2. 宁夏大学生命科学学院, 银川 750021
2. School of Life Science, Ningxia University, Yinchuan 750021, China
结核病(tuberculosis)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)感染引起的人畜共患传染病。据世界卫生组织估计,2015年,全球新增Mtb感染人数1 040万,死亡人数140万,另有40万人死于Mtb和人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)的双重感染[1]。结核病的流行范围之广,危害之大,严重影响着人类公共卫生安全。然而,由于结核病的致病机制十分复杂,结核病的预防和治疗工作仍面临巨大的挑战。所以,深入探究结核病的致病机制与机体抵抗结核病的免疫机制,实现结核病防治领域的重大突破,对减少因感染Mtb对人类健康带来的危害,具有至关重要的作用。另外,建立适当的结核病预防诊断和治疗的新方法也具有十分重要的现实意义。
外泌体是一种由细胞衍生的囊泡类结构,最早发现于20世纪80年代中期,开始时它是指在网织红细胞成熟期间出芽产生的小囊泡,有清除多余膜结合蛋白的作用[2]。所以外泌体最初被认为是细胞的“废弃物”,并未受到太多关注。然而后来有研究发现,这些小的胞外分泌泡并非只由网织红细胞特异分泌,大多数哺乳动物细胞都可以释放这种膜泡[3]。随着研究的不断深入,人们发现外泌体在多种疾病的发生发展中扮演了重要角色,在机体的免疫应答中也发挥着重要作用。近年来,越来越多的研究也发现,外泌体与Mtb的感染密切相关,本文将就外泌体在结核病发生发展及诊疗中的作用进行综述。
1 外泌体外泌体(exosomes)是一种由细胞衍生的囊泡类结构,其体积很小,直径仅40~200 nm。外泌体可以由多种类型的细胞分泌,并可以从几乎所有体液中分离出来,包括尿液、血浆、母乳、支气管肺泡灌洗液、唾液、精液、羊水、腹水、关节液、母乳和脑脊髓液等[4-5]。外泌体内部包含有蛋白质、脂质、miRNA等多种分子。目前已经在不同物种的外泌体中鉴定出了4 563种蛋白质,194种脂质,1 639种mRNA和764种miRNA,其中膜转运蛋白和融合蛋白是最常见的。还有一些外来蛋白质是外泌体共有的,其中包括四跨膜蛋白超家族(transmembrane 4 superfamily, TM4SF)、CD63、CD81、CD9和热休克蛋白(Hsp70),这些蛋白质通常可以用作外泌体的标记物[6]。Mtb感染宿主细胞后,可以从外泌体中分离得到完整的分枝杆菌蛋白,包括Ag85B、HspX和许多其他分枝杆菌蛋白[3]。卡介苗(Bacille Calmette-Guérin, BCG)感染人单核细胞源性巨噬细胞(human monocyte-derived macrophages, MDMs)后,可以诱导其释放外泌体,该外泌体中含有多种类型的miRNA[7-8]。2015年,Lee等[9]用LC-MS/MS技术从Mtb感染细胞分泌的外泌体中检测到了287个蛋白,并发现其中有些与Mtb毒性有关。外泌体在生物液体中高度稳定,同时还包含各种与机体生理状态相关的分子特征,因此可以通过提取外泌体分子内含物来获得大量关于细胞生理和病理状态的信息[10-11]。
随着研究的不断深入,外泌体的各种生物学功能开始为人所知。许多研究发现外泌体可以通过各种分子(包括从供体到受体细胞的miRNA)的往复传递而参与细胞间通讯[11]。由外泌体运送到靶细胞的外来miRNA可以显著地影响靶细胞和受体细胞内的生化反应,从而影响细胞功能和病理状态的发展。随着研究的深入,人们开始意识到外泌体在免疫调节和细胞治疗中发挥作用[12]。它们甚至可以作为疫苗载体在抗Mtb感染中发挥作用[13]。
