中国作为世界最大养兔出产国之一，26个省(自治区、直辖市)家兔总出栏量5亿2 000万只，总存栏量2亿2 400万只(2015年兔产业体系数据统计)[1]；饲养的家兔种类包括肉兔、獭兔和毛兔，其中肉兔和獭兔存栏量和出栏量分别占全国的91.58%和99.80%[2]；2015年我国兔肉产量87.4万t[1]，兔皮约1.1亿多张，兔毛产量约2万t[3]，兔皮、兔毛和兔肉总产量和出口量多年稳居世界第一。由此可见，养兔业在我国畜牧业经济中占有举足轻重的地位。
痒螨病是家兔养殖中常见的外寄生虫病之一，据报道我国家兔感染率可达70.0%[4]。该病是由绵羊痒螨兔亚种(Psoroptes ovis var. cuniculi，又名兔痒螨)寄生于家兔的外耳道皮肤表面所引起，表现出瘙痒，挠耳，外耳道内卷纸样结痂为主要临床症状，造成家兔体重减轻、饲料转化率下降、免疫功能降低，严重者出现死亡，给养兔业造成巨大的经济损失[5-7]。物种的遗传多样性可受环境和地理隔离等因素影响而出现变异，这点已在日本血吸虫[8]、捻转血矛线虫[9]、湖北钉螺[10]等物种中被证实。我国家兔饲养区域范围广泛、饲养品种较多，家兔品种和饲养区域的地理隔离是否会对家兔体表寄生的痒螨产生遗传变异？相关研究目前仍十分缺乏。线粒体DNA (mitochondrial DNA，mtDNA)具备母系遗传和高突变等特征，常作为研究物种进化的遗传标记[11-13]。我们课题组前期基于线粒体的编码蛋白基因Cytb基因对我国绵羊痒螨兔亚种的遗传变异进行了分析[14]，但因基因间存在不平衡的进化关系，仅选用一个线粒体基因进行遗传变异分析并不能准确地反映种群间的进化[15]。因此，本研究中我们选取了线粒体基因中非编码蛋白基因——16S rRNA基因再次分析我国家兔主要养殖区域的肉兔和獭兔体表寄生的绵羊痒螨兔亚种的遗传多样性特征，以期得到更为准确的我国绵羊痒螨兔亚种种群遗传多样性信息，从而为养兔业中痒螨病的防控提供基础资料。
1 材料与方法 1.1 实验材料从我国5个地理区域(华北、华东、华中、西北和西南)采集自然感染痒螨的肉兔和獭兔的外耳道结痂，从结痂中分离螨虫经形态学鉴定为绵羊痒螨兔亚种[16]，于-20 ℃保存备用。其中分离自獭兔的痒螨样品25个，分离自肉兔的痒螨样品58个，共计83个样品(表 1)。
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表 1 基于16S rRNA分析我国5个地理区域绵羊痒螨兔亚种种群的遗传多样性指数 Table 1 Indexes of genetic diversity of Psoroptes ovis var. cuniculi populations from five regions in China, based on 16S rRNA |
将“1.1”中采集的各地痒螨样品随机挑选单个痒螨进行无菌研磨后，按照OMEGA公司的节肢动物DNA提取试剂盒(DNA Mollusc Kit)的说明书提取单个螨虫的基因组DNA，提取的DNA保存于-20 ℃备用。根据GenBank上已发表的绵羊痒螨线粒体基因组序列(登录号：KJ957822)[12]设计特异性引物，扩增16S rRNA基因全序列。上游引物F-5′-AGGTATCGGAAGGTGCCTCT-3′；下游引物：R-5′-TCCCCTACCCCTAAAAGCTCA-3′。PCR扩增体系为25 μL：4 μL模板DNA，上、下引物各1 μL，6.5 μL ddH2O，12.5 μL 2 ×Taq PCR Master Mix。PCR反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min。阴性对照模板使用无菌双蒸水。PCR反应结束后，取5 μL PCR扩增产物进行1%的琼脂凝胶电泳检测目的片段的大小，随后将PCR阳性产物送至生物工程(上海)股份有限公司进行正反双向测序，以保证测序结果的准确性。
