将两者的胶回收产物于15 ℃连接16 h；连接液转化DH5α感受态细胞，铺板，筛选鉴定阳性菌及测序鉴定。由菌液PCR验证(图 3)及双酶切验证(图 4)结果可知，T克隆结果正确，真核过表达载体pEGFP-N3-LXRα构建成功，可用于后续试验。
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1~4.菌液PCR产物；M. DNA相对分子质量标准 1-4. The products of bacteriophage PCR; M. DM5000 DNA marker 图 3 菌液PCR产物电泳检测 Figure 3 Detection of bacteria solution PCR product by gel electrophoresis |
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1~4.双酶切产物；M. DNA相对分子质量标准 1-4. The products of double digestion; M. DM5000 DNA marker 图 4 重组质粒双酶切验证 Figure 4 Double enzyme digestion of recombinant plasmid |
细胞汇合度在65%以上时，pEGFP-N3-LXRα重组质粒转染鸭肝细胞及PC3细胞，48 h后记录转染状态。pEGFP-N3-LXRα重组质粒转染效果良好，荧光发射正常，说明重组质粒在两种细胞中都能正常表达(图 5)。
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A. pEGFP-N3-LXRα转染鸭肝细胞荧光图谱；B. pEGFP-N3-LXRα转染PC3细胞荧光图谱 A. Fluorescence observation map of pEGFP-N3-LXRα transfected duck hepatocytes; B. Fluorescence observation map of pEGFP-N3-LXRα transfected PC3 cells 图 5 pEGFP-N3-LXRα转染鸭原代肝细胞及PC3细胞(200×) Figure 5 Fluorescence observation map of pEGFP-N3-LXRα transfected duck hepatocytes and PC3 cells(200×) |
pEGFP-N3-LXRα真核过表达载体转染鸭肝细胞后，检测其在肝细胞中的过表达水平及细胞的脂质代谢情况。从检测结果(表 1)可初步判断，随着LXRα基因表达量的增加，三酰甘油(triglyceride，TG)及高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)的含量也随着上升，总胆固醇(total cholesterol，TC)及低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)的含量则随着LXRα基因表达量的增加而下降。计算LXRα基因在鸭肝细胞中的平均表达量均值为892.74 pmol·L-1。对LXRα基因过表达与各脂质指标含量进行相关性分析，结果(表 2)显示，LXRα基因表达量与TG和HDL含量呈极显著正相关(P < 0.01)，与TC和LDL含量则呈极显著负相关(P < 0.01)，表明LXRα 基因过表达对鸭肝细胞TG和HDL的合成代谢有重要的正向调控，对TC和LDL具有反向调控作用。
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表 1 鸭LXRα基因在原代肝细胞中的过表达量及脂质指标含量 Table 1 Over expression levels of duck LXRα gene and the contents of lipid indexes in hepatocytes |
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表 2 鸭LXRα基因在原代肝细胞中的表达量与脂质指标的相关性 Table 2 The correlation between over expression levels of duck LXRα gene and the contents of lipid indexes in duck primary hepatocytes |
pEGFP-N3-LXRα真核过表达载体转染PC3细胞后，检测其过表达水平及细胞的脂质代谢情况，检测结果(表 3)显示，随着LXRα基因表达量的增加，TG和HDL的含量也随着上升，TC和LDL的含量则随着LXRα基因表达量的增加而下降, 并计算出LXRα 基因在PC3细胞中的平均表达量为293.83 pmol·L-1，且进一步对其过表达量与各脂质指标含量进行相关性分析，结果(表 4)显示，LXRα基因过表达与TG和HDL含量呈极显著正相关(P < 0.01)，与TC和LDL含量则呈极显著负相关(P < 0.01)，表明LXRα基因过表达对TG和HDL的合成代谢有重要的正向调控作用，对TC和LDL具有反向调控作用。
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表 3 鸭LXRα基因在PC3细胞中的过表达量及脂质指标含量 Table 3 Over expression levels of duck LXRα gene in PC3 cells and the contents of lipid indexes |
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表 4 鸭LXRα基因在PC3细胞中的表达量与脂质指标的相关性 Table 4 The correlation between over expression levels of duck LXRα gene in PC3 cells and the contents of lipid indexes |
