2. 华南农业大学动物科学技术学院, 广州 510000
2. College of Animal Science and Technology, South China Agricultural University, Guangzhou 510000, China
在养猪生产中,母猪的繁殖性能是影响猪场经济效益的重要因素,也是猪遗传育种工作中的重点。已有研究报道显示,胎盘效率是影响母猪繁殖性能的重要因素之一[1],母猪胎盘效率低会明显增加猪胎儿宫内发育迟缓(IUGR)的发生率[2],导致死胎、木乃伊胎的增加。而胎盘发育的完整性决定了胎盘的效率。研究表明,胎盘发育和功能受很多基因精细而复杂的调控,其中胎盘特异表达基因对胎盘发育起着非常重要的作用[3]。
在人和小鼠上,PLAC1 (placenta-specific 1)已经被定位在X染色体上,位于HPRT1基因附近。在对PLAC1的最初研究中,Cocchia等[4]最早报道了PLAC1基因的表达情况,他们利用Northern blot技术检测了成人以及胎儿各种组织,发现PLAC1只特异性表达于胎盘,是一个胎盘特异性表达的基因。已有研究表明,敲除PLAC1基因的小鼠表现为胎盘肥大,海绵滋养层向迷路滋养层侵入以及胎儿宫内发育迟缓(IUGR)等症状[5],PLAC1缺失小鼠表现为胎盘发育异常、体型小及出生仔鼠死亡增加[6-9],因此推测,PLAC1基因对胎盘发育至关重要。目前,对于PLAC1基因的研究仅限于人和小鼠,但在猪上还未见报道。因此,本研究拟克隆猪PLAC1基因,检测其表达谱及在胎盘中的定位等,为解释其在胎盘发育中的作用提供依据。
1 材料与方法 1.1 样品采集本研究所利用的母猪均购自华中农业大学精品猪场,在母猪妊娠26、50和95天(D26、D50、D95)分别进行屠宰,取出母猪胎盘,剥离尿囊膜,分别收集胎盘绒毛膜和子宫内膜放入预先准备好的冻存管,同时采集猪的心、肝、脾、肺、肾、肌肉、胃、小肠、子宫内膜和胎盘绒毛膜等,最后将所有样品迅速放入液氮冻存,并带回实验室于-80 ℃保存。
1.2 总RNA提取及cDNA合成利用TRIzol试剂提取猪绒毛膜组织的总RNA。用Agilent 2100 Bioanalyzer检测RNA完整性(RIN>7)。利用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)(宝生物DRR047A,大连)反转录试剂盒合成绒毛膜cDNA。具体反应体系和步骤参考试剂盒说明书,合成的cDNA放置于-20 ℃保存。
1.3 引物设计根据NCBI数据库中猪PLAC1基因序列(登录号:XM_003135404.1),以已知序列为模板,利用Primer 5.0软件设计引物,PLAC1基因CDS扩增引物、RACE引物、qPCR引物序列以及内参基因引物序列见表 1。
为确定PLAC1基因mRNA在猪胎盘组织中的原位表达位置,采用Affymetrix公司(美国)提供的viewRNA试剂盒(QuantiGene ViewRNA ISH Tissue 2-Plex Assay Kit,Cat.No. QVT0012,QVT0013)进行原位杂交试验,具体步骤参照此试剂盒说明书。
1.5 猪PLAC1基因的5′RACE扩增以梅山猪绒毛膜mRNA为模板,根据所获得的PLAC1基因的保守序列,设计5′RACE引物(表 1),进行5′RACE试验,具体反应体系及步骤参照Clontech公司的SMARTer-RACE cDNA Amplication Kit说明书。回收纯化的RACE产物由北京擎科生物科技有限公司进行测序。
1.6 猪PLAC1基因表达的定量和酶切反应体系及条件PCR-RFLP检测:PCR产物酶切反应体系为10 μL:1×buffer 1 μL,PCR产物3~5 μL,限制性内切酶Hha Ⅰ 0.2 μL (10 U),用H2O补足10 μL。将样品混匀后离心,37 ℃水浴3 h。PLAC1基因定量(qPCR)检测的反应条件:95 ℃ 10 min;循环数45个:95 ℃ 10 s,60 ℃ 20 s, 72 ℃ 15 s。
1.7 序列分析及比对软件本研究中,序列分析软件为DNAstar:http://www.dnastar.com/;序列比对软件为http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。
1.8 数据分析利用qRT-PCR对不同时期PLAC1基因的表达量进行检测,计算得到2-ΔΔCt值,然后利用SPSS(版本20)软件进行t检验,并用Excel软件绘制柱状图。
2 结果 2.1 猪PLAC1基因的克隆及序列分析本研究以猪绒毛膜组织cDNA为模板,根据NCBI数据库公布的猪PLAC1序列(XM_003135404.1)设计引物(表 1)进行扩增,结果见图 1A所示,目的片段大小为779 bp,此片段包含PLAC1完整的CDS序列。通过测序及序列比对,验证了此序列的正确性。