2 外泌体在结核分枝杆菌感染中的作用在外泌体日益引起广泛关注的同时,越来越多的研究者开始将目光聚焦在结核病与外泌体之间的关系上。外泌体来源广泛,内含物种类多样,是获取结核病病理信息的极佳来源。因此外泌体在结核病的发生发展中的作用吸引着越来越多科学家的关注。从目前的研究进展来看,外泌体在结核病发生发展中的作用总体来说有以下几个方面。
2.1 提呈抗原信息外泌体可以作为病原分子学模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)的载体,通过沉默或促进免疫应答进而影响受体细胞的生理状态。早在1994年,科学家就发现了分枝杆菌在不同的细胞膜泡内运输细菌内含物的现象,结果显示释放的囊泡具有将结核菌成分转移到相邻的未感染的巨噬细胞的能力[14]。Wang等[15]比较了巨噬细胞分泌的外泌体和用鸟分枝杆菌感染巨噬细胞后分泌的外泌体的成分,结果显示,两者外泌体中蛋白成分存在显著的差异,后者两种β-肌动蛋白亚型有所下调,而丝切蛋白(cofilin-1)上调。其研究结果还表明鸟分枝杆菌感染的巨噬细胞分泌的外泌体可能是鸟分枝杆菌抗原组分的载体,后者携带诱导促炎反应的分子糖肽脂,是细胞外抗原的重要来源。
Ramachandra等[16]研究证实,Mtb感染巨噬细胞后,巨噬细胞分泌的外泌体和囊泡中含有MHC-Ⅱ类分子,它们可以将抗原信息提呈给T细胞,并且它们可能比天然T细胞更有效地刺激记忆或活化的T细胞。这些机制可使结核分枝杆菌感染细胞分泌的囊泡运输至离感染细胞更远距离的细胞位点,并在这些位点刺激相关的T细胞发挥作用。已有研究发现,在Mtb感染的细胞所分泌的外泌体中宿主热休克蛋白70(Hsp70)特异性增加[3, 17],增加的Hsp70不仅可以促进细胞发生炎性反应,还可以加强巨噬细胞对耻垢分枝杆菌以及对鸟分枝杆菌的杀伤作用。这表明外泌体中除了含有外来抗原成分外,还含有宿主成分,说明外泌体在结核病的发生发展过程中,可以作为媒介在细胞间传递抗原信息,促进Mtb抗原的提呈[18],对结核病的发生发展起着不可忽视的作用,但是与其他抗原呈递机制相比,外泌体介导的抗原递送以及激活免疫反应的机制需要进一步研究。
2.2 激活免疫细胞除了具有提呈抗原的作用外,在结核病发生发展过程中,外泌体还具有激活免疫细胞的作用。带有分枝杆菌成分的外泌体具有激活巨噬细胞的能力。Wang等[15]研究发现,鸟分枝杆菌和鸟分枝杆菌感染的巨噬细胞分泌的外泌体均可增强巨噬细胞中CD80和CD86的表达以及TNF-α和IFN-γ的分泌,可以引起静息巨噬细胞产生免疫应答。随后的研究进一步证实,从鸟分枝杆菌感染的巨噬细胞提取外泌体刺激巨噬细胞后,能增强巨噬细胞对葡聚糖的吞噬能力和巨噬细胞中CD40、CD80、CD81、CD86、HLA-DR,尤其CD195的表达,同时也能增强巨噬细胞中IL-6、IL-8、IL-10、IFN-γ和TNF-α的分泌[19],说明外泌体具有活化巨噬细胞的作用。不仅如此,更多的研究还证实,外泌体还可以激活CD4+和CD8+ T细胞,对获得性免疫应答的形成具有重要作用[16]。Smith等[20]还发现被Mtb感染的小鼠巨噬细胞释放的外泌体可以显著影响T细胞应答,这意味着外泌体不仅可以在Mtb感染期间向免疫细胞呈递抗原信息,还可以介导免疫系统的激活。Giri等[21]以J774为细胞模型,用Mtb刺激巨噬细胞后分离巨噬细胞分泌的外泌体,用LC-MS/MS从中鉴定出了41种Mtb抗原,包括许多众所周知的Mtb抗原,包括抗原85A、B和C(Rv3804c,Rv1886c,Rv0129c),MPT64(Rv1980c)和ESAT-6(Rv3875),并用其中部分分泌性抗原刺激J774细胞,分离外泌体,体外试验结果显示,这些外泌体具有激活巨噬细胞、树突状细胞和初始CD4+和CD8+细胞的能力[21-22]。以上研究证实,外泌体对多种免疫细胞具有激活和活化作用,在宿主抵抗Mtb感染的过程中有着不可低估的影响。
