马腺疫(Strangles)是由马链球菌马亚种(Streptococcus equi subsp.equi,S.equi)引起的马属动物表现发热、上呼吸道卡他、下颌淋巴结和咽后淋巴结脓肿的传染病[1-2],该病仍危害着世界养马业的发展,造成严重经济损失。灭活和弱毒马腺疫疫苗的免疫效果均不理想[3-4],不能有效防止该病的发生,且有较多的副反应,SeM (Streptococcus equi subsp.equi M-like protein)为该菌重要的毒力因子和免疫原,该蛋白质还可参与该菌的免疫逃避[5],目前认为以SeM蛋白为抗原制成的疫苗免疫马匹效果不理想,产生的抗体持续时间较短,需进行多次免疫[6],国外使用的7种蛋白质组分的亚单位疫苗虽然安全有效,但成本高,有必要研发更加安全、经济、有效的新型马腺疫疫苗。研究表明,仅有抗体参与的免疫在其抗感染过程中是不够的,还需要黏膜免疫及先天性免疫的参与。当前被广泛使用的铝胶佐剂虽能引起强烈的体液反应,但是却不能触发细胞免疫应答和黏膜免疫应答。
研究表明,鞭毛蛋白不仅具有较强的免疫原性[7-10],还具有良好且独特的免疫增强特性,不但可以启动和促进针对外源抗原的细胞免疫和黏膜免疫[11-12],还可通过与多种细胞表面的TLR5结合上调细胞因子的表达,有效诱导宿主获得性免疫应答[13],该特点使得鞭毛蛋白在改善SeM的免疫效果方面具有良好的利用和开发潜力。
虽然有关鞭毛蛋白的免疫增强作用已在多种疫苗中得到了证实,如FMDV[14]、NDV[15]、AIV[16]、金黄色葡萄球菌[17]等,但报道的鞭毛蛋白多是有关鼠伤寒沙门菌的,有关马流产沙门菌鞭毛蛋白的研究及其对马腺疫SeM蛋白免疫效果的影响也未见报道。本研究表达纯化了马流产沙门菌的FliC蛋白,将纯化的FliC蛋白与本室以往构建表达的马腺疫链球菌的SeM蛋白[18]联合免疫小鼠,检验该鞭毛蛋白FliC对SeM的免疫效果的影响,以期为新型马腺疫疫苗的研发奠定基础。
1 材料与方法 1.1 材料18~22 g雌性6~7周龄C57BL/6小鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司,马链球菌马亚种分离株XZ1由新疆农业大学动物医学学院微生物实验室分离鉴定并保存。原核表达载体pGEX-4T-2及含重组质粒pET28a-FliC和pGEX-SeM的大肠杆菌BL21(DE3)均由新疆农业大学动物医学学院微生物实验室构建并保存提供。
中等分子量蛋白Marker购自大连宝生物工程有限公司;HRP-IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司;TMB及DAB显色液购自北京索莱宝科技有限公司;其他相关化学试剂均为国产分析纯。
1.2 重组蛋白质的表达及纯化将表达载体pGEX-4T-2和含重组质粒pET-28a-FliC、pGEX-SeM的大肠杆菌BL21(DE3)[18-19],在37 ℃ 200 r·min-1振荡培养至OD600 nm达到0.4,加入终浓度为1 mmol·L-1 IPTG诱导表达4 h。收集菌体,经超声破碎后,用15% SDS-PAGE电泳,利用亲和柱层析法对收集的上清液进行纯化。
1.3 重组蛋白质的Western blot鉴定将纯化后的重组蛋白质FliC经SDS-PAGE电泳后,湿法电转移至硝酸纤维素膜上(300 mA,1 h),于5%的脱脂奶粉中4 ℃封闭过夜,以马流产沙门菌阳性血清为一抗(1:3 000),37 ℃孵育1 h,洗膜后以HRP标记的兔抗马IgG(1:5 000)为二抗,37 ℃孵育45 min,洗涤3次后,DAB显色。重组蛋白SeM的Western blot鉴定方法见文献[18]。
1.4 小鼠免疫试验将纯化的重组蛋白SeM、FliC和GST标签蛋白按1:1与弗氏佐剂乳化。SPF级18~22 g的雌性C57BL/6小鼠55只随机分为5组,每组11只。分别设PBS对照组、GST对照组、重组蛋白FliC和SeM联合免疫组、SeM免疫组、重组蛋白FliC免疫组,乳化后的抗原经皮下多点注射小鼠,免疫剂量均为50 μg·只-1,2周后免疫第二次,共免疫2次。第一次免疫后14 d及第二次免疫后21 d对免疫小鼠进行尾静脉采血,收集血清于-20 ℃保存。
