畜牧兽医学报  2019, Vol. 50 Issue (1): 37-43. DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2019.01.005    PDF    
猪胎盘特异基因1(PLAC1)的克隆、组织表达及遗传方式研究
邓大栋1, 洪林君1,2, 潘丽1, 刘榜1, 余梅1     
1. 华中农业大学动物科学技术学院 农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室, 武汉 430070;
2. 华南农业大学动物科学技术学院, 广州 510000
摘要:旨在研究猪胎盘特异性基因PLAC1的表达规律,并对其基因结构、生物功能和遗传方式进行初步鉴定。本研究以妊娠26、50和95天的猪胎盘组织为材料,利用RACE-PCR及RT-PCR技术克隆猪PLAC1基因及其不同转录本的全长序列,同时通过原位杂交验证其在胎盘中的表达模式。并检测猪PLAC1基因的序列变异。结果表明,猪PLAC1基因存在3种不同的转录本,3种转录本的CDS区完全相同,长525 bp,编码174个氨基酸;组织表达谱和原位杂交结果显示,PLAC1基因特异性表达于猪胎盘绒毛膜上皮细胞中,并在不同妊娠时期差异表达,妊娠50和95天PLAC1 mRNA的表达显著高于妊娠26天(P < 0.01)。猪群中PLAC1基因的SNP基因分型检测结果表明该基因遵循半合基因的遗传方式。本试验结果为研究猪PLAC1基因在胎盘发育过程中的生物功能奠定了基础。
关键词    胎盘    绒毛膜    PLAC1    
Cloning, Tissue Expression and Inheritance Patterns of Porcine Placenta-specific 1(PLAC1) Gene
DENG Dadong1, HONG Linjun1,2, PAN Li1, LIU Bang1, YU Mei1     
1. Key Laboratory of Agricultural Animal Genetics, Breeding and Reproduction of Ministry of Education, College of Animal Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China;
2. College of Animal Science and Technology, South China Agricultural University, Guangzhou 510000, China
Abstract: The objective of this study was to investigate the expression of porcine PLAC1 gene, and preliminarily identify its gene structure, biological function and inheritance patterns. The placenta tissue of pigs on 26, 50 and 95 days of pregnancy were collected, the full-length of PLAC1 mRNA and its splicing variants were cloned by using the RACE-PCR(rapid-amplification of cDNA ends) and RT-qPCR(real-time quantitative PCR). Moreover, the expression patterns of PLAC1 gene in placenta of pigs was verified by in situ hybridization. In addition, the sequence variation of PLAC1 gene was detected. The results showed that there were 3 different transcripts of the PLAC1 gene in pigs, and the CDS regions of the 3 transcripts were identical, with a length of 525 bp, encoding 174 amino acids; The results of the expression profile and hybridization in situ of PLAC1 gene indicated that the PLAC1 gene was specifically expressed in pig placental chorionic epithelium, and the expression of PLAC1 mRNA was different during different stages of pregnancy. The expression of PLAC1 mRNA was significantly higher on 50 and 95 days of gestation in placenta of pigs than 26 days of gestation. The genotype of SNP on PLAC1 gene confirmed that it was a hemizygous gene, and followed the inheritance patterns of hemizygous gene. The experiment data provide a basis for exploring the biological function of porcine PLAC1 gene in placenta development.
Key words: porcine     placenta     chorion     PLAC1    

在养猪生产中,母猪的繁殖性能是影响猪场经济效益的重要因素,也是猪遗传育种工作中的重点。已有研究报道显示,胎盘效率是影响母猪繁殖性能的重要因素之一[1],母猪胎盘效率低会明显增加猪胎儿宫内发育迟缓(IUGR)的发生率[2],导致死胎、木乃伊胎的增加。而胎盘发育的完整性决定了胎盘的效率。研究表明,胎盘发育和功能受很多基因精细而复杂的调控,其中胎盘特异表达基因对胎盘发育起着非常重要的作用[3]

