2. 江苏农林职业技术学院, 句容 212400
, WU Jing-sheng2, LI Guo-hui1, YU Yan1, YANG Jian-bo2, SU Yi-jun1, YIN Jian-mei1, HAN Wei1
2. Jiangsu Vocational College of Agriculture and Forestry, Jurong 212400, China
禽白血病(avian leukosis，AL)是由反转录病毒科禽白血病/肉瘤病毒群病毒(avian leukosis/sarcoma virus，ALV)引起的禽类(主要是鸡)各种良性和恶性肿瘤的一类疾病。禽白血病病毒依据病毒囊膜糖蛋白的抗原差异、病毒干扰试验、宿主范围和基因组分子生物学特性将其划分为10个亚群(A~J亚群)[1-2]和新发现的K亚群[3]，其中A、B、C、D、J亚群属于外源性病毒，对鸡生产影响较为严重的是A、B和J亚群[4-6]。
ALV可水平和垂直传播[7-8]。水平传播主要通过出雏和育雏期羽毛、粪便等接触传播，整个饲养过程中疫苗免疫也是主要传播途径之一。已有的研究表明，ALV可通过母鸡和公鸡进行垂直传播，但是，公鸡、母鸡在ALV垂直传播给下一代所起到的作用至今没有相关报道。Tsukamoto等[9]研究发现ALV可通过母鸡输卵管传播给胚胎，Payne和Nair[10]报道也表明ALV-A、ALV-B和ALV-J均可通过母鸡垂直传播给后代。Segura等[11]、Smith和Fadly[12]研究认为禽白血病病毒不能在公鸡的生殖器官中增殖，公鸡仅作为病毒载体，在交配过程中传播给后代。张培培[13]在仿土蛋鸡群J亚型禽白血病病毒的感染状态评估及其来源探究中发现，后代分离到的ALV-J毒株与其父本ALV-J分离株的gp85基因序列相似性达98.5%~99.7%，表明其来源于父本。俞燕等[14-16]在地方鸡种公鸡精液检测中发现有ALV，Li等[17]研究发现公鸡可通过精液将ALV垂直传播给后代。
针对鸡遗传资源保种场、基因库而言，由于单个保种群规模较小(一般30~40个家系，抢救性保护群体数量更少)，若淘汰全部带毒个体或家系(尤其是数量较少的公鸡)，会导致群体规模骤减，造成遗传多样性丢失和近交系数过快增加。基于此，我们以惠阳胡须鸡和汶上芦花鸡为素材，对阳性公、母鸡垂直传播特性进一步验证探讨，旨在为优化种禽场、保种场禽白血病净化方案提供理论参考。
1 材料与方法 1.1 实验动物及分组惠阳胡须鸡和汶上芦花鸡均来源于国家级地方鸡种基因库(江苏)，43周龄时进行禽白血病血液和精液病毒分离检测，筛选个体组建以下试验组：(1)阳性惠阳胡须鸡♂×阴性汶上芦花鸡♀(♂3只，血液病毒分离S/P值分别为0.877、1.856、4.328；♀分3小组，每组8只)；(2)血液和精液病毒分离检测均为阴性的汶上芦花鸡♂×阳性惠阳胡须鸡(♂为3只，♀为3小组，S/P值分别在0.2~1、1~2、>2，每组8只)；(3)对照组，阴性芦花公鸡♂×阴性汶上芦花鸡♀(8只)，具体见表 1。实验鸡群人工输精，每个母鸡个体单独一个输精枪头，收集种蛋12 d。种蛋标记，孵化盒分装孵化，雏鸡隔离饲养。
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表 1 实验公母鸡分组情况 Table 1 Grouping situation of roosters and hens |
43周龄采集惠阳胡须鸡和汶上芦花鸡无菌抗凝血1.5 mL，并同时采集精液。对试验组后代采集1日龄胎粪，42日龄泄殖腔拭子、无菌抗凝血血液，死亡实验鸡群的肝组织。胎粪和泄殖腔拭子：检测前反复冻融3次，静置取上清。血液、精液和肝组织处理及其病毒分离见参考文献[14, 18-19]。
1.3 p27抗原ELISA检测血浆病毒分离细胞上清，“1.2”中收取的毒液，冻融后的胎粪与泄殖腔拭子上清，用ALV p27抗原试剂盒检测，具体操作按照IDEXX公司ELISA试剂盒说明书进行。
1.4 前病毒cDNA的制备根据病毒分离ELISA检测结果，收取阳性的DF-1细胞沉淀，按OMEGA公司SQTISSUE组织DNA试剂盒说明书制备前病毒基因组cDNA，-20 ℃保存备用。
