肠炎沙门菌<i>lux</i>S缺失株的构建及其生物学特性研究
   畜牧兽医学报  2018, Vol. 49 Issue (6): 1291-1298. DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2018.06.022    PDF    
肠炎沙门菌luxS缺失株的构建及其生物学特性研究
于艳超1, 王莉莉2, 潘巧2, 辛九庆2, 王秀梅2     
1. 吉林农业大学 动物科学技术学院, 长春 130118;
2. 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 动物支原体创新团队, 哈尔滨 150069
摘要:拟研究LuxS/AI-2群体感应系统对肠炎沙门菌(Salmonella enterica Serovar Enteritidis,SE)生物学特性的影响。利用Red同源重组系统构建LuxS/AI-2系统关键基因luxS缺失株,通过比较亲本株和luxS缺失株体外生长速率、药物敏感性、细胞黏附侵袭能力及生物被膜形成能力等生物学特性,初步分析AI-2/LuxS系统对SE生物学特性的影响。结果显示,luxS缺失株能够稳定遗传缺失的△luxS基因;体外生长速率略快;生物被膜形成能力明显增强;对DF-1细胞和Caco-2细胞黏附侵袭能力均显著增加;对氟喹诺酮类药物敏感性提高128~256倍,对氨苄西林、四环素、多西环素、氯霉素和氟苯尼考类等的药物敏感性提高了8倍。以上结果表明,LuxS系统影响肠炎沙门菌的生物学特性(如生物被膜形成、对细胞的黏附侵袭能力),并且该系统也通过某种耐药机制影响肠炎沙门菌的药物敏感性。
关键词肠炎沙门菌    群体感应系统    luxS基因    药物敏感性    
Construction and Biological Characteristics of Salmonella Enterica Serovar Enteritidis luxS Mutant
YU Yan-chao1, WANG Li-li2, PAN Qiao2, XIN Jiu-qing2, WANG Xiu-mei2     
1. Animal Science and Technology College, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China;
2. Animal Mycoplasma Innovation Team, Harbin Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150069, China
Abstract: The study was conducted to investigate the effect of LuxS/AI-2 quorum-sensing system on the biological characteristics of Salmonella enterica Serovar Enteritidis. A luxS mutant strain was constructed by Red homologous recombination system, and its ΔluxS gene stability, growth features, antimicrobial susceptibility, adherence and invasion, as well as biofilm formation were determined and compared with the wild type. Our results showed that the ΔluxS gene exhibits stability in ΔluxS mutant. The growth of ΔluxS mutant was slightly faster than the wild strain in vitro. Biofilm formation of the mutant strain was significantly enhanced as well as the adhesion and invasion ability to DF-1 cells and Caco-2 cells. Deletion of luxS resulted in a 128-to 256-fold increase in susceptibility to fluoroquinolones and moderate increases (2-to 8-fold) in susceptibility to ampicillin, tetracycline, doxycycline, chloramphenicol, and florfenicol. These results suggest that LuxS/AI-2 system affects biological characteristics of SE including biofilm formation, adhesion and invasion to cells, moreover, the AI-2/LuxS sensing system affect antimicrobial susceptibility of SE through certain resistance mechanisms.
Key words: Salmonella enterica Serovar Enteritidis     quorum sensing system     luxS gene     antimicrobial susceptibility    

肠炎沙门菌(Salmonella enterica Serovar Enteritidis)是具有广泛宿主侵害性的人兽共患病原菌之一,可引起人和动物肠道或全身性疾病。大量应用抗生素导致沙门菌的耐药性逐年增强[1]。因此,如何有效预防肠炎沙门菌感染已经成为公共安全领域关注的焦点[2]

细菌通过感应自身合成的自诱导信号分子(autoinducer, AI),调控某些基因的表达,进而调控特定环境行为的过程,称为群体感应(quorum sensing, QS)[3]。AI-2/LuxS感应系统在革兰阴性菌和革兰阳性菌中广泛存在,S-核糖基高半胱氨酸酶(S-ribosylhomocysteinase, LuxS)是自诱导信号分子AI-2合成的关键酶[4],该系统主要通过调控病原菌的毒力基因表达、生物被膜形成和药物敏感性等生物学特性来实现对病原菌的调控。尽管AI-2/LuxS系统已经在沙门菌中鉴定,但该系统对肠炎沙门菌生物学特性的调控目前还没有相关报道。因此,本文通过构建AI-2/LuxS系统关键基因luxS缺失株,研究该系统对肠炎沙门菌生长特性、生物被膜形成能力和药物敏感性等的作用,初步探究AI-2/LuxS系统对肠炎沙门菌生物学特性的影响,为深入研究该系统对肠炎沙门菌的调控提供基础数据。

