肉用动物的肌肉产量主要由肌纤维数量和截面直径直接决定[1]。胎儿期是动物骨骼肌发育的关键时期,出生后个体骨骼肌的发育主要表现为肌纤维的增大,而肌纤维的数量基本上不再增加[2]。因此,研究胎儿期的骨骼肌发育,对于肉用家畜来说具有非常重要的意义。在哺乳动物的骨骼肌发育过程中,多种细胞信号分子和转录因子参与了肌细胞的增殖和分化[3]。除此之外,microRNA(miRNA)作为一类重要的非编码RNA,通过其序列、结构、丰度和转录方式的多样性,在骨骼肌发育等许多生物过程中调控基因表达[4]。
miRNA是一类在真核生物中广泛表达的内源性小分子单链RNA,成熟后长度在22个核苷酸左右[5]。miRNA通过与靶向mRNA的3'UTR区域进行特异性的碱基互补配对,引起靶向mRNA的降解或转录活性稳定下降,抑制其翻译,从而在转录后层面抑制基因的表达[6-7]。研究发现,miRNA能够参与机体的多种生命活动,包括细胞增殖分化和凋亡、新陈代谢、疾病发生、干细胞自我更新以及肿瘤发生等[8-12]。随着研究的深入,人们对miRNA调控骨骼肌发育的理解也越来越透彻,现在已经发现众多的miRNA广泛地作用于控制细胞成肌分化的相关基因,对成肌分化产生重要影响[13]。miR-1抑制HDAC4的表达,促进非洲爪蛙肌细胞分化[4];miR-27b可以抑制Pax3的表达,从而抑制小鼠胎儿细胞进入骨骼肌发育的过程[14];miR-206能够作用于多个与肌肉分化相关的基因来影响动物肌肉的发育[15-16];miR-125b能够作用于IGF-Ⅱ,抑制成肌细胞的分化[17]等。
关于牛肌肉发育的miRNA已经有一些报道[18],但大都停留在成体水平,关于胎儿骨骼肌分化相关miRNA动态变化的研究鲜有文献报道。本研究采用高通量测序技术,对牛胎儿来源的骨骼肌细胞分化始末差异表达miRNA进行筛查与鉴定,挖掘与牛胎儿期肌肉发育相关的miRNA,同时,采用荧光定量PCR技术验证测序结果的可靠性,为后续研究牛胎儿骨骼肌发育提供试验依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 成肌细胞试验细胞来源于3头4月龄的牛胎儿背最长肌组织。试验动物相关操作符合实验动物管理条例(国家科学技术委员会,2017第3次修订),母牛屠宰后取出子宫,迅速带回中国农业科学院北京畜牧兽医研究所分子生物学实验室,用于分离培养成肌细胞。
1.1.2 主要试剂和仪器Ⅳ型胶原酶购自Sigma公司;低糖DMEM、胎牛血清、马血清、青链霉素双抗和胰酶购自Gibco公司;TRIzol Reagent购自Invitrogen公司;miRcute miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit和miRcute Plus miRNA qPCR Detection Kit购自天根生化科技(北京)有限公司。荧光定量PCR仪为ABI Q7。
1.2 试验方法 1.2.1 细胞分离和培养用75%的乙醇对子宫进行消毒处理,用手术剪剪开子宫取出牛胎儿。用手术刀剥开胎儿背部皮肤,取背最长肌组织置于PBS中。
取约200 mg肌肉组织置于1.8 mL离心管中,用眼科剪将其剪成1 mm3大小的肉糜,加入1 mg·mL-1的Ⅳ型胶原酶(溶于低糖DMEM培养基)1 mL,放入37 ℃恒温空气浴摇床中进行消化,每隔15 min取出离心管,用移液器进行吹打。消化45 min后取出离心管,先用孔径为100 μm的尼龙网筛过滤,再用孔径为40 μm的尼龙网筛过滤,得到含有单细胞的悬液,1 000 r·min-1离心5 min,弃去上清液后得到细胞沉淀,加生长培养基(10%胎牛血清+89% L-DMEM+1%青链霉素双抗)后接种于培养皿中。
原代成肌细胞融合度达到约70%时,用0.25%的胰酶消化传代,将细胞接种到细胞培养板中,每2 d更换1次培养基,在细胞融合度达到100%时,收取0 d的样品,同时将其它细胞更换为分化培养基(5%马血清+94% L-DMEM+1%青链霉素双抗),每2 d更换1次培养基,培养成肌细胞至分化终末,收取样品于-80 ℃冰箱内保存。
1.2.2 总RNA的提取、质量检测及测序文库的建立依照TRIzol试剂说明书的操作步骤来提取总RNA,用分光光度计测定总RNA的浓度和纯度。取总RNA进行电泳,检验所提取总RNA的完整性。利用Aglient 2100对样品浓度精确定量。RNA样品总量、浓度、RIN值、OD260 mm/OD280 mm都符合标准后,按照Small RNA Sample pre Kit说明书步骤构建测序文库。
1.2.3 测序数据的生物信息学分析 1.2.3.1文库上机测序和数据的预处理:用illumina MiSeq高通量测序平台对构建好的文库进行测序,然后对测序数据进行质量评估。原始数据文件经过碱基识别分析转化为原始测序序列,分别去除低质量(质量值Q≤5的碱基数占整个read的50%以上的reads)、有5'接头污染、没有3'接头序列、没有插入片段、长度小于18 nt的reads,去除poly A的reads,最终得到clean reads。