1.3 数据处理及分析将测序结果按照峰图人工核对，运用BLASTn和DNAMAN 6.0.3软件对序列进行比对、拼接、剪切，构成对应的16S rRNA全序列文件。运用MEGA 5.0软件对比核苷酸序列以及对碱基百分比和种群间遗传距离进行分析；采用DnaSP 5.0软件对变异位点数、单倍型数、遗传分化系数(Fst)、核苷酸多样性(Pi)和单倍型多样性(Hd)进行统计，并计算基因流Nm=1/4(1/Fst-1)；采用Arlequin 3.1软件分析种群间的遗传差异(Fst)和分子变异(AMOVA)以了解不同地区的遗传结构，并对各种群进行中性检验(Tajima’s D和Fu’s Fs)；构建单倍型网络分布图和采用NJ法构建系统发育树，并用bootstraps(重复1 000次)检验聚类树的置信度。
2 结果 2.1 核苷酸序列分析成功获得83个绵羊痒螨兔亚种样品的16S rRNA全序列，经分析获得的83条16S rRNA序列，全长均为1 025 bp(GenBank No.:MH 304762~MH 304844)。DnaSP 5.0软件分析显示83条基因序列中共有83个变异位点，其中包括68个单变异位点(81.93%)和15个简约性位点(18.07%)，无碱基缺失和插入，其中转换突变的数量大于颠换突变数量。
2.2 单倍型分布83条序列共存在52个单倍型(H1~H52)，其中H2、H4、H9、H16、H32为共享单倍型；H4单倍型共享频率最高。单倍型H2由华北地区的2个样本(HB2与HB4)与西南地区的9个样本所共享(XN2、XN8、XN12、XN31、XN33~35、XN42、XN43)；单倍型H4由华北地区(HB5)、华中地区(HZ1)、西北地区(XB1、XB6、XB7)、西南地区(XN10、XN43、XN44、XN45、XN46、XN47、XN48)共享；单倍型H9由华东地区(HD2、HD3、HD8)、西南地区(XN20、XN23、XN25、XN26)共享；单倍型H16由华中地区(HZ4、HZ6、HZ8、HZ9)、西南地区(XN19)共享；单倍型H32由XN21、XN22共享；其余的均是各种群地区特有的单倍型(表 1)。
2.3 单倍型多样性及核苷酸多样性5个地理种群的单倍型多样性(Hd)为0.857 14(西北地区)~0.964 29(华北地区)，我国整体种群的单倍型多样性(Hd)较高(0.958 27)，表明我国整体种群及各地种群的绵羊痒螨种群单倍型多样性(Hd)较为丰富(表 1)。我国整体种群的平均核苷酸多样性(Pi)为0.006 86，而5个地理种群中，以华中地区的核苷酸多样性(Pi)最低(0.001 71)，华东地区的核苷酸多样性(Pi)最高(0.006 76)，表明我国这5个区域的核苷酸多样性(Pi)较高；5个地理种群核苷酸差异指数(K)的范围在1.755 56(华中地区)~6.928 57(华东地区)(表 1)。
2.4 遗传距离、中性检验值和遗传分化指数5个地理种群中，除华北地区的Tajima's D检验值为正值(0.067 96)，其余4个地理种群均为负值(-1.658 34~-0.959 56)，西北地区Tajima's D绝对值最高，华北地区Tajima's D绝对值最低，并且华中地区、西北地区、西南地区种群差异显著(P < 0.005)。除华东地区的Fu's Fs值为正外(0.183 69)，其余4个区域值均为负(-20.424 13~-0.003 85)，以西南地区绝对值最高，西北地区绝对值最低，华中地区和西南地区种群差异显著(P < 0.005)(表 1)。
华北地区与华东地区、华中地区、西北地区、西南地区的遗传距离分别为0.008、0.005、0.005、0.007，且差异显著(P < 0.005)；华东地区与华中地区、西北地区、西南地区的遗传距离分别为0.010、0.009、0.006，且差异显著(P < 0.005)；华中地区与西北地区、西南地区的遗传距离分别为0.004和0.009，且差异显著(P < 0.005)；西北地区与西南地区的遗传距离为0.008，遗传距离差异显著(P < 0.005)(表 2)。