1 材料与方法 1.1 菌株、细胞及质粒

禽肠炎沙门菌SE-SM32株由本实验室分离鉴定并保存,Escherichia coli ATCC25922菌株由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所张万江副研究员惠赠;E. coli DH5α及BL21(DE3)感受态细胞购自南京诺唯赞生物科技有限公司;DF-1细胞、质粒pKD46、pKD3、pCP20、pET-28a均由本实验室保存;Caco-2细胞购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司;pMD18-T载体购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.2 主要试剂和仪器

DMEM培养基购自Hyclone公司;胎牛血清(FBS)购自Clark公司;电转化仪购自Bio-Rad公司;限制性内切酶和T4 DNA ligase均购自NEB公司。

1.3 引物的设计

根据SE-SM32菌株luxS基因的测序结果(结果未展示),利用软件Primer Premier 5.0设计luxS基因重组引物及鉴定引物(表 1)。l1/l2用于扩增含luxS基因同源臂的氯霉素抗性基因的片段,luxS -F/R用于luxS基因突变的检测,csgB-RT-F/R和csgD-RT-F/R分别用于荧光定量PCR扩增生物被膜形成相关基因csgB和csgD。引物由吉林省库美生物科技有限公司合成。

表 1 本研究所用的引物序列 Table 1 Primers used in this study
1.4 电击感受态细胞的制备

将pKD46质粒电转至SM32株中,构建重组菌SM32/pKD46。将该菌株于30 ℃振荡培养过夜,次日按1:100转接到30 mL含氨苄青霉素的LB培养基中,30 ℃继续振荡培养至OD600 nm为0.2~0.3时,加入L-阿拉伯糖至终浓度为30 mmol·L-1,诱导菌体重组蛋白表达,离心收集菌体,按照常规方法制备电转化感受态细胞[5]

1.5 SE-SM32△luxS基因缺失株的构建及鉴定

参考文献的方法[6],利用Red同源重组方法构建缺失株。以pKD3为模板,利用引物luxS-F/R PCR扩增出含有luxS基因同源臂和氯霉素抗性的luxS-pKD3片段并进行胶回收。然后将其电转到含有pKD46质粒的SE-SM32感受态细胞中,在GamBetExo这三种λ噬菌体重组酶作用下发生一次同源重组, 重组产物SM32ΔluxS::cat经PCR鉴定成功后,电转入pCP20质粒,通过质粒pCP20去除氯霉素抗性基因,37 ℃培养后挑取单克隆,通过PCR扩增和测序鉴定luxS基因缺失成功。

1.6 luxS缺失株稳定性

参考文献的方法评价luxS缺失株稳定性[7],SM32ΔluxS在LB无抗性平板上连续划线传代,并分别于第1、5、10、15、20和25代时,挑取单菌落用鉴定引物进行PCR鉴定,测定缺失株中luxS基因是否发生回复突变。

1.7 药物敏感性测试

按照美国临床检验标准委员会(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)推荐的微量稀释法进行药物敏感性测定和结果判定[8]。测定了8种抗生素对菌株的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentrations, MICs),包括环丙沙星(0.031 25~32 μg·mL-1)、诺氟沙星(0.25~256 μg·mL-1)、左氧氟沙星(0.062 5~64 μg·mL-1)、氨苄西林(0.125~128 μg·mL-1)、四环素(0.125~128 μg·mL-1)、多西环素(0.125~128 μg·mL-1)、氯霉素(0.125~128 μg·mL-1)和氟苯尼考(0.125~128 μg·mL-1)。在第1孔中加入180 μL MH培养基,第2—12孔中分别加入100 μL MH培养基。然后在第1孔中加入20 μL的药物,吹打混匀后吸出100 μL加入到第2孔中,依次倍比稀释至第12孔。再将稀释好的菌液分别加入第1—11孔内,第12孔不加菌液作为阴性对照。37 ℃培养20 h,每次做3个重复,Escherichia coli ATCC25922作为质控菌株,同时测定其MIC值。