1.2.3.2序列分析和统计:统计得到clean reads在长度上的分布,将clean reads与Rfam(v10.0)数据库进行比对,统计rRNA、scRNA、snRNA、snoRNA及tRNA的比例,去除5类ncRNA(non-coding RNAs)后,再与牛基因组(Bos_Taurus_Ensembl_release-80/Bos_taurus.UMD3.1)进行比对,统计比对到基因组sRNA(small RNAs)的数量。用mirDeep2(v2.0.0.5)软件检测已知miRNA。用去除了5类ncRNA的sRNAs与miRbase(v19.0)数据库进行比对,检测已知miRNA,并统计表达量。
1.2.3.3差异表达miRNA的分析及其靶基因预测:根据得到的成熟miRNA在各个文库中的表达量,用edgeR(v3.20.1)软件进行miRNA的差异表达分析,得到成肌细胞分化始末差异表达的miRNA。依据miRNA与其靶位点的互补性、miRNA靶位点的保守性、miRNA-mRNA双链之间的热稳定性及附近序列的二级结构等原则,综合利用miRanda(v3.3a)和RNAhybrid来预测靶基因,统计差异表达miRNA的靶基因。用topGO(v2.30.0)软件对差异表达miRNA对应的靶基因进行富集分析。
1.2.4 反转录和qPCR验证为了验证测序结果的准确性,随机选取8个表达量较高的差异表达miRNA,分别检测其在成肌细胞分化始末的表达量。以U6作为内参,分别根据miRNA的序列设计荧光定量PCR的上游引物,下游引物由试剂盒提供(未列出),引物信息见表 1。引物由上海生工生物科技有限公司合成。
按照miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒(KR201)说明书进行逆转录,合成miRNA对应的cDNA第一链。荧光定量PCR按照miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒(FP411)说明书进行。反应体系为20 μL:2×miRcute增强型miRNA定量预混试剂(含SYBR和ROX)10 μL,反向引物(10 μmol·L-1)0.4 μL,正向引物(10 μL)0.4 μL,cDNA 2 μL,无核酶ddH2O补至20 μL。PCR反应条件:95 ℃预变性15 min;94 ℃变性20 s,60 ℃退火延伸34 s,共40个循环。
1.2.5 数据统计用SPSS 19.0软件的t检验对数据进行显著性分析,试验数据用“平均值±标准误”表示,P<0.01表示差异极显著,P<0.05表示差异显著。
2 结果 2.1 牛胎儿骨骼成肌细胞培养及总RNA提取用胶原酶消化法从4月龄的牛胎儿骨骼肌中分离成肌细胞,可以看到单个细胞呈纤维状,形态比较一致,将细胞接种于培养皿中,约2 d后细胞融合度达到70%,传代至六孔细胞培养板中,每孔接种细胞约为1×105个,待细胞长满后(图 1A)更换诱导培养基进行诱导分化,5 d后(图 1B)可以看到,大量细胞融合形成长条状的肌管,肌管受到冷刺激时,可以进行有节律的舒缩运动,表明肌管成熟,成肌细胞分化至终末阶段。
提取总RNA,分光光度计检测显示,总RNA OD260 mm/OD280 mm>1.8,OD260 mm/OD230 mm>2.0,电泳结果显示总RNA完整性良好(图略),无明显降解。
2.2 测序结果及数据处理 2.2.1 高通量测序数据将得到的数据进行过滤,去除污染和低质量序列后,得到序列的基本信息见表 2。统计6个sRNA文库中的所有序列长度分布,大部分序列集中分布在21~24 nt,形成主峰。其中,长度为22 nt的序列频率最高,其次为23 nt的序列(图 2)。
Clean reads与Rfam数据库进行比对,将比对到数据库中的sRNA进行注释,结果见图 3。miRNA所占的比例分别为37.39%和42.41%。
将过滤后的reads与牛的参考基因组比对,6个文库的比对结果见表 3。其中,比对到基因组的序列比例都在70%以上,比对到基因组的sRNA种数都高于55%。
再将过滤后的reads与miRbase数据库比对,用mirDeep2软件进行统计,检测到成熟miRNA共619个。
2.3 牛胎儿成肌细胞分化始末差异表达miRNA的分析统计在不同样本间成熟miRNA的表达情况,用edgeR软件进行成肌细胞分化始末差异表达miRNA的分析,设定阈值P-value为0.05,Fold-change为2,得到差异表达的miRNA共150个,表达量最高的20个见表 4。
热图结果显示,成肌细胞分化0和5 d时,miRNA分别聚类到两个不同的类群,表明成肌细胞分化始末表达的miRNA有显著的差别(图 4)。