在人和小鼠上,PLAC1 (placenta-specific 1)已经被定位在X染色体上,位于HPRT1基因附近。在对PLAC1的最初研究中,Cocchia等[4]最早报道了PLAC1基因的表达情况,他们利用Northern blot技术检测了成人以及胎儿各种组织,发现PLAC1只特异性表达于胎盘,是一个胎盘特异性表达的基因。已有研究表明,敲除PLAC1基因的小鼠表现为胎盘肥大,海绵滋养层向迷路滋养层侵入以及胎儿宫内发育迟缓(IUGR)等症状[5]PLAC1缺失小鼠表现为胎盘发育异常、体型小及出生仔鼠死亡增加[6-9],因此推测,PLAC1基因对胎盘发育至关重要。目前,对于PLAC1基因的研究仅限于人和小鼠,但在猪上还未见报道。因此,本研究拟克隆猪PLAC1基因,检测其表达谱及在胎盘中的定位等,为解释其在胎盘发育中的作用提供依据。

1 材料与方法 1.1 样品采集

本研究所利用的母猪均购自华中农业大学精品猪场,在母猪妊娠26、50和95天(D26、D50、D95)分别进行屠宰,取出母猪胎盘,剥离尿囊膜,分别收集胎盘绒毛膜和子宫内膜放入预先准备好的冻存管,同时采集猪的心、肝、脾、肺、肾、肌肉、胃、小肠、子宫内膜和胎盘绒毛膜等,最后将所有样品迅速放入液氮冻存,并带回实验室于-80 ℃保存。

1.2 总RNA提取及cDNA合成

利用TRIzol试剂提取猪绒毛膜组织的总RNA。用Agilent 2100 Bioanalyzer检测RNA完整性(RIN>7)。利用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)(宝生物DRR047A,大连)反转录试剂盒合成绒毛膜cDNA。具体反应体系和步骤参考试剂盒说明书,合成的cDNA放置于-20 ℃保存。

1.3 引物设计

根据NCBI数据库中猪PLAC1基因序列(登录号:XM_003135404.1),以已知序列为模板,利用Primer 5.0软件设计引物,PLAC1基因CDS扩增引物、RACE引物、qPCR引物序列以及内参基因引物序列见表 1

表 1 PLAC1基因的引物信息 Table 1 The informations of primers for PLAC1 gene
1.4 猪PLAC1基因的RNA原位杂交

为确定PLAC1基因mRNA在猪胎盘组织中的原位表达位置,采用Affymetrix公司(美国)提供的viewRNA试剂盒(QuantiGene ViewRNA ISH Tissue 2-Plex Assay Kit,Cat.No. QVT0012,QVT0013)进行原位杂交试验,具体步骤参照此试剂盒说明书。

1.5 猪PLAC1基因的5′RACE扩增

以梅山猪绒毛膜mRNA为模板,根据所获得的PLAC1基因的保守序列,设计5′RACE引物(表 1),进行5′RACE试验,具体反应体系及步骤参照Clontech公司的SMARTer-RACE cDNA Amplication Kit说明书。回收纯化的RACE产物由北京擎科生物科技有限公司进行测序。

1.6 猪PLAC1基因表达的定量和酶切反应体系及条件

PCR-RFLP检测:PCR产物酶切反应体系为10 μL:1×buffer 1 μL,PCR产物3~5 μL,限制性内切酶Hha Ⅰ 0.2 μL (10 U),用H2O补足10 μL。将样品混匀后离心,37 ℃水浴3 h。PLAC1基因定量(qPCR)检测的反应条件:95 ℃ 10 min;循环数45个:95 ℃ 10 s,60 ℃ 20 s, 72 ℃ 15 s。

1.7 序列分析及比对软件

本研究中,序列分析软件为DNAstar:http://www.dnastar.com/;序列比对软件为http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/