1.8 生长曲线测定

参照Chaudhari和Kariyawasam[9]的方法,测定SM32、SM32ΔluxS生长曲线。将细菌培养至OD 600 nm=1,种子液按1:100接种于20 mL LB培养基中,37 ℃ 180 r·min-1培养,间隔1 h取样一次,每次取1 mL菌液,连续测定13 h内细菌OD 600 nm的吸光度,记录结果并绘制生长曲线,生长曲线试验重复三次。

1.9 激光共聚焦观察细菌生物被膜

参照文献方法[10],利用激光共聚焦扫描显微镜观察细菌生物被膜的形态,SM32、SM32ΔluxS各200 μL分别加入激光共聚焦皿中37 ℃培养24 h后,PBS洗3次,以除去松散附着的细菌,加1 mL 4%多聚甲醛,固定细菌,室温静置30 min,PBS洗3次。然后利用SYTO 9核酸染料进行染色。室温静置避光孵育15 min,PBS洗3次以洗去多余染料。激光扫描共聚焦显微镜观察其在荧光模式下的变化。

1.10 Real-time PCR检测生物被膜形成相关基因csgB和csgD的转录

以甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)为内参基因,用Real-time PCR对csgB和csgD基因的转录进行相对定量。参照ABI Power SYBR试剂盒说明书选用反应体系及扩增条件。反应体系20 μL:Realtime PCR Marster Mix 10 μL,模板1 μL,Primer 1 (10 pmol·L-1) 0.5 μL,Primer 2 (10 pmol·L-1) 0.5 μL,ddH2O 8 μL。扩增条件:95 ℃ 10 min;95 ℃ 15 s;60 ℃ 1 min;循环次数40次。同时增加熔解曲线反应条件,检测引物特异性。数据分析采用2-△△Ct(Livak)法[11],计算基因的mRNA转录水平。

1.11 细胞黏附侵袭试验

参考文献方法[12],测定细菌对DF-1细胞和Caco-2细胞的黏附侵袭。将亲本株SM32和缺失株SM32ΔluxS接种至LB培养基中,37 ℃培养至OD600 nm=0.6~0.8,收集细菌于4 ℃离心5 min,离心力为6 000 r·min-1,无菌PBS洗3次,再用DMEM重悬菌体沉淀。同时将细胞铺24孔板,37 ℃培养至半融合状态,并调整每孔的细胞密度为2×106个,按感染复数MOI为1:200的比例加入细菌,共同孵育2 h。随后用无菌PBS清洗3次以除去未黏附的细菌,在已黏附细菌的细胞内加入0.5% Triton X-100裂解液200 μL,室温裂解10 min后加入800 μL PBS。细胞悬浮液在PBS中连续进行10倍稀释,涂布在LB琼脂板上过夜培养后,计算细菌的黏附数。细菌侵袭试验的方法中,细胞培养、感染和计数的操作方法与前述黏附试验相同。细胞与细菌共同孵育后加入庆大霉素至终质量浓度100 μg·mL-1,37 ℃孵育1 h以杀死细胞外的细菌,用0.5%Triton X-100裂解被细菌侵袭的细胞,倍比稀释涂板计数。每组试验均重复三次,每次试验三个重复。

1.12 数据分析

数据使用GraphPad PRISM 5.0软件分析,当两个试验组进行比较时使用t检验分析,P<0.05时判定为显著性差异。

2 结果 2.1 沙门菌luxS基因缺失株的构建

以pKD3质粒为模板,利用引物l1/l2扩增出含有氯霉素抗性基因的融合PCR产物luxS-pKD3,经琼脂糖凝胶电泳鉴定大小约为1 049 bp,与预期结果相符(图 1A),将其电转入含有pKD46质粒的SE菌株中,在含有氯霉素的LB平板上,37 ℃过夜培养后筛选阳性克隆,经luxS-F/R引物鉴定,阳性克隆条带大小为1 453 bp,亲本株条带大小为516 bp(图 1B),利用质粒pCP20消除抗性基因,再次使用luxS-F/R引物对抗性消失的克隆进行检测,此时菌株条带大小约为220 bp(图 1C)。PCR及测序结果表明,氯霉素抗性基因成功去除,获得SM32ΔluxS缺失株。