2.3 调控机体免疫反应除了提呈抗原和激活免疫细胞外,外泌体在结核病发生发展过程中可能还发挥其他作用。被Mtb感染的巨噬细胞所释放的外泌体对保护性细胞免疫应答可能存在一定的抑制作用。有研究发现,Mtb感染巨噬细胞后,巨噬细胞分泌的外泌体可以阻碍天然巨噬细胞的INF-γ途径的激活,抑制小鼠巨噬细胞表面MHC Ⅱ类和CD64分子的表达,这种抑制作用主要依赖于Toll样受体2(TLR2)和髓样分化因子88(MyD88)参与完成,从而对机体抗Mtb感染免疫产生一定的负面影响[23]。
还有研究发现,用BCG感染人单核细胞源性巨噬细胞(MDMs)可导致多种miRNA的释放,主要包括Let-7家族成员,miR-155、miR-146a、miR-145和miR-21。这些miRNA都被预测为与免疫相关的重要靶向基因[24]。与未感染细胞相比,被Mtb感染的巨噬细胞分泌的外泌体中miRNA的含量有显著变化,后者内含物中与psmb9、psmd3、psme2、cd74以及lgmn相关的转录产物水平明显更高。除此之外在被Mtb感染后的巨噬细胞所得到的外泌体中还检测到多种Mtb的转录产物,包括Rv0740、Rv0288、Rv1344、Rv0968、Rv1942c、Rv0664、Rv0190、Rv1757c和Rv1369c。这些转录产物可以转移到其他细胞中并能正常翻译成蛋白质。并且这些RNA可能参与受体细胞中免疫应答的调节并诱导受体细胞的细胞凋亡[25]。结核病的病变特征是形成典型的结核性肉芽肿,含有免疫原的外泌体可以被巨噬细胞和周围的免疫细胞摄取,通过这种方式抑制IFN-γ途径的激活,这有利于将Mtb扩散到未感染的细胞,这也就可以解释长期观察到的宿主细胞广泛参与肉芽肿的现象[26]。以上研究说明,外泌体在结核病发生发展过程中,对宿主细胞还起到重要的免疫调节作用。
综上所述,在结核病的发生发展过程中,外泌体可以作为媒介在细胞间传递细胞因子,促进Mtb抗原的提呈,外泌体还对多种免疫细胞具有激活和活化作用,尤其是对巨噬细胞的活化发挥重要的作用。当然,外泌体对免疫细胞的作用也不完全体现在对免疫细胞的激活上,还存在复杂的免疫调控作用,这说明外泌体在结核病发生发展的过程中作用的复杂性。
3 外泌体可作为结核病诊断中潜在的生物标志物生物标志物(biomarker)是指可以检测系统、器官、组织、细胞及亚细胞结构或功能的改变或可能发生改变的生化指标,它有助于对疾病发病状况进行诊断评估。外泌体来源广泛,内含物种类多样,是获取生物标志物的极佳来源,可以用于疾病的检测,监视疾病的发展状况[27]。结核病生物标志物的研究进展缓慢[28-30]。目前作为结核病常用的诊断方法主要有痰涂片显微镜方法检查抗酸杆菌(acid fast bacilli, AFB)和结核菌素皮肤测试(tuberculin skin test, TST)等方法,虽然这些方法可行,但在检测诊断的速度和精准度上均有所欠缺。因此开发新的生物标志物用于结核病的快速、精准诊断是十分必要的。由于外泌体诸多方面的优点,越来越多的报道开始把外泌体及其内含物当作一些难以直接检测的细胞或器官的疾病生物标志物[31]。