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表 2 我国5个地理区域绵羊痒螨兔亚种种群的遗传距离 Table 2 Genetic distance of Psoroptes ovis var. cuniculi populations between five region populations in China |
5个地理种群间的Fst值(-0.037 59~0.587 63)和基因流值-6.900 7~31.117 62变化较大(表 3)，其中华中地区与华东地区的Fst值最高，并且遗传分化差异显著(P＜0.005)，这两个区域的基因流Nm为0.175 43，表明种群间存在较小的基因流；华东地区与西南地区基因流值Nm(31.117 62)最高，表明种群间基因交流频繁，导致两者间的遗传分化差异不显著(Fst值=0.007 97，P > 0.005)。
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表 3 我国绵羊痒螨兔亚种种群的基因流(Nm)(上三角)和遗传分化度(Fst)(下三角) Table 3 Gene flow (Nm) (above diagonal) and genetic diversity (Fst) (below diagonal) between Psoroptes ovis var. cuniculi populations in China |
NJ树显示(图 1)，绵羊痒螨兔亚种的52个单倍型构成2个大的分支。2大分支包含了不同的地理来源及温度带的单倍型，单倍型的分布无规律可循，尚未形成显著的地理种群结构和温度种群结构。
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HB.华北；HD.华东；HZ.华中；XB.西北；XN.西南 HB. Huabei; HD. Huadong; HZ. Huazhong; XB. Xibei; XN. Xi'nan 图 1 基于痒螨16S rRNA的52个单倍型构建的NJ树 Figure 1 NJ Tree based on52 haplotypes of 16S rRNA of Psoroptes ovis var. cuniculi |
单倍型网络图显示(图 2)，单倍型被分成两部分，各单倍型呈发散分布，相邻单倍型之间的突变从1步到5步不等，网络图中各单倍型的聚类情况与NJ树的聚类情况非常相似，同样未形成显著的地理种群结构。
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单倍型的分布频率与圆圈的大小成正比；不同颜色表示不同样品来源 The haplotype distribution frequency is proportional to the size of the circle; Different colors represent different sample sources 图 2 基于16S rRNA构建的绵羊痒螨单倍型网络图 Figure 2 A network map of Psoroptes ovis, based on 16S rRNA |
本研究首次成功地利用PCR技术扩增了我国5大区域的83株绵羊痒螨兔亚种的16S rRNA全序列，并分析了其遗传多样性和种群结构特征。我们采用的单个痒螨虫体进行DNA提取，克服了多个痒螨虫体提取DNA所带来的不准确性，避免了遗传变异的不准确性[17-19]。研究表明地理环境和宿主的改变会影响寄生虫种群遗传结构[20]，前期我们课题组基于Cytb分析亦证实我国地理环境差异较大的各地采集的绵羊痒螨间存在较高的遗传多样性，有一定的遗传分化，但未分化形成地理种群结构[14]。但基于单个基因得到的遗传变异结果并不一定能准确地反映种群间的进化关系，因此，本研究采用线粒体16S rRNA基因进一步分析我国各地绵羊痒螨的遗传多样性。