A.融合片段的扩增(M. DNA相对分子质量标准;1.阴性对照; 2.融合片段luxS-pKD3);B.引物luxS-F/R鉴定SM32ΔluxS::cat(M. DNA相对分子质量标准;1.SM32;2、3. SM32ΔluxS::cat);C.引物luxS-F/R鉴定SM32ΔluxS(M. DNA相对分子质量标准;1.SM32;2.SM32ΔluxS::cat;3~5. SM32ΔluxS) A. Fusion fragment amplification (M. DNA molecular mass standards; 1. Negative control; 2. Fusion fragment, luxS-pKD3); B. Identification of SM32ΔluxS:: cat by primer luxS-F/R (M. Plasmid standards; 1. SM32; 2, 3. SM32ΔluxS::cat); C. Identification of SM32ΔluxS by primer luxS-F/R (M. DNA molecular mass standards; 1. SM32;2.SM32-ΔluxS::cat; 3-5. SM32ΔluxS) 图 1 luxS缺失株的鉴定 Figure 1 Identification of the luxS mutant strain
2.2 SM32ΔluxS体外遗传稳定性

SM32ΔluxS缺失株体外连续传代,取第1、5、10、15、20、25代单菌落用鉴定引物luxS-F/R进行PCR鉴定,结果均可扩增约220 bp的目的片段,未发生回复突变,表明缺失株luxS基因能够在体内稳定遗传(图 2)。

M. DNA相对分子质量标准;1~6. SM32ΔluxS;7. SM32;8.阴性对照 M. DNA molecular mass standards; 1-6. SM32ΔluxS; 7. SM32; 8. Negative control 图 2 luxS突变基因的稳定性 Figure 2 Stability of luxS mutant gene
2.3 药敏试验

利用微量稀释法测定亲本株和缺失株对8种抗菌药物的最小抑菌浓度,结果如表 2所示,与亲本株相比,△luxS突变株的药物敏感性均有不同程度的提高,对氟喹诺酮类的敏感性提高128~256倍,对β-内酰胺类提高8倍,四环素类提高2~4倍,氯霉素类提高4~8倍,表明luxS基因突变提高了肠炎沙门菌对部分药物的敏感性。

表 2 氟喹诺酮类、β-内酰胺类、四环素类、氯霉素类抗生素对亲本株和缺失株的最小抑菌浓度 Table 2 MICs of fluoroquinolones, β-lactams, tetracycline and chloramphenicol antibiotics for parental strain and mutant strains
2.4 生长曲线

连续测定了亲本株和缺失株在13 h内的生长曲线,如图 3所示,缺失株SM32ΔluxS生长速度略快于亲本株SM32,在最初的0~2 h内,亲本株与缺失菌株生长速率大致相同,在3~13 h时,缺失菌株生长速率有所增加。

进行3次重复,每次重复设3个平行组,生长曲线代表其中一次重复试验 The experiments were performed three times independently in triplicates. The representative growth curve from one of three independent experiments is shown 图 3 SM32和SM32ΔluxS生长曲线 Figure 3 The growth curves of SM32 and SM32ΔluxS
2.5 生物被膜形成能力测定

图 4所示,激光共聚焦图像较直观地呈现了亲本株和缺失株的生物被膜形态,其中绿色代表活菌,如图 4A所示,野生菌的生物被膜比较疏松,不能聚集成团;而luxS基因缺失株的生物被膜形成更多聚集体,聚集成团且结构致密(图 4B),其生物被膜形成能力明显强于亲本株。随后选取生物被膜形成相关基因csgB、csgD进行了转录水平的检测,发现与野生菌相比,缺失株中的csgB、csgD的表达水平未发生明显变化(数据未展示),表明luxS对肠炎沙门菌生物被膜的影响与csgB和csgD基因无关,可能通过其他机制引起。

A.亲本株SM32;B.缺失株SM32ΔluxS A. Parental strain SM32; B. The mutant strain SM32ΔluxS 图 4 激光共聚焦观测生物被膜 Figure 4 Confocal laser scanning of biofilms
2.6 细胞黏附、侵袭试验

分别测定了亲本株和缺失株对不同细胞系的黏附和侵袭能力,如图 5所示,与亲本株相比,缺失株SM32ΔluxS对DF-1细胞的黏附和侵袭能力均提高约14倍。为了验证luxS缺失在其他细胞系中也存在黏附侵袭能力增强的作用,同时选用Caco-2细胞进行重复试验,结果显示缺失株对Caco-2细胞的黏附能力增加约3.8倍,侵袭能力增加约3.7倍,而且差异显著(P < 0.000 1,见图 5图 6)。

