猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)是一种广泛流行的只感染猪的支原体，能够引起猪慢性肺炎，导致体重增长缓慢和食物转化率下降，对猪规模化饲养具有重要的影响^[1]。Mhp引起猪支原体肺炎的第一步是特异性黏附到呼吸道黏膜上皮细胞表面，导致纤毛摆动停滞、脱落和上皮细胞破损，然后激发宿主炎症反应，使猪易于继发其他病原体的感染。Mhp对纤毛上皮细胞的黏附是引发感染的先决条件。张启敬等^[2]首次利用制备的单克隆抗体F1B6和F2G5发现了Mhp的膜蛋白P97，他们进一步试验发现这些单抗结合P97后，猪肺炎支原体就失去了对纤毛的黏附能力，因此，P97是Mhp膜上的一种黏附蛋白，并且在支原体感染过程中发挥着重要的功能。有研究表明，P97是猪肺炎支原体最主要的抗原蛋白之一，它在Mhp感染时引发的免疫反应要早于其他抗原蛋白，诱导机体产生的特异性IgA和IgM抗体比其他抗原的抗体要早35~60 d^[3]，并证实纤毛和阻断黏附抗体的结合位点位于P97 C端的重复序列^[4-5]。近些年，有许多研究者对P97或其R1区进行了表达，验证了其具有良好的免疫原性^[6]。

B细胞表位是位于蛋白质抗原上的抗体识别的最小多肽序列，目前，已有大量利用P97的免疫原性特点在疫苗及诊断方面的研究报道^[7-13]，然而，对该蛋白上B细胞表位的探索却几乎是一片空白。本研究拟构建P97蛋白抗原的酵母随机展示文库，并筛选、鉴定特异性B细胞表位。该文库的构建和特异性B细胞表位的鉴定将为我们进一步研制开发基于抗原表位水平的Mhp特异性诊断试剂盒和疫苗奠定基础。

1 材料与方法 1.1 菌株、质粒、工具酶、试剂、抗体和引物

E. coli DH5α购自益生科技；酵母菌株EBY-100、酵母表达载体pCT-XcmⅠ由本实验室保存，pMD18-T载体购自TaKaRa公司。Ex Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶均购自TaKaRa公司；DNaseⅠ购自NEB公司；鸡源抗C-Myc抗体、FITC标记兔抗鸡IgY购自life Technologies公司；山梨醇(sorbitol)、醋酸锂(LiAc)购自Sigma公司；蛋白胨、Yeast nitroen base、Casamino acids、D-葡萄糖购自美国BD公司；Tris-HCl、MnCl₂、乙二胺四乙酸二钠(Na₂EDTA)、琼脂粉、氯化钠(NaCl)、磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)、磷酸二氢钠(NaH₂PO₄·H₂O)等均为国产分析纯。

1.2 p97基因的扩增与突变

以Mhp全基因组为模板用p97-F和p97-R引物PCR扩增p97基因。针对p97基因上TGA的位点设计三对突变引物，分别为p97-mut-F1/R1、p97-mut-F2/R2和p97-mut-F3/R3(如表 1)，运用PCR定点突变技术将p97基因上三个TGA位点依次突变为TGG，胶回收纯化突变的产物，通过测序方法鉴定突变后p97基因的正确性。

1.3 酵母感受态的制备

将酿酒酵母EBY100菌接种于5 mL YPD液体培养基(20 g·L^-1蛋白胨，10 g·L^-1酵母提取物)在30 ℃和220 r·min^-1摇床中进行过夜培养。将过夜培养的酵母细胞液按1:100转接于500 mL新的YPD液体培养基中继续培养至OD_{600 nm}值为0.6~0.8。在室温条件下1 500 g离心5 min，收集酵母细胞，加入25 mL缓冲溶液Ⅰ(0.6 mol·L^-1 sorbitol，100 mmol·L^-1 LiAc, 10 mmol·L^-1 Tris-Cl, pH=7.5, 10 mmol·L^-1 DTT), 在30 ℃，220 r·min^-1培养30 min。于4 ℃和1 500 g条件下离心收集酵母细胞，然后用50 mL预冷的1 mol·L^-1山梨醇溶液洗涤酵母细胞2次。获得的酵母细胞感受态用1 mL的1 mol·L^-1山梨醇溶液重悬，分装后放置于-80 ℃保存。