采用间接ELISA法[20]测定重组蛋白质免疫前、一免及二免后的抗体水平。用100 μL的重组蛋白FliC、SeM和FliC+SeM分别作包被抗原,100 ng·孔-1 4 ℃过夜包被,次日PBST洗涤5次后37 ℃封闭2 h,加入1:300倍稀释的待检血清,37 ℃孵育1 h,PBST洗涤5次后加入100 μL 1:6 000稀释的HRP标记山羊抗小鼠IgG作为二抗,37 ℃孵育45 min,PBST洗涤5次后,TMB溶液显色15 min,测OD450 nm值。将二免后的血清做3倍梯度稀释,37 ℃封闭2 h后PBST洗5遍,加入100 μL梯度稀释待检血清为一抗,37 ℃孵育1 h,PBST洗涤5次加入1:6 000稀释的HRP标记山羊抗小鼠IgG 100 μL作为二抗,37 ℃孵育45 min,PBST洗涤5次,加入TMB显色15 min,测OD450 nm值。
用100 μL重组蛋白FliC、SeM和FliC+SeM(100 ng·孔-1)分别4 ℃过夜包被ELISA板,封闭1 h,加入100 μL 1:300的待检血清,PBST洗涤5次后以1:5 000稀释的HRP标记山羊抗小鼠IgG1、IgG2a分别作为二抗,37 ℃孵育1 h,PBST洗涤5次后TMB显色15 min,测OD450 nm值。
挑取马链球菌马亚种XZ1株单菌落接种于TH培养基中37 ℃培养,在二次免疫后30 d进行攻毒,攻毒途径均为腹腔注射,攻毒剂量为4×108CFU·mL-1,攻毒后72 h内连续观察小鼠精神状态及饮食欲并记录小鼠死亡情况。
1.5 统计学分析数据采用SPSS 19.0软件进行统计分析,采用单因素方差分析one-way ANOVA q检验进行差异性比较,以P < 0.05表示差异显著,用不同小写字母表示;以P < 0.01表示差异极显著,用不同大写字母表示。
2 结果 2.1 重组蛋白质的表达及纯化重组蛋白质经SDS-PAGE电泳分析显示,SeM蛋白可在预期66 ku附近出现一条明显的目的蛋白质条带(图 1a),FliC蛋白可在预期的52 ku处出现一条明显的目的蛋白质条带(图 1b),GST标签蛋白可在预期的26 ku处出现一条明显的蛋白质条带,表明得到了较高纯度的重组蛋白SeM和FliC和GST标签蛋白。
Western blot结果鉴定,纯化的重组蛋白FliC能与马流产沙门菌阳性血清发生特异性结合,在52 ku处出现明显特异性条带,表明该重组蛋白表达成功且具有良好的反应原性(图 2)。
间接ELISA检测结果显示,各免疫组在免疫后抗体水平与对照组相比均有明显升高,随着免疫时间推移,抗体水平持续上升(图 3)。分别以FliC+SeM、FliC及SeM作为包被抗原检测时,FliC+SeM联合免疫组在免疫后14和35 d的抗体水平均极显著高于SeM单独免疫组及对照组(图 3)。
分别以FliC+SeM、FliC及SeM为包被抗原对免疫小鼠血清中IgG亚型检测,结果显示以IgG1抗体为主的免疫应答,且FliC+SeM联合免疫组的IgG1抗体水平极显著高于SeM单独免疫组(图 4)。
第二次免疫后30 d以马链球菌马亚种新疆株XZ1进行攻击,PBS及GST对照组全部死亡,FliC+SeM免疫组的保护率为87%,SeM免疫组的保护率67%,FliC免疫组保护率为20%,该结果表明FliC与SeM联合免疫时,免疫保护效果优于SeM单独免疫组及对照组(图 5)。
马腺疫传播迅速,在世界范围内发病比较普遍。随着新疆马产业的快速发展,马腺疫疾病的发病率和死亡率不断升高。该病不仅严重影响了马驹的正常发育,且已成为马驹死亡的主要原因[21]。对该病的预防控制主要是使用疫苗,目前常规疫苗存在一定隐患,如毒力返强和灭活不彻底带来的危害等。目前除了常规疫苗外,亚单位疫苗是被接受的一个有效的免疫预防手段。