试验进行3次重复,每次重复设3个平行组。误差线代表 3次重复试验的标准差。***.P < 0.000 1 The experiment was repeated 3 times, each repeated set of 3 parallel groups. The error bars represent the standard deviations of 3 replicates.***.P < 0.000 1 图 5 SM32和SM32ΔluxS黏附、侵袭DF-1细胞 Figure 5 Adhesion and invasion of DF-1 cells by SM32 and SM32ΔluxS
试验进行3次重复,每次重复设3个平行组。误差线代表 3次重复试验的标准差。***.P < 0.000 1 The experiment was repeated 3 times, each repeated set of 3 parallel groups. The error bars represent the standard deviations of 3 replicates.***.P < 0.000 1 图 6 SM32和SM32ΔluxS黏附、侵袭Caco-2细胞 Figure 6 Adhesion and invasion of Caco-2 cells by SM32 and SM32ΔluxS
3 讨论

根据自诱导信号分子的性质及感应模式,群体感应系统目前主要有以下4种:AI-1/LuxIR系统、AI-3/QseC系统、AI-2/LuxS系统和AIP/Agr系统,前两种系统在革兰阴性菌中存在,AIP/Agr系统在革兰阳性菌中存在[13]。AI-2/LuxS系统是最广泛存在的群体感应系统,首次在海洋微生物哈氏弧菌中调控生物发光被发现[14],已被报道调控许多致病菌毒力基因的表达,细菌生长,生物被膜形成和运动性[3]。尽管LuxS系统在沙门菌中已被鉴定,但其许多生物学功能仍不明确。本研究结果显示,LuxS系统对肠炎沙门菌的生物学特性也有影响。

黏附和侵入宿主细胞是病原微生物引起感染的关键步骤,脂多糖、菌毛、毒力岛等多种毒力因子可以促进这一复杂过程。本试验中luxS缺失株对两种细胞系DF-1细胞及Caco-2细胞的黏附侵袭能力均增加,说明缺失株黏附侵袭能力的增加与细胞系无关,这暗示luxS基因可能通过调控具有黏附侵袭功能的毒力因子,使缺失菌株对细胞黏附侵袭能力发生改变。伤寒沙门菌中,luxS缺失降低了SPI-1毒力岛基因的表达而影响了菌株的侵袭力[15]。但肠炎沙门菌luxS缺失株侵袭力的增加是否与SPI-1毒力岛基因有关,还需进一步的研究。

生物被膜是促进定植、免疫逃避和抗菌药耐药的关键结构,其形成在许多细菌中受luxS的影响[16]。本研究中luxS缺失后菌株的生物被膜形成能力显著增强,说明luxS对肠炎沙门菌生物被膜形成也有影响。与我们的结果一致,Yoshida等[17]发现链球菌缺失luxS基因后生物被膜形成增加,进一步研究发现,luxS基因缺失后产生的葡糖基转移酶清除了大量可发酵碳水化合物并生成非水溶性葡聚糖,导致生物被膜增厚。我们推测肠炎沙门菌缺失luxS后,生物被膜的增加也可能与葡糖基转移酶有关,但其机制仍待进一步的研究。

此外,AI-2/LuxS系统以未知机制参与细菌药物敏感性变化,如AI-2/LuxS系统参与中间链球菌的药物敏感性[18],灭活luxS基因提高了咽炎链球菌对红霉素和氨苄西林的敏感性[19]。与上述研究相似,本试验中luxS基因缺失引起缺失株对环丙沙星、氨苄西林和氯霉素等敏感性显著提高,但缺失株的生长活性不受影响,说明luxS基因对菌株药物敏感性的影响可能与某些耐药机制有关。已经报道E. coli的QS系统通过AcrAB外排泵调控环丙沙星耐药[20],本研究中环丙沙星、氨苄西林和氯霉素为AcrAB-TolC外排泵的底物,据此推测,luxS缺失引起的肠炎沙门菌药物敏性的增加也可能与AcrAB多药外排泵有关。

4 结论

luxS基因缺失不影响耐药肠炎沙门菌的生长活性,但引起其药物敏感性、生物被膜形成能力及对DF-1细胞和Caco-2细胞黏附侵袭能力等明显增加,这些结果可为深入研究LuxS系统对肠炎沙门菌生物学特性的调控提供基础数据。

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