流行性出血病(epizootic haemorrhagic disease，EHD)是通过节肢昆虫库蠓传播流行性出血病病毒(EHDV)，引起的一种非接触传染病^[1]。该病能感染野生及家养反刍动物，特别是引起白尾鹿体温升高、黏膜和浆膜面广泛出血，并常于昏迷状态下死亡^[2]。牛感染发病，症状主要是发热、厌食、溃疡性口炎、呼吸疾病、一些组织器官特别是舌的出血坏死，茨城病由EHDV-2病毒型感染引起，可致牛消瘦、脱水，最后因肺炎而死^[3]。部分羊也能感染发病，症状主要表现为皮下水肿，心外膜、眼结膜和瘤胃及肠的浆膜表面出血，胸部和心包囊有黄色液体，鼻排带绿色黏质物^[4]。此病在流行期危害较大，严重影响着畜牧业和国际贸易的发展，世界动物卫生组织(OIE)已将EHD列为法定报告传染病^[5]。

近年来，云南、新疆、内蒙古、广西和广东等地进行的血清学调查均检出EHDV阳性血清，特别是存在对牛有较强致病力的EHDV-2、6和7型^[6-9]。2015年曹颖颖等^[10]在广西分离到EHDV-5型毒株，2016年吕敏娜等^[11]在广东分离到EHDV-1型毒株，本实验室自2012年至2017年间在云南牛体内分离到多株EHDV-1、2、5、6和7型毒株。以上结果表明EHDV在我国分布广泛，存在发生该病的风险，因此该病的血清学检测方法研究对我国进出口贸易及疫病防控具有重要意义。

目前，有学者用表达的EHDV VP7蛋白作包被抗原建立检测抗体的间接ELISA方法，或用EHDV群特异性单克隆抗体建立了C-ELISA检测方法，但均无商品化试剂盒^[12-14]。本实验室曾制备多株EHDV单克隆抗体，由于均未达到诊断检测要求，无法用于组装高质量C-ELISA试剂盒。所以本研究选择用纯化灭活后的EHDV-6型病毒作为ELISA检测用标准抗原，豚鼠抗EHDV-2型多克隆抗体作为竞争抗体与待检抗体竞争，通过抑制率大小来判断待检血清阴阳性，建立了检测EHDV抗体的C-ELISA方法。该方法具有较好的特异性和敏感度，同时具有快速诊断、使用方便等优点，为EHDV血清抗体普查提供了一种有效工具。

1 材料与方法 1.1 主要试剂

高吸附ELISA板购自COSTAR公司，抗原保护剂购自CANDOR公司，羊抗豚鼠HRP标记二抗购自Abcam公司，TMB购自SurModics公司，脱脂奶粉购自BD difco公司，BCA Protein Assay Kit购自TaKaRa公司，二乙烯亚胺(BEI)、佐剂206由云南省保山疫苗厂提供，0.01 mol·L^-1 PBS中加入0.05%的Tween-20配制成PBST洗液，PBST中加入1%的脱脂奶粉配制成稀释液。

1.2 毒株、实验动物、血清及细胞

EHDV-2、6型毒株由本实验室从2012年云南师宗牛血中分离获得，经病毒中和试验和基因序列分析鉴定定型。5月龄豚鼠购自云南省昆明医科大学动物试验中心，健康无疾病，检验合格；黄牛和山羊购自云南牲畜交易市场，6月龄，健康无病，经核酸RT-PCR及血清中和试验检测，证明未感染过EHDV。不同血清型EHDV阳性血清及阴性血清，蓝舌病病毒(BTV)、山羊痘病毒(GPV)、中山病病毒(CHUV)和赤羽病病毒(AKAV)阳性血清，由本实验室保存；小反刍兽疫病毒(PPRV)阳性血清由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所惠赠；口蹄疫病毒(FMDV)、牛流行热病毒(BEFV)阳性血清由中国农业科学院兰州兽医研究所惠赠；BHK-21细胞由本实验室保存。

1.3 病毒纯化及抗血清制备

采用长成单层的BHK-21细胞培养EHDV-2、6型毒株，7 d出现100%细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)后收获病毒，冰水浴下超声波破碎处理3次，将上层液体置于30%~70%的蔗糖连续密度梯度上进行密度梯度离心，8 ℃ 35 000 r·min^-1离心4 h，在40%~60%结合处获得纯化的病毒带，37 ℃ 1.5 mmol·L^-1 BEI灭活处理12 h，6型病毒作为包被抗原，2型病毒经佐剂206乳化，按每只免疫0.5 mL，免疫4只豚鼠，21 d后加强免疫1次，每次免疫7 d后采血分离血清，进行血清中和试验测定抗体效价。