1.5 分离株env基因的PCR扩增和序列分析针对env基因设计并合成一对通用引物，用于扩增ALV囊膜蛋白env基因约2.6 kb片段(上游引物5′-CGAGAGTGGCTCGCGAGATGG-3′；下游引物5′-ACACTACATTTCCCCCTCCCTAT-3′)。以前病毒基因cDNA为模板，PCR扩增ALV囊膜蛋白env基因，片段大小约2.6 kb。阴性对照为DF-1细胞DNA，阳性对照为ALV-J NX0101株。反应条件：96 ℃预变性7 min；95 ℃变性50 s，58 ℃退火50 s，72 ℃延伸2 min，32个循环，72 ℃延伸7 min。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，采用TaKaRa公司DL5000 Marker，产物回收、纯化后扩增克隆至pMD18-T载体中测序。
1.6 数据统计与分析采用SPSS16.0 t检验对p27抗原阳性率进行比较分析，采用Blast和MEGA4.0程序进行序列比对和聚类分析。
2 结果 2.1 阳性公、母鸡后代ALV检测结果后代ALV检测结果(表 2)表明，阳性公鸡后代的胎粪p27抗原阳性率为23.49%，42日龄泄殖腔拭子p27抗原阳性率为36.60%，42日龄病毒分离阳性率为8.54%；阳性母鸡后代的胎粪p27抗原阳性率为12.42%，42日龄泄殖腔拭子p27抗原阳性率为19.89%，42日龄病毒分离阳性率为0%；阳性公鸡后代的胎粪、泄殖腔拭子和病毒分离阳性率显著高于阳性母鸡后代。
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表 2 阳性公、母鸡后代p27抗原检测 Table 2 p27 antigen detection result of ALV-positive roosters and hens |
病毒分离检测S/P值高低与后代ALV检测阳性率的相关性分析结果(表 3)表明，输精个体S/P值的高低与后代阳性率无相关性(P>0.05)。
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表 3 阳性公、母鸡43周龄病毒分离S/P值与其后代ALV阳性率的相关性分析 Table 3 Correlation analysis of amount of ALV carried or shed by ALV-positive roosters and hens and positive rate of p27 antigen in their offsprings |
对胎粪、泄殖腔拭子与病毒分离p27抗原检测阳性率进行比较，发现当公鸡为阳性时，在后代胎粪检测为阴性群体中，病毒分离检测却检测到3个阳性个体，胎粪检测阳性个体与病毒分离检测阳性个体的符合率为85%。说明胎粪检测有一定的漏检率。42日龄棉拭子检测的阳性个体与病毒分离阳性个体的阳性符合率为100%。
2.4 病毒分离阳性个体env基因的PCR扩增和测序ALV env基因PCR扩增产物大小在2 600 bp左右，琼脂糖凝胶电泳结果见图 1。
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M. DL5000相对分子质量标准；1~5. ALV env基因扩增产物 M. DL5000 marker; 1-5. Amplification products of ALV env 图 1 ALV env基因的PCR扩增 Figure 1 PCR amplification of ALV env |
利用Blast对分离株env的gp85基因序列与GenBank数据库比对，结果表明，测序序列与已报道的ALV-J亚型序列(登录号AF247385.1、KF796647.1、KT598484.1、GU222401.1、KT598483.1、JX855935.1)相似性>95%。该分离株的gp85序列与A、B、J亚型参考株的gp85基因序列进行遗传演化分析，如图 2中显示，该序列与J亚型聚在同一分支，进一步证明该毒株为J亚型。