综合利用miRanda和RNAhybrid两款软件进行差异表达miRNA的靶基因预测,150个差异表达miRNAs共预测到8 821个靶基因。
GO分析结果表明,差异表达miRNA的靶基因在生物学过程中主要参与了机体代谢和细胞代谢过程,占到靶基因总数的63.5%,其次是参与调控细胞生物学质量、细胞增殖分化和RNA转录等;在分子功能上,靶基因主要作用于蛋白质结合、酶催化和阴离子结合等;在细胞组成中,靶基因产物主要集中位于细胞内部,分别位于细胞质、细胞器膜和细胞核等(图 5)。KEGG通路分析结果表明,差异表达miRNA的靶基因主要集中在MAPK信号通路、钙离子信号通路、TNF信号通路、HIF-1信号通路、缝隙连接和TRP通道介导的炎症调节过程等(图 6)。
随机选取8个差异表达的miRNAs,进行荧光定量PCR验证,测序和荧光定量PCR得到的相对表达量如图 7所示。可以看到,两种结果显示,miRNA的变化趋势完全一致,其中bta-miR-148a、bta-miR-143、bta-miR-1、bta-miR-34a、bta-miR-26a、bta-miR-199a-5p在分化5天的表达水平显著升高,bta-miR-7、bta-miR-27a-5p在分化5天的表达水平显著降低。熔解曲线都为单峰,引物特异性良好。
当前,二代测序技术已经非常成熟,其通量高和信息量大的特点使其被广泛应用于畜禽基因组学研究中[19]。本研究利用illumina测序平台,对牛胎儿骨骼肌来源的成肌细胞miRNA进行高通量测序,鉴定已知miRNA 619个,分化始末差异表达miRNA共150个。对于高通量测序结果随机选取8个表达量相对较高的差异表达miRNAs,用加Poly A尾的方法合成cDNA,并用荧光定量PCR技术来检测miRNA的表达量,检测结果与测序结果完全一致,表明了测序结果具有较高的准确性和可靠性。这些结果将为后续研究miRNA和成肌细胞分化的工作提供试验依据。
miRNA是表观遗传学研究的重要内容之一,其通过作用于mRNA来抑制靶基因的表达[19-20]。胎儿肌肉的发育对肉牛出生后的表型会产生极为重要的影响,然而目前人们对miRNA在牛胎儿骨骼肌发育过程中的角色并不完全清楚[21]。通过对牛胎儿成肌细胞体外培养分化过程中差异表达miRNA的鉴定,能够更好的理解骨骼肌发育的机制。
miRNA广泛存在于各个物种,并且具有一定的保守性,这为验证试验得到的miRNA提供了一定的参考[22]。在鉴别出的差异表达miRNA中,有一些已经在牛或其它物种肌肉的相关研究中有过报道。miR-199a-5p可以通过靶向作用于WNT2,调节平滑肌细胞的增殖和分化,在平滑肌肥大和器官重塑上有潜在的应用价值[23]。Zuo等[24]对猪肌肉miRNA表达谱分析后发现,miR-143通过HDAC4-MEF2通路调控MYH7的表达,进而影响肌纤维的类型,miR-1可以影响肌球蛋白的含量、肌纤维的类型和肌肉性能。miR-26a在C2C12细胞系、小鼠和人的原代骨骼肌细胞成肌分化过程中表达量都呈上升趋势,这与本研究结果一致[25]。miR-26a通过作用于转录因子Smad1和Smad4,调控TGF-β/BMP信号通路,促进肌细胞分化,给乳鼠注射miR-26a的特异性拮抗物,能够抑制乳鼠骨骼肌的分化[25]。miR-148a在C2C12细胞分化过程中表达上升,其靶向作用于ROCK1基因从而促进肌原细胞分化[26]。在正常细胞内过表达miR-148a可以促进肌原细胞的分化,同时使细胞周期停滞。用干扰剂抑制miR-148a的表达时,C2C12分化被抑制,MHC和MyoG表达量显著下降[26]。
KEGG通路分析表明,本研究筛选的差异表达miRNA的靶基因富集到了多个与肌肉发育相关的通路。如p38 MAPK信号通路是参与骨骼肌发育的重要调控通路。MAPK能够激活转录因子MyoD基因和MEF2家族成员的表达,促进成肌分化[27]。钙离子信号通路对骨骼肌的生成、稳态维持和再生至关重要,钙离子有可能对肌卫星细胞产生直接作用,控制其处于静止状态或是增殖分化成为不同功能的肌肉[28]。细胞炎性因子TNF-α能够通过作用于p38 MAPK抑制骨骼肌的分化[29]。用TNF-α处理人成肌细胞,细胞miRNA的表达受到了影响,进而影响到多个细胞进程,最终对肌管形成产生抑制作用[30]。IGF-1/Akt信号通路在骨骼肌生长过程中发挥着核心作用,能够促进蛋白质合成、增加肌肉量[31]。美国康乃狄克州的研究人员发现,瞬时电位通道(TRP channels)的增多促进了心肌的纤维化,钙离子通透型的瞬时电位通道可能成为治疗心肌纤维化的新靶点[32]。瞬时电位通道可能与心肌肥大和心律失常相关[33]。将C2C12细胞培养在极低频率磁场中,细胞的间隙连接增加,C2C12融合和分化的速度加快,可能为肌肉功能紊乱找到新的治疗方法[34]。