1.8 数据分析

利用qRT-PCR对不同时期PLAC1基因的表达量进行检测,计算得到2-ΔΔCt值,然后利用SPSS(版本20)软件进行t检验,并用Excel软件绘制柱状图。

2 结果 2.1 猪PLAC1基因的克隆及序列分析

本研究以猪绒毛膜组织cDNA为模板,根据NCBI数据库公布的猪PLAC1序列(XM_003135404.1)设计引物(表 1)进行扩增,结果见图 1A所示,目的片段大小为779 bp,此片段包含PLAC1完整的CDS序列。通过测序及序列比对,验证了此序列的正确性。

A.猪PLAC1基因PCR检测结果;B.猪PLAC1基因的5′RACE扩增结果;C.猪PLAC1基因不同转录本结构示意图:1a、1b、1c分别表示T1、T2、T3转录本的exon1序列。M. DNA相对分子质量标准 A.The PCR results of porcine PLAC1 gene; B. The 5 ′RACE amplification results of the pig PLAC1 gene; C. The different transcriptional structure schematic of porcine PLAC1 gene: 1a, 1b and 1c represent the exon1 sequences of T1, T2 and T3 transcripts, respectively. M. DNA marker 图 1 PLAC1基因的克隆结果 Figure 1 The cloning of the porcine PLAC1 gene

根据上述所获得的序列,设计5′RACE引物(表 1)以猪绒毛膜RNA为模板,进行5′RACE-PCR试验,结果如图 1B所示,扩增得到3条特异性的目的条带,将3条片段产物进行测序拼接,一共得到3种不同转录本,通过与数据库存在的序列进行对比,确定了猪PLAC1的基因组结构,见图 1C所示,3种不同转录本分别命名为T1、T2、T3。通过分析3种不同转录本,发现3种转录本都含有2个外显子,并且3种转录本的CDS都位于exon2上,长525 bp,编码174个氨基酸。除此之外,还发现3种不同转录本的差异主要在exon1上,其中T1转录本的exon1序列和T2、T3转录本的exon1完全不同,T1转录本的exon1位于T2、T3转录本的exon1上游,而T2和T3转录本的exon1的序列部分相同,但T2转录本的exon1比T3转录本的exon1多64个碱基。

2.2 猪PLAC1基因组织表达谱鉴定

提取猪10个组织的总RNA,设计特异性引物,利用RT-PCR的方法验证猪PLAC1基因在不同组织中的表达情况。结果显示,猪PLAC1基因只在胎盘的绒毛膜组织中有表达,在其它组织中不表达(图 2)。

1.心;2.肝;3.脾;4.肺;5.肾;6.肌肉;7.小肠;8.胃;9.子宫内膜;10.胎盘绒毛膜;11.空白对照 1. Heart; 2. Liver; 3. Spleen; 4. Lung; 5. Kidney; 6. Muscle; 7.Intestine; 8. Stomach; 9. Endometrium; 10. Placental chorion; 11. Blank control 图 2 PLAC1基因的组织表达谱 Figure 2 The tissue expression profile of porcine PLAC1 gene
2.3 不同妊娠时期猪胎盘中PLAC1 mRNA的表达鉴定及定位

本研究在猪不同妊娠时期(D26、D50、D95)的胎盘绒毛膜组织中检测了PLAC1基因的表达情况(图 3),发现该基因在妊娠50和95天的表达量极显著高于妊娠26天(P < 0.01)。利用原位杂交技术检测发现,PLAC1 mRNA在梅山和大白猪妊娠26、50和95天胎盘绒毛膜上皮细胞中表达,且妊娠50和95天的PLAC1 mRNA表达高于妊娠26天(图 4)。