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△.本研究分离毒株序列；○.ALV-B gp85基因序列；□.ALV-A gp85基因序列 △.Sequence of isolated strain in this study; ○.gp85 gene sequence of ALV-B; □. gp85 gene sequence of ALV-A 图 2 不同亚型禽白血病毒株gp85基因序列的遗传演化分析 Figure 2 Phylogenetic analysis of gp85 gene sequence of avian leukosis viruses strains subtype A, B and J |
本试验开展的前提基础是能准确筛选出阳性鸡个体和阴性鸡个体。根据发病鸡的表型和实验室检测可准确检测出禽白血病阳性个体，但是阴性个体确定十分困难。为确保试验的准确性，惠阳胡须鸡阳性个体确定是通过43周龄血液病毒分离检测阳性结果，结合试验后期病症解剖观测；汶上芦花鸡阴性个体是通过43周龄血液病毒阴性结果，结合家系病史追溯，要求筛选出的阴性个体上3个世代家系内没有出现禽白血病个体。
在前期工作中对地方鸡种进行了排毒规律摸索，发现5周龄排毒量最高[18]，结合生产的需要(6周龄进行筛选鸡群进行转群)，试验确定在6周龄对试验组后代个体进行禽白血病病毒分离检测。通过PCR扩增测序和遗传聚类分析，确定本试验个体感染毒株为J亚型禽白血病病毒。
3.2 ALV通过阳性公鸡(母鸡)传播后代的规律赵鹏等[20]研究发现种蛋中禽白血病病毒p27抗原检出率与鸡群禽白血病发病率呈正相关。本试验结果进一步验证了ALV可通过公鸡精液传播给后代，且公鸡在ALV传播给后代过程中起重要作用。
试验发现禽白血病阳性公鸡后代病毒分离的阳性率为8.54%，禽白血病阳性母鸡后代没有发现阳性个体；且阳性公鸡后代的胎粪p27抗原、泄殖腔拭子p27抗原与血液病毒分离阳性率显著高于阳性母鸡后代。该研究结果进一步验证了张培培等[13, 17]的研究结果，更进一步得出了阳性公鸡对ALV的垂直传播影响较大的结论。对于在阳性母鸡后代中没有发现阳性个体，分析主要有几方面原因：一是品种原因，不同品种对ALV的易感性不同；且本试验是杂交试验，有可能增强了鸡的抵抗力；二是本试验并非SPF鸡，鸡本身存在抗体；三是采取了母鸡单个输精枪头；四是可能与检测的时间点有关；课题组对试验鸡群将继续饲养检测进行进一步验证。
试验结果提示在禽白血病净化过程中，应加大对公鸡的检测力度，建议采取血液病毒分离和精液病毒分离相结合的方法[17]。
3.3 阳性鸡S/P值大小对后代阳性率影响本试验禽白血病检测使用的ELISA试剂盒，其阳性判定标准为S/P>0.2。S/P值高低与后代阳性率是否存现相关性，相关报道较少。郝建勇等[15]研究表明，在蛋清ELISA检测时，S/P值高低与对应母鸡外源性ALV病毒血症有一定的相关性。本试验结果发现43周龄血液病毒分离检测为阳性个体的S/P值高低与后代的阳性率没有显著的相关性。
3.4 不同检测方法阳性率比较针对胎粪、泄殖腔拭子的假阳性和漏检等研究报道很多，陈俊霞等[21]研究发现，胎粪p27抗原检测和泄殖腔拭子p27抗原检测均有较高的假阳性，并且有一定的漏检。俞燕等[18]也发现泄殖腔拭子有较高的假阳性，且有漏检。
本试验发现，胎粪p27抗原与泄殖腔棉拭子p27抗原检测存在较高的假阳性，尤其是泄殖腔棉拭子p27抗原检测假阳性较高。在胎粪p27抗原检测阴性个体中，血液病毒分离p27抗原检测出现了3个阳性个体，胎粪检测漏检率为15%。42日龄泄殖腔拭子p27抗原检测结果与病毒分离检测符合率为100%。对禽白血病进行净化，一般情况下，前期检测(胎粪、42日龄血液病毒分离)采取的是家系淘汰法，即一个个体为阳性，家系后代全部淘汰，增加了净化工作量和成本。因此建议不进行胎粪及泄殖腔拭子ALV检测。
在AL的防控中，除了对种群进行ALV检测及时淘汰阳性个体，还应制定严格的饲养管理措施。孵化、育雏、疫苗免疫、输精等是影响禽白血病水平传播的重要途径，生产中对新疫苗及时进行禽白血病检测，疫苗注射在不同品种间换针头，多品种一起继代繁殖时，每个品种(家系)使用固定的输精杯，阳性率高、低品种分开孵化出雏。
4 结论在地方品种惠阳胡须鸡和汶上芦花鸡中，ALV阳性公鸡后代的阳性率显著高于阳性母鸡后代，血液病毒分离检测阳性鸡S/P值高低与后代阳性率没有显著相关性，ALV胎粪检测和泄殖腔棉拭子具有较高的假阳性率。研究结果为进一步制定更合理的禽白血病净化方案提供了理论依据。
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