SeM在马腺疫链球菌的致病和免疫逃避中意义较大[5],尽管其是该菌的保护性抗原,目前发现其纯化蛋白诱导免疫保护的能力还有待改善。鞭毛蛋白作为一种蛋白佐剂有其独特的优势,J. S. Eom等[22]通过构建重组减毒鼠伤寒沙门菌,证明鞭毛蛋白可有效地刺激该菌产生特异性IgG抗体。包琦锋等[23]将人乳头瘤病毒(HPV)抗原基因插入到鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白FliC的超变区域,对其进行表达及纯化。J. W. Huleatt等[24]以卵清蛋白(OVA)为抗原,鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白FliC为佐剂将二者联合免疫小鼠,证明鞭毛蛋白组诱导的IgG抗体滴度明显高于铝佐剂组。研究还表明鞭毛蛋白与不同抗原融合后也可发挥其佐剂作用,赵达[17]和王鹤[25]表达鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白FliC与金黄色葡萄球菌及链球菌的GapC融合蛋白,免疫后的结果表明FliC增强了GapC蛋白的免疫效果。
在前期的研究中,我们已证实了SeM蛋白具有免疫原性和免疫保护效果[18],本研究在此基础上将表达的SeM蛋白与FliC蛋白以复合物的形式免疫,观察鞭毛蛋白对SeM的免疫应答的影响。二免后的抗体检测结果表明,SeM抗原中加入马流产沙门菌来源的FliC后注射小鼠,FliC+SeM所诱导的SeM特异性IgG水平高于SeM单独免疫组和对照组,表明FliC可以增加血清中SeM特异性IgG的水平,对SeM的免疫具有免疫增强反应。
TLR5配体鞭毛蛋白作为天然免疫应答的诱导剂,不仅作用的细胞范围广,其诱导的天然免疫应答还可进一步帮助机体建立针对外源抗原的获得性免疫应答。其通过活化抗原提呈细胞(APC)对抗原的加工、处理和提呈能力,可帮助小鼠产生显著而全面的免疫应答,进而可以提供强毒攻击的免疫保护。本试验中对小鼠攻击保护试验的结果也表明,FliC+SeM免疫后对小鼠的保护率为87%,明显高于SeM单独免疫的67%。
有关鞭毛蛋白诱导何种类型的免疫,不同的研究显示不同的结果。有研究表明,可溶性的鞭毛蛋白可诱导Th2型细胞介导的抗体应答,活的沙门菌表面的表面蛋白会诱导Th1型的细胞应答[25],其中IgG1亚型与Th2型的体液免疫应答有关。本研究的结果显示,FliC重组蛋白与SeM蛋白联合免疫后可以诱导小鼠产生较高水平的IgG1抗体。该结果表明FliC+SeM诱导了Th2型的体液免疫应答,FliC有增强SeM体液免疫效应的作用。这与严明等[26]用鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白与肺炎链球菌DnaJ蛋白联合免疫后抗体分型检测得出抗体亚型以IgG1为主的结果是一致的。陈志华[14]将细菌的鞭毛蛋白与口蹄疫疫苗皮下联合免疫小鼠,证明FliC对IgG1(Th2型)和IgG2a(Th1型)都有促进作用,我们分析认为这种免疫类型上的差异可能与所用的抗原类型和免疫途径不同有关。
不同病原菌的鞭毛蛋白的佐剂效应存在差异,鉴于文献报道均是以鼠伤寒沙门菌来源的鞭毛蛋白入手研究鞭毛蛋白的免疫增强效应,本研究原核表达了马流产沙门菌来源的鞭毛蛋白FliC,并对表达蛋白对马腺疫链球菌SeM蛋白免疫效果的影响作了初步探索。FliC能够提高免疫小鼠血清中SeM特异性IgG及IgG1的水平,下一步将进一步探讨该蛋白质通过不同免疫途径和免疫策略免疫马匹后对马腺疫强毒攻击的免疫保护力,以期为马腺疫的免疫预防提供新的思路与方法。
4 结论成功表达、纯化了马流产沙门菌来源的FliC重组蛋白。以该重组蛋白质与马腺疫链球菌SeM蛋白联合免疫C57BL/6小鼠产生的抗体水平高于SeM蛋白单独免疫组,且主要以IgG1抗体为主。第二次免疫30 d后攻毒,FliC+SeM免疫组的保护率为87%,高于SeM免疫组的保护率67%。FliC蛋白能够增强SeM蛋白的免疫保护效果。
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