2. 南京农业大学动物医学院农业部动物细菌学重点实验室, 南京 210095
2. Key Laboratory of Animal Bacteriology of Ministry of Agriculture, College of Veterinary Medicine, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
猪圆环病毒(porcine circovirus, PCV)属于圆环病毒科圆环病毒属成员。该病毒有两个血清型，即PCV1和PCV2[1]。通常认为，PCV1不具有致病性，偶见其引发的繁殖障碍，但其在猪群中广泛感染。PCV2感染可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(post-weaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)、猪皮炎肾病综合征(porcine dermatitis nephropathy syndrome, PDNS)、猪呼吸道综合征(porcine respiratory disease complex, PRDC)、母猪繁殖障碍综合征、腹泻及先天性震颤等多种临床疾病，给全球养殖业带来了巨大的经济损失，引起各国养猪业的高度重视[2-3]。近年来，美国学者Phan、Palinski等首先发现繁殖障碍母猪、PDNS、猪心肌炎和多系统炎症病变组织中存在一种新的猪圆环病毒，其Cap基因序列与PCV2的相似性仅24%~26%，命名为PCV3[4-5]。我国学者采用PCR方法从临床发病猪肺和淋巴结组织样品中检出PCV3，证明我国也存在该病毒[6-7]。
环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)具有经济实用、高效、快速和简便等特点，已经用于多种猪病原检测，如猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征和猪伪狂犬病毒等[8-9]，但尚无PCV3 LAMP检测方法报道。本研究根据PCV3基因序列，设计特异引物，成功建立了一种PCV3 LAMP检测方法，56 ℃恒温条件下35 min内即可直接通过肉眼判定，并具有较高特异性和敏感性。
1 材料和方法 1.1 病毒、重组质粒和病料病毒：PCV3、PCV1、PCV2a、PCV2b、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)等均由本实验室分离保存。
重组质粒：pMD19-T-Cap，含PCV3 ORF2基因，浓度为1.89×10-7ng·μL-1，基因拷贝数为5.22×1010copies·μL-1，由南京金思瑞生物技术有限公司构建并提供。
猪临床样品：来源于2016—2017年江苏、山东、浙江和福建省38个猪场，临床上表现呼吸道症状，淋巴结和肺组织样品68份。-20 ℃保存备用。
1.2 病毒核酸提取按照DNA提取试剂盒说明书进行抽提，采用TRIZOL试剂说明书方法提取病毒核酸，置-20 ℃保存。
1.3 LAMP引物设计与合成根据PCV3 MO毒株(NCBI登录号:KX778720.1)Cap基因保守序列，运用在线生物软件(https://primere explorer.jp/)设计特异性引物，引物序列见表 1，包括一对外引物F3和B3、一对内引物FIP和BIP以及一对环引物LoopF和LoopB，引物由Invitrogen公司合成。
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表 1 LAMP扩增引物 Table 1 Primers used in LAMP amplification |
LAMP反应体系25 μL，含10×Thermopol Buffer(NEB公司)2.5 μL、MgSO4(100 mmol·L-1)(NEB公司)1.5 μL、dNTP(10 mmol·L-1)(NEB公司)3.5 μL，内引物FIP/BIP(40 μmol·L-1)各为1 μL，外引物F3/B3(5 μmol·L-1)各1 μL，环引物LoopF/LoopB(10 μmol·L-1)各为1 μL，Bst DNA聚合酶(8 000 U·mL-1)(NEB公司)1.5 μL，甜菜碱(Betaine)(Sigma公司)2.0 μL，灭菌ddH2O 6.5 μL，模板DNA 1.5 μL。
1.5 LAMP反应体系和条件优化按下列成分的浓度进行反应体系优化：dNTP浓度梯度4、6、8、10和12 mmol·L-1；Mg2+浓度120、100、80、60和40 mmol·L-1；甜菜碱量4.0、3.0、2.0、1.0和0 μL；内、外引物(μmol·L-1)比12:1、10:1、8:1、6:1和4:1。
反应温度优化：温度设置(67、65、63、61、59和57 ℃)；反应时间设置为(40、38、36、34和32 min)5个梯度，反应结束后取5 μL反应产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定结果，根据条带扩增效果确定最佳反应条件。
