乳腺肿瘤是兽医临床最常见的肿瘤之一，在所有犬猫肿瘤性疾病中排名第二位，而犬乳腺肿瘤约占犬临床肿瘤性疾病的50%[1]，严重威胁宠物的健康。肿瘤是一个及其复杂的生物学进程，多种原癌基因或抑癌基因的异常表达与乳腺肿瘤的发生、发展和预后密切相关。在人医研究中发现，MUC1在肿瘤的侵袭过程中发挥关键作用[2]，并能激活MAPK、PI3K/AKT和Wnt信号通路[3]，促进肿瘤的发生发展，但在兽医临床上尚未见到相应的报道。本研究通过荧光定量PCR(real-time PCR)和免疫组织化学(IHC)检测MUC1基因和MUC1在犬乳腺肿瘤中的表达情况，并分析其与肿瘤恶性分级的相关性，为犬乳腺肿瘤的诊断、治疗和预后评估提供参考。
1 材料与方法 1.1 试验样本本试验共检测了47例犬乳腺肿瘤病例，年龄7~16岁(11.29±2.43)，所有病例均来自于2014年5月至2015年12月间来中国农业大学动物医院就诊的病例。无菌收集肿瘤组织，一部分迅速用液氮冷冻，随后转移至冻存管内于-80 ℃冰箱保存。另一部分于4%多聚甲醛固定后制备病理切片，并进行免疫组化染色。
1.2 主要试验试剂RNAgentsR Total Isolation System试剂盒(Promega公司)，real-time PCR试剂盒(SYBR® Premix DimerEraserTM)、Reverse Transcription PCR试剂盒(TaKaRa生物公司)，2×EasyTaq SuperMix(全式金生物技术有限公司)，MUC1单克隆抗体(Abcam)，SP-9002生物素-链霉卵白素免疫组化检测试剂盒、DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物公司)等。
1.3 RNA的提取和cDNA的合成参照RNAgentsR Total Isolation System试剂盒说明提取样本中的RNA，通过NanoDrop检测RNA的浓度和纯度，A260 nm/A280 nm的值在1.8~2.0，说明提取的RNA纯度符合检测要求。cDNA合成体系：RNA 1 μg、Oligo(dT) 1 μL、DEPC H2O 10 μL、5× PrimeScript Ⅱ Buffer 4 μL、dNTP Mixture(10 mmol·L-1)1 μL、RTase M-MLV(200 U·μL-1)0.5 μL、RNase Inhibitor(40 U·μL-1)0.5 μL，RNase Free dH2O补充至20 μL。将上述混合物42 ℃延伸1 h，70 ℃保温15 min后终止反应，cDNA保存于-20 ℃备用。
1.4 MUC1基因的扩增参照NCBI上已经发表的犬MUC1基因的mRNA序列(GenBank登录号为AY703457)，利用Primer Premier5.0设计并合成一对特异性引物，上游引物：5′-GCCAACAAGGTGAAGACACAG-3′；下游引物：5′-CAGACTTGAACGGGGCAGA-3′，其目的产物片段长度为118 bp。
以“1.3”合成的cDNA为模板进行PCR扩增，扩增体系：模板2 μL、上游引物(10 μmol·L-1)1 μL、下游引物(10 μmol·L-1)1 μL、2×EasyTaq SuperMix 12.5 μL、去离子水补充至25 μL，充分混匀。反应条件：94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共34个循环，72 ℃延伸7 min。
1.5 MUC1基因的real-time PCR检测通过比较CT法进行相对定量，选用的内参基因是β-actin。参照NCBI上已经发表的犬β-actin基因的mRNA序列(GenBank登录号为NM001195845)，利用Primer Premier 5.0设计并合成一对特异性引物，上游引物：5′-ATATCGCTGCGCTTGTGGTC-3′；下游引物：5′-CCGTGCTCAATGGGGTACTTC-3′。
构建标准曲线，将cDNA进行梯度稀释，得到5个梯度模板(100、10-1、10-2、10-3、10-4)进行real-time PCR检测，根据模板拷贝数的对数和CT值绘制标准曲线。real-time PCR反应体系:模板1 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL、SYBR® Premix DimerEraserTM 10 μL、ROX Reference DyeⅡ(50×)0.4 μL，去离子水补充至20 μL，充分混匀。real-time PCR反应程序：95 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，72 ℃数据采集1 s，共36个循环。60~90 ℃熔解曲线，0.3 ℃·s-1，60 ℃退火15 s，终止反应。