3.1 外泌体miRNA可作为生物标志物2000年Beatty等[32]发现外泌体中含有病原体衍生的抗原,被感染细胞释放的外泌体携带多种可以作为特定感染因子的病原衍生分子[33],例证了外泌体在传染病诊断中的潜在应用价值。基于现有证据,各种类型的细胞产生的外泌体在调节呼吸系统稳态中发挥重要作用,在各种肺部疾病的发病机制中也扮演了重要角色[34]。因此,外泌体在结核病诊断研究中越来越受到关注,在早期诊断和预防中有着极为广阔的应用前景。首先,miRNA可以作为潜在的生物标志物用于结核病的快速诊断。研究发现,外泌体中的miRNA谱与其供体细胞炎症状态有关[35-36]。Mortaz等[8]研究发现,BCG感染人单核细胞源性巨噬细胞(MDMs)后,导致许多miRNA的释放,所有这些miRNA都被预测为重要的免疫相关靶向基因。Lin等[37]通过高通量测序检测了肺炎、肺结核和肺癌患者胸腔积液中miRNA表达模式,并从肺炎和肺结核患者胸腔积液中检测到了3个差异表达的miRNA,从肺炎和肺癌患者胸腔积液中检测到27个差异表达的miRNA,其中miR-378i仅在肺结核患者胸腔积液中有显著变化。当然,目前多数研究只是在现有研究结果的基础上推测外泌体中的miRNA有作为生物标志物用于诊断结核病的潜能,但目前并无相关miRNA作为生物标志物用于结核病的快速诊断中[25, 37-39],因此,这方面的研究仍需深入开展。
3.2 外泌体蛋白可作为生物标志物除了miRNA,在结核病快速诊断分子标志物的筛选中,Mtb抗原蛋白或者多肽片段也是重要的候选生物标志物。Mtb是典型的胞内寄生菌,从外泌体中寻找其分子标记具有重要意义。已有大量的研究证实,Mtb或牛分枝杆菌感染宿主细胞后释放的外泌体含有病原体衍生抗原[22, 40],而且其中不乏免疫原性很强的诸如ESAT6(Rv3875)、Ag85复合物(Rv3804c、Rv1886c和Rv0129c)、MPT64(1980c)和MPT63(1926c)等抗原[17, 22]。也有研究从结核病患者血清中分离出的外泌体中鉴定出了多种结核菌蛋白,包括Ag85B、BfrB、GlcB和Mpt64等[40]。Mehaffy等[41]也从结核病患者血清中分离的外泌体中检测到了41个Mtb多肽分子,并证实其中的Cfp2、Mpt32、Mpt64和BfrB在活动性结核病患者血清中的含量很高。Kruh-Garcia等[40]用MRM-MS技术从活动性结核病人和潜伏期结核病人血清外泌体中也检测到了大量的源于Ag85B、Ag85C、Apa、BfrB、GlcB、HspX、KatG和Mpt64的多肽片段。此外,还可以根据血清中的外来标志物(如MPT64)区分肺内和肺外结核,并识别活动性和潜伏性疾病。这种检测潜在感染性疾病的能力是十分重要的,这在一定程度上可以降低传染病的传播风险。这些研究表明外泌体中的蛋白成分也可以作为生物标志物用于诊断结核病。
目前,外泌体在结核病诊断中的应用研究方面已经取得了实质性的进展。Diaz等[42]发现Mtb感染可导致外泌体蛋白质组成的显著变化,他们使用新的生物素标记策略对这些蛋白质在外泌体膜中进行定位,结果表明,Mtb可能影响宿主细胞的变化,这可能被用作结核病生物标志物用于检测结核病。另外,研究发现,体液中外泌体的数量和含量可能随疾病而显著变化,循环外泌体的数量增加可能与肺部的疾病进展相关[43]。Schorey和Dobos[44]建立了一种快速检测Mtb蛋白质以鉴定活动性结核病患者的方法,这项研究为外泌体在诊断结核病的应用作出了进一步的贡献。
基于以上的研究我们不难发现,外泌体在结核病诊断中是一种具有很高潜在应用价值的分子标志物。虽然目前外泌体与结核病之间的具体关系并未研究透彻,但是不难想象,在不久的将来,将会不断有新的分子标志物被发现。需要指出的是,目前也没有直接的证据来证明这些蛋白或多肽可以作为生物标志物用于结核病的快速诊断中。