1.6 LAMP敏感性试验将重组质粒pMD19-T-Cap阳性质粒标准品稀释至106copies·μL-1，按10倍倍比稀释至100.1copies·μL-1，用优化好的PCV3-LAMP方法和常规RT-PCR方法同步进行敏感性比较。并对以上结果分别用SYBR Green Ⅰ染料进行显色，筛选最佳染料。
1.7 LAMP特异性试验取PRRSV、PRV、PCV1、PCV2和猪瘟病毒样品，提取病毒基因组，用LAMP方法检测，用1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
用Olige软件分析LAMP目的片段中的酶切位点，筛选单一的HaeⅡ(识别GCGC)，进行酶切反应。20 μL酶切反应体系包括：HaeⅡ(TaKaRa公司) 1.5 μL，LAMP产物1 μL，10×Buffer 2 μL，15.5 μL ddH2O。37 ℃反应2 h，取15 μL的酶切产物在1.5%琼脂糖凝胶进行鉴定，酶切产物大小应为184 bp。
1.8 PCR方法检测PCV3按Palinski等[5]方法进行。PCR反应体系为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性20 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，进行40个循环；最后72 ℃延伸5 min。引物为5′-CCACAGAAGGCGCTATGTC-3′和5′-CCGCATAAGGGTCGTCTTG-3′，PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳观察。
2 结果 2.1 LAMP反应体系和条件优化采用LAMP体系内不同浓度组分，进行反应条件优化，结果见图 1，确定25 μL最佳反应体系成分为：10×Thermopol Buffer 2.5 μL，MgSO4(100 mmol·L-1)1.5 μL，dNTP(10 mmol·L-1)3.5 μL，外引物F3/B3(4 μmol·L-1)各1 μL，内引物FIP/BIP(40 μmol·L-1)各为1 μL，环引物LF/LB(10 μmol·L-1)各为1 μL，Bst DNA聚合酶(8 000 U·mL-1)1.5 μL，甜菜碱(Betaine)2 μL，灭菌ddH2O 6.5 μL，模板cDNA 1.5 μL。最佳反应温度为59 ℃，最短反应时间为36 min。
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A. dNTP浓度优化; B.Mg2+优化；C.甜菜碱优化；D.内外引物浓度比优化；E.温度优化；F.时间优化；M.DNA相对分子质量标准；N.阴性对照 A. Optimization of dNTP concentration; B. Mg2+ concentration; C. Betaine concentration; D. Ratio of forward and reverse primers concentration; E. Temperature; F. Reaction time; M. DNA marker DL2000;N. Negative control 图 1 PCV3 LAMP反应体系和条件优化结果 Figure 1 Optimization of the reaction system and conditions of LAMP for detection of PCV3 |
反应产物用SYBR Green Ⅰ(Invitrogen公司)染料进行显色比较。
2.2 可视性结果观察LAMP反应过程中，dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生焦磷酸镁白色沉淀(图 2A)。SYBR Green Ⅰ则通过结合到双链DNA的小沟产生绿色荧光，而阴性呈现黄色(图 2B)。
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A.不加染料观察；B. SYBR Green Ⅰ显色结果 A. LAMP positive products without stain components; B. LAMP positive products by adding SYBR Green Ⅰ 图 2 LAMP两种染料可视化效果比较 Figure 2 Observation of LAMP amplification products by adding 2 staining components |
取PCV3重组质粒pMD19-T-Cap(浓度为1.89×10-7ng·μL-1，基因拷贝数为5.22×1010copies·μL-1)，用蒸馏水做10倍梯度稀释，采用LAMP和PCR检测PCV3，结果为：常规PCR方法可检测102copies·μL-1浓度的质粒，LAMP反应可检测到10拷贝·μL-1浓度的质粒，比常规PCR方法敏感10倍。
2.4 LAMP特异性试验取PCV3、PRRSV、PRV、PCV1、PCV2和猪瘟病毒样品进行PCV3 LAMP检测，结果显示，PCV3样品LAMP扩增可见梯形条带，其他病原检测均未见条带(图 4A)。