1.4 P97酵母随机展示文库的构建与质量鉴定

首先，利用DNaseⅠ和相应缓冲液(20 mmol·L^-1 Tris-HCl pH=7.5；5 mmol·L^-1 MnCl₂)在37 ℃下对p97突变基因片段进行随机酶切，酶切反应用0.5 mol·L^-1的EDTA终止。酶切产物经纯化后用Ex Taq DNA聚合酶末端加A处理。处理后的突变p97随机酶切片段与用XcmⅠ处理回收的pCT-XcmⅠ按3:1混合，混合物通过T4 DNA连接酶在16 ℃下过夜连接。连接产物用PCR产物回收试剂盒纯化后电击转化到酵母感受态中。取少量电转化后的酵母涂布于SDCAA(6.7 g Yeast nitrogen base，5 g Casamino acids，13.6 g Na₂HPO₄·12H₂O，8.56 g NaH₂PO₄·H₂O，20 g dextrose，加入1 L ddH₂O)固体培养基计算酵母文库的库容量。其余酵母细胞液在1 500 g条件下离心5 min后弃上清，加入50 mL SDCAA选择液体培养基进行培养。文库上插入的片段质量通过随机挑取培养皿上酵母单克隆提取质粒进行测序分析。

1.5 P97酵母随机展示文库的诱导及分选

取10 mL SDCAA选择培养基培养的酵母文库细胞，加入含2%半乳糖的SGCAA液体培养基，在30 ℃对酵母细胞进行诱导表达48 h。然后，取约1×10⁷个酵母细胞，用PBS洗2次。用200 μL PBS重悬酵母细胞，加入鸡源抗C-Myc抗体，室温孵育30 min，用PBS洗3次；再用200 μL PBS重悬酵母细胞，加入FITC标记的兔抗鸡IgY抗体，室温孵育30 min，用PBS洗三次，最后用500 μL PBS重悬，用流式细胞仪分析鉴定酵母细胞的表达量。采用相同的方法，将P97酵母随机展示文库依次用Mhp天然感染的猪阳性血清和FITC标记的抗猪IgG的二抗进行染色，以只用二抗孵育的酵母文库作为阴性对照。Mhp抗体标记的酵母文库通过流式细胞仪分选出结合能力较强的阳性酵母克隆，从阳性克隆中提取质粒送测序。

2 结果 2.1 p97基因扩增与突变

以Mhp全基因组为模板，用PCR扩增的方法获得全长p97基因，PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图 1所示，扩增p97产物片段的大小在3 000 bp标准marker附近，与预期大小3 279 bp相符。由于在支原体中TGA终止密码子编码色氨酸，为了使p97上包含TGA密码子的抗原肽能在酵母中展示表达，p97基因上的三个TGA终止密码子用PCR定点突变的方法进行了TGG突变，通过测序鉴定确定突变后的p97基因完全正确，并且基因内部的TGA终止密码子全部成功突变为TGG。

2.2 P97酵母随机展示文库的构建及其质量评价

利用DNaseⅠ对突变后的p97基因随机酶切，经1%琼脂糖凝胶电泳进行分析，结果如图 2所示，突变p97随机酶切片段主要集中在100~250 bp之间，表明本试验成功将p97突变基因进行了随机消化。将突变p97的随机片段与酵母载体的连接产物电转酵母感受态，采用十倍梯度稀释方法对转化子进行数量统计，经过涂板计数后，酵母表达文库的库容量约为2.86×10⁶CFU，从中随机挑取100个单克隆进行测序分析，测序获得的突变p97小片段与突变p97全长基因比对结果显示，100个克隆中插入的突变p97随机小片段覆盖了整个p97突变基因，而且分布均匀，长度大部分集中在100~250 bp(图 3~4)。在这些片段中，正向插入的片段有53个，占挑取克隆数的53%；反向插入的有47个，占47%。从以上数据可以看出该文库的库容量达到了用于抗原表位筛选的要求，而且片段随机分布，丰度均匀，因此可以用于分析P97蛋白上的B细胞表位。

2.3 P97酵母随机展示文库的诱导表达及阳性克隆的分选

为了进一步验证酵母随机展示文库是否成功表达插入的P97抗原片段，将构建的酵母文库进行诱导表达，通过鸡源抗C-Myc抗体染色后经流式细胞仪分析，结果如图 5所示，文库中约5%的酵母表面表达了P97的随机抗原片段，这表明构建的酵母随机展示文库含有相当部分的有效插入P97随机片段，能用于对Mhp感染过程中P97抗原表位的筛选。

利用Mhp天然感染的猪阳性血清对展示在酵母表面的抗原肽进行流式分选，经鉴定得到与血清反应较强的184号酵母克隆(图 5)，为了验证该克隆中插入的184号抗原肽是否为最小的抗原表位，进一步从184短肽C端逐个缺失1、2、4、5、6个氨基酸后(表 2)，再次将其展示到酵母细胞表面，用Mhp天然感染的猪阳性血清对其进行流式分析。如图 6所示，184号短肽缺失氨基酸后，与抗体结合能力大幅度下降，当缺失6个氨基酸时(184E短肽)，与Mhp天然感染的猪阳性血清几乎不反应，由此可见184短肽缺失5个氨基酸的184D是P97上一个B细胞表位。为了验证184D表位在猪体内诱导的抗体免疫应答是否具有普遍性，将184D表位展示在酵母表面，然后用随机挑选的6份Mhp阳性猪血清进行染色，如图 7所示，184D表位能与所有Mhp天然感染的猪阳性血清反应，该结果表明184D表位是P97蛋白上一个通用表位。