肝X受体(liver X-activated receptors, LXR)是核受体家族中的非类固醇受体，包括了LXRα和LXRβ两种亚型，它们被氧化型胆固醇激活之后，在胆固醇运输、抗发炎、维持脂质代谢平衡等相关基因的表达方面起到关键的调节作用[15]。LXRα作为核受体转录因子，在LXR代谢通路中主要通过调节其靶基因的表达来调控和维持机体脂质代谢以及机体脂质动态平衡，其可从转录水平上促进SCD1基因的表达进而促进机体三酰甘油的合成代谢，也可激活载脂蛋白E(apolipoprotein E)基因的表达，增强机体高密度脂蛋白的合成及胆固醇的转移[16-17]；此外，它不仅参与维持胆固醇稳态，还参与控制许多类型的正常细胞和肿瘤细胞的生长[18]。由于正常细胞与癌细胞的细胞膜糖蛋白含量有差异，致使癌细胞之间黏着性降低，导致癌细胞具有转移的特性，而LXRs激动剂可抑制各种类型肿瘤的生长，据此推测，是否可以通过开发其激动剂从而达到控制癌细胞生长与侵袭的目的。本课题组前期研究表明，LXRα基因与鸭的脂肪酸合成代谢显著相关，且分布具有组织特异性，其中，该基因在肝中表达活性最强[19]，其可能还存在物种表达差异，表达机制亟待进一步揭示和探索。此研究为进一步揭示LXRα对肝细胞及PC3细胞脂质代谢的调控机制，以pEGFP-N3为载体，构建LXRα基因真核过表达重组质粒，分别转染鸭原代肝细胞和PC3细胞，用HIS标签作为测定LXRα基因过表达量的报告标签，探索LXRα基因对肝细胞和PC3细胞脂质代谢的调控作用，为解决鸭体脂肪过度沉积的问题及培育健康的畜禽产品提供理论参考。
羊毛甾醇14-去甲基化酶(lanosterol 14a-demethylase，CYP51)与鲨烯合酶是胆固醇合成相关酶，前者是胆固醇合成环节中最后一步催化羊毛甾醇转化成胆固醇的酶，后者是从二甲烯丙基焦磷酸到胆固醇分支上的第一个关键酶，抑制该酶合成可有效地降低胆固醇的水平，而LXRα能直接抑制这两种酶，故表明LXRα对胆固醇合成具有负调节的作用[20]。此研究对LXRα基因过表达与肝细胞及PC3细胞各脂质代谢指标含量之间进行相关性分析，研究结果表明，LXRα基因过表达不论是在肝细胞还是在PC3细胞中，其与三酰甘油(triglyceride，TG)和高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)含量均呈极显著正相关(P < 0.01)，与总胆固醇(total cholesterol，TC)和低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)含量则均呈极显著负相关(P < 0.01)，说明LXRα基因过表达对PC3细胞三酰甘油和高密度脂蛋白(HDL)的合成代谢有正向调控作用，对TC和LDL具有反向调控作用。据此推测，总胆固醇和低密度脂蛋白含量随着LXRα基因过表达量的增加而下降，增加了脂质清道夫高密度脂蛋白的合成，从而加快了胆固醇和低密度脂蛋白的转化和分解。这与代小艳和唐朝克[21]的研究结果一致，LXRα基因表达的提高对于降低机体胆固醇的残留有着重要作用，能够保证机体能量代谢供给的同时，降低了机体高脂代谢疾病风险。但是，随着LXRα基因过表达的上调，细胞三酰甘油合成代谢也在加强，这在一定程度上将会加大肝细胞变性的可能性，从而加大肝的代谢负担。在LXR代谢网络通路中，LXR可直接或间接调控脂质代谢基因的表达[22]。LXRα基因以及固醇调节元件结合蛋白1(sterol regulatory element binding protein 1，SREBP1)可在转录水平调节脂质代谢过程，且近期的研究进一步表明，LXRα基因对SREBP1c具有直接调控作用[23-24]。同时，在小鼠的研究中也表明，LXRα基因与SREBP1c协同作用共同促进肝中三酰甘油的合成[25]。研究表明，硬脂酰辅酶A脱氢酶1(stearoyl-CoA desaturase，SCD1)专一性地被SREBP1调控且是SREBP1的靶基因[26]，SCD1主要催化硬脂酸和软脂酸形成油酸和棕榈油酸, 且SCD1在调节细胞膜流动性和脂类代谢过程中有着极其重要的作用, 其可通过调节饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸的比例, 提高这个比例会引发例如肥胖、糖尿病、高血压、免疫紊乱和癌症等一系列疾病[27]。另一研究结果显示，腺苷酸蛋白活化激酶(AMP-activated mononucleotide protein kinase，AMPK)信号通路介导的细胞自噬参与了抑制SCD1，导致三酰甘油和胆固醇的代谢异常，推测SCD1促进肝癌细胞(hepatocellular carcinoma，HCC)的形成和进展是通过下调AMPK信号通路抑制细胞自噬来影响脂肪代谢，从而促进细胞生长和抑制细胞凋亡[28]。本课题组前期也做了相关研究，结果表明，鸭SCD1基因过表达能够促进PC3细胞的脂质代谢速率, 其能够为PC3细胞的快速癌变增殖提供必要的物质供应, 推测SCD1基因过表达有可能对鸭癌症病变的发生与发展有一定影响[29]。在本研究中，LXRα基因在肝细胞及PC3细胞中的表达调控机制相似，且其在肝细胞中的表达量(892.74 pmol·L-1)为在PC3细胞中表达量(293.83 pmol·L-1)的3倍。提示，能否通过抑制或是敲除LXRα受体的其他与其脂质代谢相关的下游靶基因来控制三酰甘油合成强度。
LXRα基因过表达对TG和HDL的合成代谢有重要的正向调控作用，对TC和LDL具有反向调控作用，且证实其在正常细胞及癌细胞中调控作用相似。这一研究结果提示，LXRα基因将会是选育优质畜禽品种的重要候选基因之一，并且将对今后深入研究LXRα基因在脂质代谢网络通路中的作用及解决鸭体脂肪过度沉积等问题，尤其在定向选育低胆固醇沉积畜禽品种方面会具有重要的意义。
4 结论本研究成功构建了携带HIS-tag标签的pEGFP-N3-LXRα真核过表达载体，并成功转染鸭原代肝细胞及PC3细胞。研究揭示了LXRα基因过表达对三酰甘油(TG)和高密度脂蛋白(HDL)的合成代谢有重要的正向调控作用，对总胆固醇(TC)和低密度脂蛋白(LDL)具有反向调控作用，且在这两种类型的细胞中调控机制相似。
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