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A.LAMP电泳结果; B.RT-PCR; C.LAMP-SYBR Green Ⅰ显色。1~9. 107 ~100.01基因拷贝·μL-1; 10.阴性对照；M. DL2000 DNA相对分子质量标准 A. LAMP results; B. RT-PCR; C. Visual of SYBR Green Ⅰ. 1-9. 107 ~100.01 copies·μL-1; 10. Negative control; M. DL2000 DNA marker 图 3 LAMP反应敏感性试验 Figure 3 Sensitivity of LAMP |
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A.不同病原的LAMP检测结果；B. LAMP反应产物鉴定结果；1.阴性对照；2.猪瘟病毒；3.猪流行性腹泻病毒；4.猪圆环病毒1型；5.猪圆环病毒2a和2b型；6.猪伪狂犬病毒；7.猪圆环病毒3型；8.猪繁殖与呼吸综合征；9. Hae Ⅱ酶切LAMP产物结果；M. DL2000 DNA相对分子质量标准 A. LAMP detection of different pathogens results; B. Identification results of LAMP reaction products; 1. Negative control; 2. CSFV; 3. PEDV; 4. PCV1; 5. PCV2a+2b; 6. PRV; 7.PCV3; 8.PRRSV; 9. LAMP products digested with Hae Ⅱ; M. DL2000 DNA marker 图 4 LAMP特异性试验结果 Figure 4 Spicificity assay of LAMP |
取PCV3 LAMP扩增产物，采用Hae Ⅱ酶切，1.5%琼脂糖凝胶电泳结果显示，出现约184 bp条带和126 bp(图 4B)，与预期计算结果相符，证明扩增正确。
2.5 临床样品检测取68份临床发病猪组织样品，采用LAMP显色法与常规PCR同时检测，结果见表 2，表明LAMP检测PCV3阳性检出率为30.9%(21/68)，常规PCR阳性率为26.5%(18/68)，LAMP方法检出率高于常规PCR检测结果，LAMP与常规PCR符合率为95.6%(65/68)。
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表 2 LAMP与PCR检测临床样品PCV3结果的比较 Table 2 Comparison of LAMP with PCR results for PCV3 in clinical samples |
在2003年以前PCV2a为主要流行毒株，而近年来PCV2b感染较为普遍。猪圆环病毒3型(PCV3)是一种新的病原，2016年10月，Palinski等[5]报道了从流产胎猪中检测到高拷贝的PCV3基因组。国外报道该病毒感染可能与猪皮炎和母猪繁殖障碍相关，但其致病性还不十分清楚。该病毒的检测方法主要有PCR方法、real-time PCR方法和核酸探针方法[10-12]。PCR方法具有灵敏性和特异性高的特点。我国学者采用PCR方法进行了大量样品检测[12]，但需要价格昂贵的PCR检测仪器。Real-time PCR及核酸探针方法条件要求更高，很难普及推广。
环介导的恒温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，是Notomi等[13]于2000年发明的一种体外恒温核酸扩增技术，不需要昂贵的仪器设备，在等温条件下就能快速完成反应[14-15]。目前该项技术已被广泛用于细菌、病毒、寄生虫和动物胚胎鉴定等检测。本研究所建立LAMP检测方法只需在恒温59 ℃条件下反应36 min即可完成扩增，通过在反应管中加入染料经颜色变化判定结果，达到快速检测的目的。在筛选荧光染料、提高检测结果灵敏度的研究结果上发现，SYBR Green Ⅰ比HNB显色效果更直观，敏感性也更佳。该方法同样具备较好的特异性，灵敏度与real-time PCR相当。临床样品检测结果显示，LAMP与传统的PCR有较高的符合率，与庞笑语等[16]报道的结果相符。这表明PCV3已经普遍存在于我国猪群体内，因此加强该病流行病学监测显得至关重要。本研究建立的针对PCV3的LAMP检测方法快速简便，可用于PCV3临床检测，具有较好的应用前景。
由于该技术具备极高的灵敏度，故在检测过程中会不可避免出现假阳性污染问题。因此LAMP的检测环境需要严格分区，操作规程一定要严谨，多通风。针对此类问题，我们在以后的研究中也会继续寻找改进的措施。
4 结论根据PCV3 ORF2基因保守序列，设计特异性引物并优化反应条件，建立了PCV3 LAMP检测方法，该方法最低检测限为1.0×101copies·μL-1，与PRRSV、PRV、CSFV、PCV1和PCV2等均无交叉反应。临床样品检测发现，PCV3阳性率占30.9%，与PCR检测结果符合率为95.6%(65/68)。提示相对传统PCR方法而言，该方法敏感特异，简便快速，可用于PCV3检测和临床诊断。
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