3 讨论

抗原表位是抗原抗体反应的基础，对它们进行鉴定可以促进我们更深入理解病原在体内诱导免疫应答的特点。目前筛选抗原表位的方法十分多样，比较成熟的有表面展示技术和生物信息学方法预测技术。其中酵母表面展示技术与其他技术相比具有许多优点。首先，酵母表面展示技术依赖于真核后翻译机制，能够在抗原蛋白上进行糖基化等多种修饰，这是原核表达系统所不能做到的^[14]。其次，抗原表位与抗体相互作用后，可以利用流式细胞仪检测技术进行分析，该方法准确性高，可以高通量和高效率展开表位的鉴定，而且操作简单。该方法通过酵母培养，能够避免蛋白生产和纯化等消耗时间的步骤；最后，将抗原展示在酵母表面可以用于鉴定目的蛋白上用作免疫原的功能区^[15]。

佐藤等^[15]首次将酵母展示技术成功引入到病原蛋白抗原区的筛选和鉴定研究中，他们通过该技术对流感病毒的HA蛋白进行了抗原区的分析，成功揭示了该蛋白上在体内能诱导抗体免疫应答的线性和空间构象型抗原区。后来，用该系统也成功对H5N1病毒、新城疫病毒、沙门菌等病原的蛋白进行了抗原区分析和表位图谱绘制^[16-18]。因此，这些研究证明酵母展示技术是用于病原蛋白上抗原区分析的很好平台。利用酵母展示技术对病原蛋白的抗原区分析时，酵母文库的构建是关键因素之一。本研究中，获得的酵母文库的库容量为10⁶数量级，我们实验室的实践表明库容量的大小比基因长度大十倍时，获得的酵母文库就可以覆盖所有可能的20~100 aa的抗原肽^[17-18]。由于p97基因长度为3 279 bp，库容量远大于基因的大小，因此，本试验中构建的酵母文库将不会出现在表位筛选时漏选的情况。我们所构建的文库，片段大小主要集中在100~250 bp之间，抗原肽序列在30~60 aa之间，B细胞表位大小大部分在8~20 aa之间，从该酵母库筛选出的阳性抗原肽更接近精确表位序列，因此大幅降低了进一步精确分析表位序列的工作量。本研究的结果表明用于表位筛选的酵母文库，其展示的随机抗原片段越小越有利于下面的鉴定工作。

p97突变基因经DNaseⅠ随机消化插入到酵母表达载体上后，由于编码框的移码和存在正反两个插入方向，密码子正常表达的概率只有1/6，而且由于质粒的稳定性和培养生长期的不同，实际情况远比这个比例低^[19-21]。本研究中的展示文库诱导后可以检测到约5%的阳性率，这一结果符合以前多次报道的首次检测阳性率偏低的现象^{[15, 17-18]}。

本研究中筛选到的184抗原肽序列包含有20个氨基酸，但是这个序列不一定是B细胞表位的最小序列，需要进一步通过多肽截短试验进行鉴定。在本试验中将184阳性抗原肽从C端减少6个氨基酸时，该抗原肽完全失去了与血清相互作用的功能，由此可见剩下的包含15个氨基酸的序列为一个最小的B细胞表位。在184多肽逐渐变短的184A、184B和184C序列与阳性血清相互作用后，阳性率逐渐变小，这说明在184序列中可能包含有不同的抗原表位，它们在截短过程中，有些表位被破坏使相同血清结合的抗体数量变少。我们用流式细胞术检测到184D抗原表位与6份来源于不同宿主的Mhp阳性猪血清均发生作用，说明184D抗原表位具有普遍性。之前的研究报道表明P97蛋白的免疫原性主要在该蛋白的R1区。然而，本试验利用Mhp天然感染的猪阳性血清筛选到的表位序列并不位于P97 R1区，因此我们推测P97蛋白上可能还存在其他重要的抗原区，这一结果对于我们将来利用P97设计疫苗和开发诊断试剂盒的研发具有指导作用。

4 结论

成功构建P97蛋白酵母随机展示文库，利用该文库筛选和鉴定到一个长度为15个氨基酸的184D(DEKTSSQKDPSTLRA)多肽，它是P97上一个在宿主体内能普遍诱导抗体免疫应答的B细胞表位，本研究对于研发Mhp的表位疫苗和建立特异性诊断方法具有重要意义。