基于上述已有研究,可以看到测序结果中的部分miRNA对成肌细胞分化的影响已经被印证,但是肌肉发育是一个复杂的过程,涉及到非常复杂的基因表达调控网络的变化,所以miRNA在其中的作用机制还有很多待挖掘的地方。并且,miRNA在物种之间存在一定的差异,牛的物种特异性的调控机制也有待进一步研究。因此,本试验结果将为以后的相关研究提供重要的参考。
4 结论本研究通过高通量测序和生物信息学分析,鉴定出了150个在牛胎儿骨骼肌来源的成肌细胞分化过程中差异表达的miRNAs,这些miRNAs有可能参与了牛胎儿期骨骼肌的分化。靶基因预测和功能分析表明,差异表达miRNA可能在动物肌肉发育相关的细胞信号通路中起作用,为进一步研究miRNA调控家畜骨骼肌发育奠定理论基础。
[1] | LEE E A, KIM J M, LIM K S, et al. Effects of variation in porcine MYOD1 gene on muscle fiber characteristics, lean meat production, and meat quality traits[J]. Meat Sci, 2012, 92(1): 36–43. DOI: 10.1016/j.meatsci.2012.03.018 |
[2] | KARUNARATNE J F, ASHTON C J, STICKLAND N C. Fetal programming of fat and collagen in porcine skeletal muscles[J]. J Anat, 2005, 207(6): 763–768. DOI: 10.1111/JOA.2005.207.issue-6 |
[3] | BUCKINGHAM M, RIGBY P W J. Gene regulatory networks and transcriptional mechanisms that control myogenesis[J]. Dev Cell, 2014, 28(3): 225–238. DOI: 10.1016/j.devcel.2013.12.020 |
[4] | CHEN J F, MANDEL E M, THOMSON J M, et al. The role of microRNA-1 and microRNA-133 in skeletal muscle proliferation and differentiation[J]. Nat Genet, 2006, 38(2): 228–233. DOI: 10.1038/ng1725 |
[5] | BARTEL D P. microRNAs:genomics, biogenesis, mechanism, and function[J]. Cell, 2004, 116(2): 281–297. DOI: 10.1016/S0092-8674(04)00045-5 |
[6] | CARTHEW R W, SONTHEIMER E J. Origins and mechanisms of miRNAs and siRNAs[J]. Cell, 2009, 136(4): 642–655. DOI: 10.1016/j.cell.2009.01.035 |
[7] | DALMAY T. Mechanism of miRNA-mediated repression of mRNA translation[J]. Essays Biochem, 2013, 54: 29–38. DOI: 10.1042/bse0540029 |
[8] | ZHOU H B, XIAO J, WU N, et al. microRNA-223 Regulates the differentiation and function of intestinal dendritic cells and macrophages by targeting C/EBPβ[J]. Cell Rep, 2015, 13(6): 1149–1160. DOI: 10.1016/j.celrep.2015.09.073 |
[9] | ALVAREZ-GARCIA I, MISKA E A. microRNA functions in animal development and human disease[J]. Development, 2005, 132(21): 4653–4662. DOI: 10.1242/dev.02073 |
[10] | PARK J K, LIU X, STRAUSS T J, et al. The miRNA pathway intrinsically controls self-renewal of Drosophila germline stem cells[J]. Curr Biol, 2007, 17(6): 533–538. DOI: 10.1016/j.cub.2007.01.060 |