D26.妊娠26天;D50.妊娠50天;D95.妊娠95天。**表示差异极显著P < 0.01 D26. Day 26 of gestation; D50. Day 50 of gestation; D95. Day 95 of gestation. ** indicate the statistically significant difference at P < 0.01 level 图 3 qPCR检测PLAC1基因mRNA在猪妊娠26、50和95天绒毛膜组织中的表达 Figure 3 mRNA profiles of PLAC1 in porcine chorion tissue on day 26, 50, 95 of gestation by qPCR detection
CM.绒毛膜上皮细胞;LE.子宫内膜上皮细胞。Y26、Y50、Y95.大白猪妊娠26、50和95天;M26、M50、M95.梅山猪妊娠26、50和95天 CM. Chorionic epithelial cells; LE. Endometrial epithelial cells. Y26, Y50, Y95. Day 26, 50 and 95 of gestation in Yorkshire; M26, M50, M95. Day 26, 50 and 95 of gestation in Meishan pigs 图 4 PLAC1 mRNA在不同妊娠时期母猪胎盘组织中的原位杂交结果 Figure 4 In situ hybridization results of PLAC1 mRNA in the placental tissues of pig during different gestation periods
2.4 猪PLAC1基因的SNP检测及遗传方式鉴定

为了检测猪PLAC1基因中的SNP位点,设计引物(表 1)扩增猪的PLAC1基因。将5头猪绒毛膜样本的PCR产物进行混池测序,发现在第3个外显子上存在1个SNP(C/T)(图 5A)。利用PCR-HhaⅠ-RFLP技术在猪群中检测到该位点的3种基因型,分别是CC、TT、TC(图 5C)。其中TT基因型大小为302 bp,CC基因型含2个片段,大小分别为228和74 bp,CT基因型包括3个片段,其大小分别是302、228和74 bp。

A.PLAC1基因SNP位点测序结果:方框为SNP位点;B. Hha Ⅰ内切酶识别位点信息;C. PLAC1基因扩增产物的Hha Ⅰ-PCR-RFLP分型结果:M. DNA相对分子质量标准 A.The sequencing results of SNP in PLAC1 gene: the box is the SNP site; B. The recognition site information of Hha Ⅰ enzyme digestion; C. The genotype results of PLAC1 PCR products by Hha Ⅰ enzyme digestion:M. DNA marker 图 5 PLAC1基因的SNP检测及酶切分型 Figure 5 The SNP detection and genotype of porcine PLAC1 gene

通过对猪群体中113个个体进行酶切分型检测,发现其中有80个为CC基因型,28个为TC基因型,5个为TT基因型。此外,还发现杂合TC型个体只存在于母猪中,而在公猪中只能检测到纯合基因型CC及TT型。因此,本研究通过检测不同基因型杂交组合群体中F1代的基因型,如图 6A6B所示,发现F1代公猪均为CC及TT纯合基因型,而F1代母猪既有TC型个体,也有纯合基因型个体。上述结果表明,猪PLAC1基因符合半合基因遗传规律,可能位于X染色体与Y染色体非同源区域(图 6C)。

A、B. F1代个体分型结果:方形表示雄性个体,圆形表示雌性个体;C. PLAC1基因定位预测图:SSC表示猪染色体,HSA表示人类染色体 A, B.The genotyping results of F1 individuals in different hybrid combinations: The quadrates represent male individuals, the circles represent female individuals; C.The prediction map of PLAC1 gene mapping: The SSC represents the pig chromosome, the HSA represents the human chromosome 图 6 不同基因型杂交组合后代群体中猪PLAC1基因分型结果 Figure 6 The genotyping of PLAC1 gene in F1 pigs of different hybrid combinations
3 讨论

PLAC1基因功能及遗传方式的研究在猪上尚未见报道,而PLAC1是一个胎盘特异性表达的基因,对胎盘的发育可能有着重要作用,并且胎盘的正常发育是母猪高繁殖力的基础保证。本研究通过RACE-PCR技术成功获得猪PLAC1基因完整的全长序列,并发现主要存在3种不同长度的转录本(图 1C),3种转录本的差异主要存在于5′非翻译区。通过从NCBI数据库中查询人类PLAC1基因可以发现,在人PLAC1基因5′末端也存在不同转录本,这与本研究在猪上的发现相同。通过对猪PLAC1基因不同转录本的序列分析发现,3种转录本的起始位点都是G,说明这3种转录本符合真核生物转录过程中5′端加帽规则,所以推断这3种不同转录本是真实存在的。