环境的改变会导致动物物种自身变异的产生，遗传变异的大小表现出其遗传多样性的高低，遗传多样性低的物种种群很难在多变的环境中生存。所以遗传多样性较高的物种比变异较低的物种更具备进化潜力和环境适应性，这更有利于种群的发展[21]。通常用单倍型多样性(Hd)和核苷酸多样性(Pi)来衡量一个物种或群体遗传多样性。本研究中83个样本共有52个单倍型，其Hd达0.958 27，表明我国这5个区域的绵羊痒螨的单倍型多样性较为丰富。然而本研究中5个区域总的核苷酸多样性为0.006 86，表现出较低的核苷酸多样性水平。这种高Hd值、低Pi值的现象反映了绵羊痒螨种群在历史中可能出现过瓶颈效应而出现种群扩张，种群快速的自身变异以致其较高单倍型多样性，但并没有积累较高的核苷酸多样性水平[22]。这种高Hd、低Pi的现象常发现于大多数具有较大的母系有效种群和较强繁殖能力的无脊椎动物中[23-24]。再者，中性检验(Tajima’D和Fu’s Fs)结果亦证明了我国绵羊痒螨群体在历史上可能出现过种群扩张现象，从而易于该种群的生存。
本次研究的5个地理区域跨越了亚热带和暖温带，同时被我国的南北分界线——秦岭-淮河所隔离以及长江、黄河等河流的阻断，这些天然的地理屏障形成了物种的地理隔离，地理的隔离可能会造成生殖隔离，因此天然的地理屏障形成了我国绵羊痒螨兔亚种种群之间的基因交流障碍。但从反映物种遗传分化强弱的基因流(Nm)和遗传分化系数(Fst)来看[25]，华东(山东)与西南(四川)种群间基因流值 > 4(Nm=31.117 62)，Fst值 < 0.05(Fst=0.007 97)，表明2个群体间基因交流充分，种群出现遗传分化可能性小[25]；而华北与华东、西南以及华中与西北种群间亦存在一定的基因交流(Nm > 1)，种群间遗传分化较大(0.15 < Fst < 0.25)；其他地区种群间(除西北与华北间)基因交流小(Nm < 1)，种群间遗传分化极大(Fst > 0.25)。华中地区与西南地区、华东地区，华北与华东地区、西南以及华北与西北地区被巫山和雪峰山、大别山、南岭、秦岭、太行山所隔离，这些天然屏障所隔离的绵羊痒螨兔亚种间却仍然存在频繁的基因交流，但痒螨虫体较小(约0.9 mm)，自身移动能力较低，因此，这些地区间的基因交流极有可能是由于各地家兔贸易所造成的，特别是山东和四川之间兔贸易频繁，因此导致两地间出现最高的基因流值(31.117 62)，目前已有许多关于宿主移动对寄生虫基因流影响的相关报道[20, 26]。研究表明，多宿主寄生虫通常较专性寄生虫具有更低的遗传分化水平与更高的基因交流水平[20, 27]，这点在我们的研究中亦得到证实，本次研究的绵羊痒螨可寄生于兔、绵羊等多种动物体表，属于多宿主寄生虫，我们研究的多个地理区域间的绵羊痒螨兔亚种存在频繁的基因交流。这种频繁的基因交流可能会导致一个地方绵羊痒螨兔亚种的伊维菌素等耐药基因传递到另一个新地方。
系统发育树(NJ树)和单倍型网络图显示我国绵羊痒螨16S rRNA单倍型构成2大分支，呈现出杂乱的分布格局，绵羊痒螨兔亚种虫株并未按照地理来源聚集，同时亦未根据宿主(獭兔还是肉兔)而进行聚集，还未根据是源自亚热带还是暖温带而聚集(图 1和图 2)，未形成显著的地理种群结构、温度带种群结构和兔品种种群结构。从遗传距离、基因流及遗传分化指数来看，处于亚热带的西南地区与处于温带的华东西区间基因流值较大，遗传分化指数较小(表 2和表 3)。因此，我国绵羊痒螨种群间的基因交流与地理、兔品种和温度带无关。
4 结论本研究首次成功地利用PCR技术扩增了我国5大区域的83株单个绵羊痒螨兔亚种的线粒体16S rRNA全序列，分析了5个地理区域绵羊痒螨兔亚种的遗传多样性和种群结构特征。发现我国绵羊痒螨兔亚种的遗传多样性较高，遗传分化不明显，尚未形成地理种群结构。
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