4 外泌体在结核病疫苗开发中的应用目前,BCG仍然是预防结核病的唯一商业化疫苗。虽然在全球范围内正在开发的结核病疫苗很多,也有一部分已经进入了临床试验阶段,但这些疫苗还无法满足临床理想的要求。外泌体是许多生理过程的重要调节因子,包括组织体内平衡、免疫刺激或免疫抑制等。从抗原提呈细胞释放的外泌体包含MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ和CD86,并且可以刺激机体产生有效的免疫应答[45-46]。研究发现,来源于树突状细胞的外泌体可以诱导非常强的免疫应答[47]。含有HSP70的外泌体可以通过激活自然杀伤细胞(NKs)和巨噬细胞来达到促炎的效果[48]。Koyama等[49]用编码Mtb抗原早期分泌抗原靶标-6(6-kDa early secretory antigenic target, ESAT-6)的质粒转染B16黑素瘤细胞并收集其分泌的外泌体,当该外泌体被注射到小鼠体内时,可以显著诱发针对ESAT-6的细胞免疫应答,说明含有Mtb抗原(或其表位)的外泌体具有作为结核病疫苗的潜力,这为结核病疫苗的研究开发提供了一条新思路。还有研究发现Mtb培养物滤液蛋白(culture filtrate protein, CFP)处理后的巨噬细胞释放的外泌体能够激活机体的先天性和获得性免疫应答,由于不需要用活毒菌株进行处理,这种CFP处理巨噬细胞产生的外泌体很容易制备[21, 50],可能是很好的疫苗材料。值得一提的是,Cheng和Schorey[50]观察到含有泛素化标签重组抗原的外泌体可有效地引发T细胞应答。另外,Smith等[51]发现,泛素化作用在Mtb抗原从细胞进入外泌体的过程中发挥重要作用。这表明基于泛素化的外泌体蛋白递送策略可以为防治肺结核病提供一种独特的方法来产生具有潜力的新型疫苗。
目前,外泌体与抗Mtb疫苗领域的研究不断有新的发现。虽然外泌体作为结核病疫苗仍存在一些问题,比如外泌体引起特异性免疫的抗原还未全面了解;外泌体携带的各种抗原在机体免疫中的具体机制尚不明确等,但是整体来说外泌体仍是结核病治疗策略分析设计的理想资源。它们易于纯化,并富含分枝杆菌的多种产物,比如蛋白质、分枝杆菌脂质和RNA等[52-54]。它们在感染期间的持续性和炎症过程中变化,都可以为疫苗的开发提供思路。我们有理由相信外泌体能够成为一种新型抗结核病疫苗并得到广泛的应用。
5 结论及展望外泌体的发现对人类认识机体生理、病理的方式产生了重要影响,有很多生物医学相关的生化和分子生物学的研究在外泌体分析的层面上都可以开拓一个新的思路。Mtb感染宿主细胞后,宿主细胞分泌的外泌体中含有多种Mtb抗原成分,这些抗原可以有效地激发宿主产生先天性免疫和获得性免疫应答,从这个意义上说,外泌体是抗结核疫苗有效的载体。在结核病发生发展过程中,外泌体可以作为载体向免疫细胞提呈抗原,也能有效地激活诸如巨噬细胞、T细胞、树突状细胞等多种免疫细胞,当然也能抑制部分免疫细胞的功能,起到复杂的免疫调控作用。目前结核病的免疫机制,尤其是结核病病原菌逃避宿主细胞免疫监视和清除的机制研究尚未有重大的理论突破。因此深入研究外泌体对免疫细胞的复杂调控机制,将有助于阐明宿主抗结核免疫的分子机制以及Mtb逃逸宿主杀伤的免疫逃逸机制,对结核病的快速诊断、新型抗结核病药物和疫苗的开发等具有一定的理论和现实意义。希望不久的将来,关于外泌体在结核病领域的研究能帮助人们在结核病研究中取得重大的突破。
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