基因的功能与它的组织特异性表达及表达量之间密切相关。为了研究猪PLAC1基因的功能,本研究利用组织表达谱检测到PLAC1基因只在猪胎盘组织中高表达,其它组织中不表达,这个结果与人PLAC1基因的表达研究一致[9],说明猪PLAC1基因也是胎盘特异性表达的基因。在人和小鼠上均有研究表明,PLAC1基因在胎盘滋养层细胞的分化和形成过程中发挥着重要作用[10-12]。因此,通过qPCR和原位杂交技术,在猪不同妊娠时期,分析猪PLAC1基因在胎盘组织中的表达模式,发现其在猪妊娠26天绒毛膜组织中的表达量显著低于妊娠50和95天(图 3)。原位杂交结果显示,在猪妊娠26、50和95天的绒毛膜上皮细胞中均检测到了PLAC1 mRNA的表达,并且发现猪妊娠50和95天的PLAC1 mRNA的阳性信号高于妊娠26天(图 4),这和上述PLAC1基因的qPCR结果完全一致。我们进一步在Ross等[13]和Bischoff等[14]报道的表达谱芯片数据中查询了PLAC1基因的表达情况,发现在妊娠25天之前的猪胎盘中PLAC1基因的表达显著低于妊娠45、65、85及105天,这与本研究结果是一致的。此外,猪胎盘发育的一个重要特征是胎盘褶皱的形成,许多研究表明,胎盘褶皱形成起始于猪妊娠26天左右,在妊娠50天左右形成稳定的结构,之后胎盘褶皱进一步扩展[15-16]。因此本研究结果进一步说明妊娠26天左右是猪胎盘发育的一个关键时期。本研究结果表明,PLAC1基因特异性地表达于猪胎盘绒毛膜上皮细胞中,而绒毛膜上皮细胞的增殖和分化在猪胎盘褶皱形成中有重要作用[15-17],有大量文献报道表明,PLAC1可通过调控肿瘤细胞的增殖和迁移,从而影响肿瘤的生长[18-20],因此推测,PLAC1可能影响胎盘绒毛膜上皮细胞的增殖,从而在胎盘发育中发挥重要作用。

4 结论

本研究克隆了猪PLAC1基因,获得其cDNA全长序列,发现猪胎盘绒毛膜中表达3种转录本。检测到猪PLAC1基因特异性表达于猪胎盘绒毛膜上皮细胞中,在不同妊娠期的表达具有显著差异。最后,本研究验证了猪PLAC1基因遵循半合基因的遗传方式。本试验结果为进一步研究猪PLAC1基因在胎盘发育中的功能奠定了基础。