[11] | GOEDEKE L, WAGSCHAL A, FERNÁNDEZ-HERNANDO C, et al. miRNA regulation of LDL-cholesterol metabolism[J]. Biochim Biophys Acta, 2016, 1861(12): 2047–2052. DOI: 10.1016/j.bbalip.2016.03.007 |
[12] | PIPAN V, ZORC M, KUNEJ T. microRNA polymorphisms in cancer:a literature analysis[J]. Cancers (Basel), 2015, 7(3): 1806–1814. DOI: 10.3390/cancers7030863 |
[13] | GE Y J, CHEN J. microRNAs in skeletal myogenesis[J]. Cell Cycle, 2011, 10(3): 441–448. DOI: 10.4161/cc.10.3.14710 |
[14] | CRIST C G, MONTARRAS D, PALLAFACCHINA G, et al. Muscle stem cell behavior is modified by microRNA-27 regulation of Pax3 expression[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2009, 106(32): 13383–13387. DOI: 10.1073/pnas.0900210106 |
[15] | GAMBARDELLA S, RINALDI F, LEPORE S M, et al. Overexpression of microRNA-206 in the skeletal muscle from myotonic dystrophy type 1 patients[J]. J Transl Med, 2010, 8: 48. DOI: 10.1186/1479-5876-8-48 |
[16] | MCCARTHY J J. microRNA-206:the skeletal muscle-specific myomiR[J]. Biochim Biophys Acta, 2008, 1779(11): 682–691. DOI: 10.1016/j.bbagrm.2008.03.001 |
[17] | GE Y J, SUN Y T, CHEN J. IGF-Ⅱ is regulated by microRNA-125b in skeletal myogenesis[J]. J Cell Biol, 2011, 192(1): 69–81. DOI: 10.1083/jcb.201007165 |
[18] | SUN J J, LI M J, LI Z J., et al. Identification and profiling of conserved and novel microRNAs from Chinese Qinchuan bovine longissimus thoracis[J]. BMC Genomics, 2013, 14: 42. DOI: 10.1186/1471-2164-14-42 |
[19] | MOTAMENY S, WOLTERS S, NÜRNBERG P, et al. Next generation sequencing of miRNAs-strategies, resources and methods[J]. Genes (Basel), 2010, 1(1): 70–84. DOI: 10.3390/genes1010070 |
[20] | DE NIGRIS F. Epigenetic regulators:polycomb-miRNA circuits in cancer[J]. Biochim Biophys Acta, 2016, 1859(5): 697–704. DOI: 10.1016/j.bbagrm.2016.03.005 |
[21] | MIRETTI S, MARTIGNANI E, TAULLI R, et al. Differential expression of microRNA-206 in skeletal muscle of female Piedmontese and Friesian cattle[J]. Vet J, 2011, 190(3): 412–413. DOI: 10.1016/j.tvjl.2010.12.012 |
[22] |
罗艳, 张群, 梁宇君, 等. 动物中microRNA的保守性和进化历程[J]. 中国科学:生命科学, 2012, 42(2): 96–106.