1.4 最佳抗原包被浓度和竞争抗体浓度的确定

用棋盘法筛选最佳抗原包被浓度和最佳竞争抗体使用浓度。将纯化灭活后的6型EHDV抗原用包被液按1:4 000~1:14 000倍稀释，50 μL·孔^-1 4 ℃过夜包被反应板；PBST洗涤后用5%的马血清37 ℃封闭2 h；拍干马血清，每孔各加入10 μL的阴性(N)和阳性(P)血清后，加入用稀释液按同样稀释倍数配制好的豚鼠抗EHDV-2型多克隆抗体(竞争抗体)50 μL·孔^-1 37 ℃ 30 min；拍干液体后加入HRP酶标抗体50 μL·孔^-1 37 ℃ 30 min；PBST洗板6次，加入TMB 50 μL·孔^-1，避光显色12 min；每孔加入50 μL 1.5 mol·L^-1 H₂SO₄溶液终止反应，测定OD_{450 nm}值，比较阴阳性对照OD_{450 nm}值(N/P值)，N/P值最大的反应孔中使用的包被浓度和竞争抗体浓度即为最佳浓度。

1.5 临界值的确定

对270份(180份牛血清和90份羊血清)阴性血清进行C-ELISA检测，对所有的抑制率进行统计分析，计算样本的平均抑制率和标准偏差(s)。根据公式：临界值=阴性样品平均抑制率+3×s^[15]，计算出临界值。对270份(250份牛血清和20份羊血清)阳性血清进行C-ELISA检测，确定最小阳性血清抑制率(present inhabitation，PI)，PI=(阴性对照OD-样品OD)/阴性对照OD^[16]。综合阴性和阳性血清的检测结果，确定试剂盒的判定标准。

1.6 特异性试验

对各1份EHDV(1、2、5、6、7和8型)和BTV(1~24型)阳性血清，各2份GPV、AKAV、CHUV、PPRV、FMDV、BEFV阳性血清进行检测，确定检测方法的特异性。

1.7 敏感性试验

将已知血清中和抗体效价的各1份EHDV(1、2、5、6、7和8型)阳性血清从1:10倍开始进行倍比稀释，同时进行血清中和试验(SNT)、琼脂扩散试验(AGID)和C-ELISA检测，比较三种方法检出阳性的血清最大稀释度，验证试剂盒的敏感性。

1.8 临床样品测定试验

2014—2017年间，每年挑选10头牛和5头山羊作为监控动物，经核酸及SNT检测，证明未感染过EHDV，放养在云南师宗农户家中组成监控群。每年4月至11月每周采集一次血清和抗凝血，11月至次年3月每月采集一次，次年4月更换监控动物，分别用C-ELISA、SNT检测血清，RT-PCR和病毒分离试验检测抗凝血，比较这4种方法的符合情况。

1.9 重复性试验

从同一批次(WH603-1W)及不同批次(WH603-2W、WH603-3W、WH603-4W和WH603-5W)C-ELISA试剂盒中随机取4个，分别检测4份阳性样品和4份阴性样品，并设阳性对照和阴性对照，每份样本重复2孔，计算PI值的变异系数，以检验批次内及批次间重复性。

1.10 再现性试验

将各4份的阳性、弱阳性和阴性血清分成3管，各取2管同2个试剂盒、结果统计表和操作说明，分别采用冷链运输(环境温度控制在4~8 ℃)送至新疆畜牧兽医科学院兽医研究所(Lab 1)、山西农业大学兽医传染病学实验室(Lab 2)，2 d内到达。剩下1管血清留在本实验室，即云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室(Lab 3)进行检测。每个实验室收到样品，2 d内开始检测，设置三个重复。完成后将检测结果报至本实验室，进行再现性分析。

2 结果 2.1 病毒纯化及抗体制备

用PBS将纯化灭活后的2型EHDV稀释250倍，BAC法测定总蛋白质量浓度为192 μg·mL^-1，佐剂乳化后免疫豚鼠，每次免疫后取血测定血清中和抗体效价(表 1)，1号和3号豚鼠在试验过程中死亡，2号和4号豚鼠3次免疫后血清中和抗体效价为1:2 560和1:1 810，选取2号豚鼠高免血清作为竞争抗体使用。