1.6 组织病理切片的制作肿瘤组织经4%多聚甲醛固定过夜后，经过脱水、透化、浸蜡、包埋、切片等程序，切割成3 μm的石蜡切片。经HE染色中性树胶封片后，于显微镜下观察。
1.7 组织中MUC1的检测将“1.6”中的石蜡切片经脱水、抗原修复、封闭、一抗孵育、二抗孵育、DAB显色等过程进行IHC检测。
IHC结果判读：细胞结构中出现黄色或棕黄色颗粒即存在MUC1蛋白的表达。对每个IHC样本随机选5个视野进行拍照，然后采用Image Pro Plus对照片平均光密度值(MOD)进行分析，阳性染色面积与目标蛋白的量成正比，染色的强度与目标蛋白的关系符合朗伯-比尔定律。
1.8 统计学分析real-time PCR反应中每个样品均重复三次，7500 Software v2.0荧光分析软件自动进行定量。应用SPSS18.0对数据进行T检验和单因素方差分析，MOD值以“x±s”表示，P＜0.05为差异显著。
2 结果 2.1 肿瘤组织学鉴定本试验共收集乳腺肿瘤病例47例，参照2011年Goldschmidt等[4]提出的犬乳腺肿瘤的分类和分级标准进行组织学分类和恶性程度分级，详见表 1和表 2。恶性肿瘤27例，良性肿瘤20例，组织恶性程度分级见表 3。
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表 1 组织恶性分级标准 Table 1 Criteria for histologic malignant grade |
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表 2 乳腺肿瘤组织恶性分级 Table 2 Histologic malignancy grade of mammary neoplasms |
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表 3 乳腺肿瘤组织恶性程度分级 Table 3 Malignancy grade of MGTs samples |
MUC1和β-actin基因PCR扩增得到如下琼脂糖凝胶电泳成像结果：在100~200 bp之间以及200 bp水平出现清晰的单一条带，与预测的MUC1和β-actin特异性引物扩增条带大小相符(图 1)。
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M.相对分子质量标准；1~3.β-actin；4~6.MUC1，均为恶性肿瘤样品 M. DNA marker; 1-3. β-actin; 4-6. MUC1, all samples were malignant mammary tumors 图 1 MUC1和β-actin基因cDNA PCR扩增结果 Figure 1 PCR products of cDNA by canine MUC1 and β-actin |
以Cycle为横坐标，不同模板浓度的对数(log Quantity)为纵坐标绘制标准曲线，如图 2。相关系数(R2)均大于0.990，标准曲线可信度高，二者的扩增效率相近。
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图 2 real-time PCR标准曲线 Figure 2 Standard curve of real-time PCR amplification |
对样本中的mRNA转录所得cDNA进行real-time PCR试验，生成的扩增曲线如图 3。
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图 3 real-time PCR动力学扩增曲线 Figure 3 Dynamic curve of real-time PCR amplification |
MUC1和β-actin熔解曲线均为单峰，产物特异性高，详见图 4。
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图 4 real-time PCR熔解曲线 Figure 4 Melting curve of real-time PCR amplification |