LUO Y, ZHANG Q, LIANG Y J, et al. Conservation and evolution of microRNAs in animals[J]. Scientia Sinica Vitae, 2012, 42(2): 96–106. (in Chinese) |
[23] | HASHEMI GHEINANI A, BURKHARD F C, REHRAUER H, et al. microRNA MiR-199a-5p regulates smooth muscle cell proliferation and morphology by targeting WNT2 signaling pathway[J]. J Biol Chem, 2015, 290(11): 7067–7086. DOI: 10.1074/jbc.M114.618694 |
[24] | ZUO J J, WU F, LIU Y H, et al. microRNA transcriptome profile analysis in porcine muscle and the effect of miR-143 on the MYH7 gene and protein[J]. PLoS One, 2015, 10(4): e0124873. DOI: 10.1371/journal.pone.0124873 |
[25] | DEY B K, GAGAN J, YAN Z, et al. miR-26a is required for skeletal muscle differentiation and regeneration in mice[J]. Genes Dev, 2012, 26(19): 2180–2191. DOI: 10.1101/gad.198085.112 |
[26] | ZHANG J, YING Z Z, TANG Z L, et al. microRNA-148a promotes myogenic differentiation by targeting the ROCK1 gene[J]. J Biol Chem, 2012, 287(25): 21093–21101. DOI: 10.1074/jbc.M111.330381 |
[27] | KEREN A, TAMIR Y, BENGAL E. The p38 MAPK signaling pathway:a major regulator of skeletal muscle development[J]. Mol Cell Endocrinol, 2006, 252(1-2): 224–230. DOI: 10.1016/j.mce.2006.03.017 |
[28] | TU M K, LEVIN J B, HAMILTON A M, et al. Calcium signaling in skeletal muscle development, maintenance and regeneration[J]. Cell Calcium, 2016, 59(2-3): 91–97. DOI: 10.1016/j.ceca.2016.02.005 |
[29] | CHEN S E, JIN B W, LI Y P. TNF-α regulates myogenesis and muscle regeneration by activating p38 MAPK[J]. Am J Physiol Cell Physiol, 2007, 292(5): C1660–C1671. DOI: 10.1152/ajpcell.00486.2006 |
[30] | MEYER S U, THIRION C, POLESSKAYA A, et al. TNF-α and IGF1 modify the microRNA signature in skeletal muscle cell differentiation[J]. Cell Commun Signal, 2015, 13: 4. DOI: 10.1186/s12964-015-0083-0 |
[31] | HITACHI K, TSUCHIDA K. Role of microRNAs in skeletal muscle hypertrophy[J]. Front Physiol, 2014, 4: 408. |
[32] | YUE Z C, ZHANG Y H, XIE J, et al. Transient receptor potential (TRP) channels and cardiac fibrosis[J]. Curr Top Med Chem, 2013, 13(3): 270–282. DOI: 10.2174/1568026611313030005 |
[33] | WATANABE H, ⅡNO K, OHBA T, et al. Possible involvement of TRP channels in cardiac hypertrophy and arrhythmia[J]. Curr Top Med Chem, 2013, 13(3): 283–294. DOI: 10.2174/1568026611313030006 |
[34] | MORABITO C, STEIMBERG N, ROVETTA F, et al. Extremely low-frequency electromagnetic fields affect myogenic processes in C2C12 myoblasts:role of gap-junction-mediated intercellular communication[J]. Biomed Res Int, 2017, 2017: 2460215. |