2.2 最佳抗原包被浓度和最佳竞争抗体浓度的确定

棋盘法滴定结果显示6型EHDV抗原按1:10 000倍稀释(总蛋白质量浓度为5.12 μg·mL^-1)，竞争抗体按1:10 000倍稀释时，阴性对照(N)OD_{450 nm}为1.04，接近1.0；阳性对照(P)OD_{450 nm}为0.074，背景较低；阴阳反差N/P值14.05，最大，因此在C-ELISA体系中抗原1:10 000稀释包被反应板，竞争抗体最佳工作浓度为稀释1:10 000倍(表 2)。

2.3 临界值的确定

对270份牛、羊阴性血清进行C-ELISA检测，平均PI值为4.88%，标准差(s)为0.133，根据公式：临界值=阴性样品平均抑制率+3×s，计算出临界值为44.78%；对同样数量的阳性血清进行检测并计算PI值，最小PI为45.87%，平均PI为76.00%，对以上结果进行统计(图 1)。PI在40%~50%间为在一个过渡区域，极少数阴性和弱阳性血清样品存在此期间内，为保证检测的准确性，将临界值设定为50%，PI>50%判定为阳性，PI在40%~50%之间判定为可疑。

2.4 特异性试验

对各1份的不同血清型EHDV和BTV阳性血清，各2份GPV、AKAV、CHUV、PPRV、FMDV、BEFV阳性血清进行C-ELISA检测(表 3)。结果表明不同血清型EHDV血清检测均为阳性，24种血清型BTV阳性血清及其他相关病毒阳性血清检测结果均为阴性。因此，该ELISA方法具有较好的群特异性，与其他牛、羊易感病毒的阳性血清无交叉反应。

2.5 敏感性试验

将中和抗体效价为1:113、1:160、1:320、1:320、1:226和1:453的6种不同血清型EHDV血清，从1:10开始倍比稀释，同时进行C-ELISA、SNT和AGID检测(表 4)。C-ELISA能检测出阳性的血清最大稀释度分别为1:320、1:640、1:1 280、1:1 280、1:640和1:1 280，均高于SNT和AGID；AGID能检出阳性的血清稀释度最小，超过1:80倍，检测结果均为阴性。

2.6 临床样品测定

2014—2017年间，共对40头牛和20头羊采集的各1 980份血清和抗凝血进行C-ELISA、RT-PCR及病毒分离检测。C-ELISA检测发现，2014年6、7月3头牛转阳，转阳率为30%；2015年8月1头牛转阳，转阳率为10%；2016年10月2头牛转阳，转阳率为20%；2017年6月2头牛转阳，转阳率为20%，除2016年动物在10月转阳，其余动物均在6—8月转阳，说明夏季虫媒活动更频繁，易引起虫媒病传播。4年间均未发现山羊血清转阳，动物血清转阳前后几周试验数据见表 5。测定分离病毒TICD₅₀后，用病毒同对应牛的血清进行SNT，血清转阳结果同C-ELISA结果吻合；抗凝血RT-PCR检测及病毒分离证明血清转阳动物均被EHDV感染，感染时间和血清转阳时间吻合；其他动物样品4种方法连续检测结果均为阴性，说明该方法能准确检测出动物的血清转阳，有很好的准确性。

2.7 重复性试验

从同一批次及不同批次EHDV C-ELISA试剂盒中随机抽取4个试剂盒，分别检测8份样品，批次间变异系数在2.62%~8.72%，批次内变异系数在2.95%~8.89%，变异系数均小于10%(表 6)，表明该试剂盒有较好的批次内及批次间重复性。

2.8 再现性试验

在3个不同实验室，用该试剂盒检测同样的4份阳性、弱阳性和阴性血清。结果表明12份血清样品在3个实验室的检测结果相一致，阴阳性判断完全正确，变异系数在1.14%~8.44%之间，均小于10%(表 7)，说明该试剂盒再现性较好。

3 讨论

我国地域辽阔，自然条件复杂，很多地区适于各类虫媒病毒活动，新发和复发虫媒病毒病更是随着近年全球变暖而不断出现。目前，云南、新疆、山西、内蒙古、广西和广东等地都报道检测到EHDV阳性血清，并从部分省区分离到病毒，EHD防控形式严峻。