参考文献
[1] ZHOU Y F, XU T, CAI A L, et al. Excessive backfat of sows at 109 d of gestation induces lipotoxic placental environment and is associated with declining reproductive performance[J]. J Anim Sci, 2018, 96(1): 250–257. DOI: 10.1093/jas/skx041
[2] CHEN F, WANG T J, FENG C P, et al. Proteome differences in placenta and endometrium between normal and intrauterine growth restricted pig fetuses[J]. PLoS One, 2015, 10(11): e0142396. DOI: 10.1371/journal.pone.0142396
[3] RAWN S M, CROSS J C. The evolution, regulation, and function of placenta-specific genes[J]. Annu Rev Cell Dev Biol, 2008, 24(1): 159–181. DOI: 10.1146/annurev.cellbio.24.110707.175418
[4] COCCHIA M, HUBER R, PANTANO S, et al. PLAC1, an Xq26 gene with placenta-specific expression[J]. Genomics, 2000, 68(3): 305–312.
[5] FANT M, BARERRA-SALDANA H, DUBINSKY W, et al. The PLAC1 protein localizes to membranous compartments in the apical region of the syncytiotrophoblast[J]. Mol Reprod Dev, 2007, 74(7): 922–929. DOI: 10.1002/(ISSN)1098-2795
[6] LIM J H, KIM S P, GABRIELSON E, et al. Activation of human cancer/testis antigen gene, XAGE-1, in tumor cells is correlated with CpG island hypomethylation[J]. Int J Cancer, 2005, 116(2): 200–206. DOI: 10.1002/(ISSN)1097-0215
[7] SUEMIZU H, AIBA K, YOSHIKAWA T, et al. Expression profiling of placentomegaly associated with nuclear transplantation of mouse ES cells[J]. Dev Biol, 2003, 253(1): 36–53. DOI: 10.1006/dbio.2002.0870
[8] HEMBERGER M C, PEARSALL R S, ZECHNER U, et al. Genetic dissection of X-linked interspecific hybrid placental dysplasia in congenic mouse strains[J]. Genetics, 1999, 153(1): 383–390.
[9] FANT M E, FUENTES J, KONG X Y, et al. The nexus of prematurity, birth defects, and intrauterine growth restriction:a role for Plac1-regulated pathways[J]. Front Pediatr, 2014, 2: 8.
[10] CHANG W L, WANG H Y, CUI L, et al. PLAC1 is involved in human trophoblast syncytialization[J]. Reprod Biol, 2016, 16(3): 218–224. DOI: 10.1016/j.repbio.2016.07.001
[11] GU Y, WAN J, YAO L, et al. Plac1 expression pattern at the mouse fetomaternal interface and involvement in trophoblast differentiation[J]. Cell Physiol Biochem, 2017, 43(5): 2001–2009. DOI: 10.1159/000484154
[12] JACKMAN S M, KONG X Y, FANT M E. Plac1 (placenta-specific 1) is essential for normal placental and embryonic development[J]. Mol Reprod Dev, 2012, 79(8): 564–572. DOI: 10.1002/mrd.v79.8
[13] ROSS J W, ASHWORTH M D, STEIN D R, et al. Identification of differential gene expression during porcine conceptus rapid trophoblastic elongation and attachment to uterine luminal epithelium[J]. Physiol Genomics, 2009, 36(3): 140–148.
[14] BISCHOFF S R, TSAI S Q, HARDISON N E, et al. Differences in X-chromosome transcriptional activity and cholesterol metabolism between placentae from swine breeds from Asian and Western origins[J]. PLoS One, 2013, 8(1): e55345. DOI: 10.1371/journal.pone.0055345
[15] HONG L J, HOU C Y, LI X P, et al. Expression of heparanase is associated with breed-specific morphological characters of placental folded bilayer between Yorkshire and Meishan pigs[J]. Biol Reprod, 2014, 90(3): Article 56.
[16] LIU R Z, WANG M, SU L J, et al. The Expression pattern of microRNAs and the associated pathways involved in the development of porcine placental folds that contribute to the expansion of the exchange surface area[J]. Biol Reprod, 2015, 93(3): Article 62.
[17] BAZER F W, THATCHER W W, MARTINAT-BOTTE F, et al. Sexual maturation and morphological development of the reproductive tract in large white and prolific Chinese Meishan pigs[J]. J Reprod Fertil, 1988, 83(2): 723–728.
[18] YUAN H Y, WANG X Y, SHI C M, et al. Plac1 is a key regulator of the inflammatory response and immune tolerance in mammary tumorigenesis[J]. Sci Rep, 2018, 8(1): 5717. DOI: 10.1038/s41598-018-24022-w
[19] LI Y F, CHU J H, LI J, et al. Cancer/testis antigen-Plac1 promotes invasion and metastasis of breast cancer through Furin/NICD/PTEN signaling pathway[J]. Mol Oncol, 2018, 12(8): 1233–1248. DOI: 10.1002/mol2.2018.12.issue-8
[20] YANG L, ZHA T Q, HE X, et al. Placenta-specific protein 1 promotes cell proliferation and invasion in non-small cell lung cancer[J]. Oncol Rep, 2018, 39(1): 53–60.