根据上述所获得的序列,设计5′RACE引物(表 1)以猪绒毛膜RNA为模板,进行5′RACE-PCR试验,结果如图 1B所示,扩增得到3条特异性的目的条带,将3条片段产物进行测序拼接,一共得到3种不同转录本,通过与数据库存在的序列进行对比,确定了猪PLAC1的基因组结构,见图 1C所示,3种不同转录本分别命名为T1、T2、T3。通过分析3种不同转录本,发现3种转录本都含有2个外显子,并且3种转录本的CDS都位于exon2上,长525 bp,编码174个氨基酸。除此之外,还发现3种不同转录本的差异主要在exon1上,其中T1转录本的exon1序列和T2、T3转录本的exon1完全不同,T1转录本的exon1位于T2、T3转录本的exon1上游,而T2和T3转录本的exon1的序列部分相同,但T2转录本的exon1比T3转录本的exon1多64个碱基。
2.2 猪PLAC1基因组织表达谱鉴定提取猪10个组织的总RNA,设计特异性引物,利用RT-PCR的方法验证猪PLAC1基因在不同组织中的表达情况。结果显示,猪PLAC1基因只在胎盘的绒毛膜组织中有表达,在其它组织中不表达(图 2)。
本研究在猪不同妊娠时期(D26、D50、D95)的胎盘绒毛膜组织中检测了PLAC1基因的表达情况(图 3),发现该基因在妊娠50和95天的表达量极显著高于妊娠26天(P < 0.01)。利用原位杂交技术检测发现,PLAC1 mRNA在梅山和大白猪妊娠26、50和95天胎盘绒毛膜上皮细胞中表达,且妊娠50和95天的PLAC1 mRNA表达高于妊娠26天(图 4)。
为了检测猪PLAC1基因中的SNP位点,设计引物(表 1)扩增猪的PLAC1基因。将5头猪绒毛膜样本的PCR产物进行混池测序,发现在第3个外显子上存在1个SNP(C/T)(图 5A)。利用PCR-HhaⅠ-RFLP技术在猪群中检测到该位点的3种基因型,分别是CC、TT、TC(图 5C)。其中TT基因型大小为302 bp,CC基因型含2个片段,大小分别为228和74 bp,CT基因型包括3个片段,其大小分别是302、228和74 bp。
通过对猪群体中113个个体进行酶切分型检测,发现其中有80个为CC基因型,28个为TC基因型,5个为TT基因型。此外,还发现杂合TC型个体只存在于母猪中,而在公猪中只能检测到纯合基因型CC及TT型。因此,本研究通过检测不同基因型杂交组合群体中F1代的基因型,如图 6A和6B所示,发现F1代公猪均为CC及TT纯合基因型,而F1代母猪既有TC型个体,也有纯合基因型个体。上述结果表明,猪PLAC1基因符合半合基因遗传规律,可能位于X染色体与Y染色体非同源区域(图 6C)。
PLAC1基因功能及遗传方式的研究在猪上尚未见报道,而PLAC1是一个胎盘特异性表达的基因,对胎盘的发育可能有着重要作用,并且胎盘的正常发育是母猪高繁殖力的基础保证。本研究通过RACE-PCR技术成功获得猪PLAC1基因完整的全长序列,并发现主要存在3种不同长度的转录本(图 1C),3种转录本的差异主要存在于5′非翻译区。通过从NCBI数据库中查询人类PLAC1基因可以发现,在人PLAC1基因5′末端也存在不同转录本,这与本研究在猪上的发现相同。通过对猪PLAC1基因不同转录本的序列分析发现,3种转录本的起始位点都是G,说明这3种转录本符合真核生物转录过程中5′端加帽规则,所以推断这3种不同转录本是真实存在的。
基因的功能与它的组织特异性表达及表达量之间密切相关。为了研究猪PLAC1基因的功能,本研究利用组织表达谱检测到PLAC1基因只在猪胎盘组织中高表达,其它组织中不表达,这个结果与人PLAC1基因的表达研究一致[9],说明猪PLAC1基因也是胎盘特异性表达的基因。在人和小鼠上均有研究表明,PLAC1基因在胎盘滋养层细胞的分化和形成过程中发挥着重要作用[10-12]。因此,通过qPCR和原位杂交技术,在猪不同妊娠时期,分析猪PLAC1基因在胎盘组织中的表达模式,发现其在猪妊娠26天绒毛膜组织中的表达量显著低于妊娠50和95天(图 3)。原位杂交结果显示,在猪妊娠26、50和95天的绒毛膜上皮细胞中均检测到了PLAC1 mRNA的表达,并且发现猪妊娠50和95天的PLAC1 mRNA的阳性信号高于妊娠26天(图 4),这和上述PLAC1基因的qPCR结果完全一致。我们进一步在Ross等[13]和Bischoff等[14]报道的表达谱芯片数据中查询了PLAC1基因的表达情况,发现在妊娠25天之前的猪胎盘中PLAC1基因的表达显著低于妊娠45、65、85及105天,这与本研究结果是一致的。此外,猪胎盘发育的一个重要特征是胎盘褶皱的形成,许多研究表明,胎盘褶皱形成起始于猪妊娠26天左右,在妊娠50天左右形成稳定的结构,之后胎盘褶皱进一步扩展[15-16]。因此本研究结果进一步说明妊娠26天左右是猪胎盘发育的一个关键时期。本研究结果表明,PLAC1基因特异性地表达于猪胎盘绒毛膜上皮细胞中,而绒毛膜上皮细胞的增殖和分化在猪胎盘褶皱形成中有重要作用[15-17],有大量文献报道表明,PLAC1可通过调控肿瘤细胞的增殖和迁移,从而影响肿瘤的生长[18-20],因此推测,PLAC1可能影响胎盘绒毛膜上皮细胞的增殖,从而在胎盘发育中发挥重要作用。
4 结论本研究克隆了猪PLAC1基因,获得其cDNA全长序列,发现猪胎盘绒毛膜中表达3种转录本。检测到猪PLAC1基因特异性表达于猪胎盘绒毛膜上皮细胞中,在不同妊娠期的表达具有显著差异。最后,本研究验证了猪PLAC1基因遵循半合基因的遗传方式。本试验结果为进一步研究猪PLAC1基因在胎盘发育中的功能奠定了基础。
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