EHDV血清抗体检测是了解EHDV感染情况的必要手段，目前用于EHDV抗体检测的方法主要有ELISA、SNT、AGID和补体结合试验(complement fixation test，CFT)四种。AGID因其简单、经济，过去曾被大量使用，但存在需对抗原进行高度浓缩，抗原需求量大等缺点，且因检测EHDV和BTV血清时存在交叉反应，所以该试验结果在BTV和EHDV共存地区不可靠^[15]。CFT在1980年以前一直用于血清检测，可在病毒感染后4~12个月定性及定量测定抗体，但随后可靠性降低，因此不能用于检测老疫区感染^[17]。SNT是目前国际上抗体检测的金标准，有较好的特异性、灵敏度，但有操作要求高、检测时间长等缺点，并不适于快速诊断和基层单位使用^[18]。ELISA具有操作简便、检测样本通量大、当天就能出结果等优点，适于大规模的血清调查及基层单位使用，已被广泛应用于兽药残留检测及各类疾病诊断等方面^[19]。目前，国外有学者采用EHDV VP7单克隆抗体(群特异性抗体)建立了血清检测的C-ELISA方法^[20]，国内有学者用原核表达VP7蛋白作包被抗原建立间接ELISA方法，但至今已报道的ELISA方法均无商品化试剂盒。为能开展EHDV血清学调查相关工作，本研究选择建立能进行快速血清检测的C-ELISA方法。

研究初期，由于制备的多株单克隆抗体未达到使用要求，所以本研究选用豚鼠抗EHDV多抗为竞争抗体，以纯化灭活后的EHDV作为包被抗原，HPR标记的羊抗豚鼠为酶标抗体，建立了抗体检测的C-ELISA方法。由于多克隆抗体竞争位点较多，不可能做到彻底阻断显色反应，因此建立的C-ELISA方法可能在敏感性和特异性上不如单克隆抗体方法，但在本研究中，通过各反应条件的优化使阳性血清最高抗体抑制率达90%以上，阴性血清抑制率集中在20%以下。

特异性试验中，该方法仅能检测出不同血清型EHDV阳性血清，同相关病毒阳性血清无交叉反应，特别是与EHDV同源性较高，用AGID试验检测常出现交叉反应的BTV阳性血清，用所建立的C-ELISA方法均能准确区分。2016年用该方法对云南采集的2 737份牛血清进行C-ELISA检测，并从检测为阳性的血清中随机选出700份进行血清中和试验确定血清型，结果存在EHDV-1、2、5、6、7和8不同亚型^[9]。结果说明该方法具有较好的群特异性，但由于本实验室保存的不同亚型EHDV病毒库和血清库还不完整，特异性试验还需进一步完善。

敏感性试验中，6种不同血清型的EHDV阳性血清从1:10倍开始倍比稀释，同时进行C-ELISA、SNT和AGID检测，C-ELISA能检出阳性的血清最大稀释度均高于SNT和AGID，且1 d内出检测结果，SNT用了7 d，AGID用了3 d，如果无需确定待检血清的血清型，ELISA在敏感度和检测时间上都有优势。

检测监控点连续4年采集的1 980份血清发现，该方法检出血清转阳动物及转阳时间均与SNT、RT-PCR和病毒分离试验检测结果对应一致，同时发现动物被感染后的2~3周内为抗体增长期，抑制率迅速升高，之后进入稳定期，至次年4月更换动物前抑制率均维持在80%以上，未转阳动物血清持续检测均为阴性，说明该方法具有较好的可靠性和稳定性。对比4种检测结果发现，在血清抗体增长期，即核酸检测阳性后第2周和第3周更易分离到病毒，而核酸阳性仅能维持3~4周，所以可以首先选用C-ELISA方法持续检测血清，只需对血清转阳前后5周的抗凝血进行RT-PCR检测，并将核酸阳性血液接种细胞分离病毒，省去需要对每次采集的血液进行RT-PCR检测，提高了病毒分离工作效率。对4年间分离的病毒进行基因序列分析和病毒中和试验鉴定存在EHDV-1、2、5、6、7型，详细信息另文报道。批次内和批次间重复试验及在3个不同实验室间的再现性试验，CV值均小于10%，说明该方法有较好的重复性和再现性。

4 结论

建立的C-ELISA方法具有较好的特异性、敏感性、应用性及重复性，为我国EHDV抗体检测提供了一种有效工具，使一些不具备SNT试验条件的地方也能开展血清检测，有助于我国进行EHD的血清调查和防控。