应用2-ΔΔCt对MUC1基因的转录进行定量分析，详见图 5。在肿瘤组织(n=47)和正常组织(n=3)中MUC1基因相对转录量分别为12.50±4.95和1.55±0.64，二者之间存在统计学差异(P=0.01)。在不同的恶性分级中，MUC1基因相对转录量差异较大(图 6)。在Ⅰ级(n=9)、Ⅱ级(n=13)和Ⅲ级(n=5)中相对转录量依次为2.25±1.48、1.75±1.41和30.24±11.24，Ⅲ级中MUC1基因相对转录量显著高于Ⅰ级和Ⅱ级(P值分别是0.016和0.011)。
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*.P＜0.05 图 5 肿瘤组和正常组MUC1基因相对转录量 Figure 5 Relative transcription of MUC1 in different groups |
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*. P＜0.05 图 6 不同恶性级别中MUC1基因相对转录量 Figure 6 Relative transcription MUC1 in different malignance grades |
乳腺肿瘤组织MUC1部分IHC结果见图 7，MUC1在正常乳腺组织细胞质内呈低表达，在乳腺肿瘤组织中细胞质和细胞核的着色，呈强阳性表达。经Image Pro Plus计算得出，正常组织(n=3)和肿瘤组织(n=47)的MOD分别为0.14±0.02和0.19±0.08，二者之间存在统计学差异(P=0.03)，详见图 8。恶性肿瘤组织(n=27)和良性肿瘤组织(n=20)的MOD分别为0.18±0.08和0.21±0.08，无统计学差异。在不同的恶性分级中MUC1表达有差异，Ⅰ级(n=9)的MOD显著低于Ⅱ级(n=13)和Ⅲ级(n=5)的MOD(P值分别为0.01和0.00)，见图 9。
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a.正常乳腺组织；b、c、d.简单癌组织 a. Normal mammary tissue; b, c and d. Simple mammary cancer tissue 图 7 MUC1在犬不同乳腺组织中的表达400× Figure 7 Expression of MUC1 in canine mammary tumors 400× |
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*. P＜0.05 图 8 肿瘤组和正常组MUC1的MOD Figure 8 MOD of MUC1 in different groups |
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*. P＜0.05 图 9 不同恶性级别MUC1的MOD Figure 9 Expression of MUC1 in different malignance grades |
MUC1基因定位于染色体1q21，其表达的异常与肿瘤的发生发展密切相关[5]。在癌症中，MUC1基因通过提高基因数量和转录水平，以及缺失转录后的调控来实现其过表达[2]。此外，MUC1在恶性肿瘤的侵袭和转移中发挥重要作用。在自发性乳腺癌和胰腺癌小鼠模型中发现，MUC1-/-小鼠肿瘤的侵袭和转移要明显迟于MUC1+/+的小鼠[6-7]。本研究中，MUC1在犬乳腺肿瘤组织相对表达量是正常乳腺组织的12.5倍，且在肿瘤的恶性分级中差异显著，组织恶性程度越高，MUC1相对表达量越高，说明MUC1基因的异常表达同样适用于犬乳腺肿瘤的诊断和预后评估。MUC1在正常上皮细胞表面呈极性分布，润滑和保护底层上皮细胞免受干燥、pH值变化以及污染物和微生物的入侵[8]，在发生肿瘤时，MUC1糖基化异常会影响其在细胞表面的排列，并不断向细胞内聚集，可能会增强致癌信号[9]。本试验中MUC1在正常乳腺细胞顶部细胞质中呈低表达，而在乳腺肿瘤组织的细胞质和细胞核内均呈现强阳性表达，与前人研究相一致。有研究显示，MUC1脱落的胞外结构域(MUC1-N)可作为癌症分级和治疗评估的生物标志物[10]，且与预后不良呈明显的相关性[11]。本试验中对MUC1的IHC检测发现，MUC1的MOD值随着肿瘤恶性程度的增强而增加，提示MUC1在犬乳腺肿瘤组织中的表达与组织恶性程度分级有关。
4 结论MUC1基因和MUC1在犬乳腺肿瘤组织中高表达，且与组织恶性程度分级密切相关，可为犬乳腺肿瘤诊断和恶性程度评估提供参考，为犬乳腺肿瘤的临床治疗提供理论数据。
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