2. 江苏省农业科学院畜牧研究所, 南京 210014;
3. 新疆农业大学动物科学学院, 乌鲁木齐 830052
, LI Yin-xia2, YAO Yi-long1, PAN Zeng-xiang1, JUE Ken3, YI Ming3, CAO Shao-xian2, LI Qi-fa1
2. Institute of Animal Science, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China;
3. College of Animal Science, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052, China
促卵泡素受体(Follicle stimulating hormone receptor，FSHR)是雌性哺乳动物卵巢颗粒细胞膜上一种重要的受体蛋白，其编码基因是影响哺乳动物多胎性状的主效基因，调控卵巢颗粒细胞状态(增殖和凋亡)、卵泡发育和排卵[1-2]。促卵泡素(Follicle stimulating hormone，FSH)信号转导必须通过与卵巢颗粒细胞膜上的受体FSHR结合才能作用于卵巢，从而促进卵泡发育、调控配子形成[3]，因此FSHR是母畜生殖必需的。研究发现猪卵泡成熟与排卵依赖FSHR基因的表达[4]，其基因编码区上3个碱基突变(c.74C＞G、c.532G＞A和c.1166T＞C)显著影响猪排卵数，FSHR被认为是影响猪繁殖性状的主效基因[1]。在绵羊中，FSHR基因在卵巢组织不同大小(直径4~7 mm)和不同状态(优势卵泡、劣势卵泡和黄体化卵泡)的卵泡中均差异表达[5]，说明FSHR基因表达水平与绵羊卵泡发育、优势化和排卵有关。FSHR基因5'-调控区和编码区SNP位点(g.-414G＞A、g.-200G＞A、g.-197G＞A、g.-98T＞C、g.-47C＞T和c.1235T＞C)的多态性均与绵羊多胎性状(产羔数)显著关联[6-9]。因此，FSHR是影响绵羊多胎性状的重要候选基因。
湖羊是中国著名的多胎绵羊品种，其多胎机制一直是湖羊特色性状研究和应用的热点[6, 10-12]。FSHR基因SNP位点多态性与湖羊多胎性状之间关系密切[13]，是影响湖羊多胎性状的候选基因。在高繁殖力绵羊个体卵巢卵泡中，FSHR基因转录水平显著高于低繁殖力个体[5, 14]，可见卵泡中FSHR基因表达水平与绵羊繁殖力有关。但目前关于绵羊FSHR基因转录调控的研究较少，特别是转录因子的调控还未见报道。本研究拟以湖羊FSHR基因为研究对象，克隆湖羊FSHR基因5'-UTR序列，了解其序列特征(如转录调控元件和转录因子结合位点)，分析湖羊转录因子PAX4基因的组织表达特征和在卵巢颗粒细胞凋亡中的作用，以及对湖羊FSHR基因转录活性的影响，以期揭示湖羊FSHR基因的转录调控机制和湖羊多胎分子机制。
1 材料与方法 1.1 试验动物成年湖羊母羊(n=3)心、肝、脾、肺、肾、胃、肌肉、大肠、小肠、子宫和卵巢11种组织样采自苏州种羊场，置于液氮中保存，用于提取DNA和RNA。
1.2 核酸提取采用酚/氯仿法提取湖羊卵巢组织DNA。采用Trizol(Invitrogen公司)法提取湖羊各组织和卵巢颗粒细胞总RNA，并利用快速反转录试剂盒(TaKaRa公司)反转录成cDNA。DNA和cDNA均在-20 ℃冰箱中保存备用。
1.3 克隆测序以绵羊FSHR基因序列(GenBank序列号：NC_019460.1)为参考序列，设计引物P1用于扩增湖羊FSHR基因5'-UTR序列，引物信息和扩增条件见表 1。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行分离，并采用胶回收试剂盒(Axygen公司)进行回收。回收产物与载体pMD19-T(TaKaRa公司)连接后，转化到感受态细胞DH5α(天根公司)中；挑取阳性克隆，采用质粒提取试剂盒(Axygen公司)提取质粒，由上海生物工程公司进行双向测序。
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表 1 引物信息 Table 1 The primers in this study |
采用DNAMAN v5.2.2软件进行序列整理和比对分析；采用在线程序Genomatix(https://www.genomatix.de)进行转录调控元件和转录因子结合位点预测；采用在线软件Methprimer(http://www.urogene.org)预测CpG岛。
1.5 组织表达谱以湖羊11个组织cDNA为模板，以P2(表 1)为引物进行RT-PCR扩增。扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行分离，用Tanon-3500凝胶成像系统拍照。以GAPDH为内参基因，采用Quantity One v4.52软件对目的基因和内参基因进行灰度分析，用目的基因/内参基因计算不同组织目的基因的相对表达量。
1.6 载体构建湖羊PAX4基因过表达载体pcDNA3.1-PAX4由南京伯津公司合成，采用双酶切鉴定法和直接测序进行确认。以P4(表 1)为引物扩增湖羊FSHR基因5'-UTR，用限制性内切酶Kpn Ⅰ和Hind Ⅲ酶切后，克隆到pGL3双荧光素酶报告基因载体(Promega公司)中，并转染感受态细胞DH5α(天根公司)，采用双酶切鉴定法和直接测序进行确认，构建湖羊FSHR基因5'-UTR荧光素酶报告基因重组质粒。
1.7 细胞培养、转染和荧光素酶活性分析商品猪卵巢采自南京天环屠宰场，用于抽取卵巢颗粒细胞。猪卵巢颗粒细胞培养、转染和荧光素酶活性分析的具体方法见文献[2]。
1.8 qRT-PCRpcDNA3.1-PAX4转染体外培养的卵巢颗粒细胞，48 h后收集细胞，提取细胞总RNA，并反转录成cDNA。卵巢颗粒细胞中PAX4基因表达水平采用qRT-PCR技术进行检测，具体步骤见文献[11]，退火温度见表 1。
1.9 数据分析数据用“平均数±标准误”表示，采用SPSS v18.0软件对数据进行统计分析。P < 0.05表示差异显著；P < 0.01表示差异极显著。
2 结果 2.1 湖羊FSHR基因5'调控区克隆以湖羊卵巢组织基因组DNA为模板，利用引物P1进行PCR扩增，PCR产物电泳结果见图 1。从图 1可以看出，电泳条带单一明亮。测序发现，扩增片段长度为730 bp，与引物源序列(GenBank序列号：NC_019460.1)的一致性为98.99%。
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M.DL2000 marker；1~2.PCR扩增产物 M.DL2000 marker; 1-2.PCR product 图 1 湖羊FSHR基因5'调控区扩增产物电泳图 Figure 1 Agarose gel photograph of FSHR 5' regulatory region in Hu sheep |
湖羊FSHR基因5'-UTR序列全长161 bp(图 2)。序列分析发现，湖羊FSHR基因5'-UTR序列中A、T、C和G等4种碱基的含量分别是32.30%、16.77%、21.74%和29.19%，其中A+T含量(49.07%)接近C+G含量(50.93%)。同源性比对发现，湖羊FSHR基因5'-UTR序列与特塞尔(Texel)绵羊序列(GenBank序列号：NC_019460.1)一致，与牛(GenBank序列号：AC_000168.1)、小鼠(GenBank序列号：NC_000083.6)和斑马鱼(GenBank序列号：NC_007123.7)的一致性分别为95.03%、61.11%和28.90%，可见FSHR基因5'-UTR核苷酸序列在哺乳动物中较为保守。通过序列比对发现，在湖羊FSHR基因5'-UTR区含有多个转录调控元件，如E-box、CAAT-box和GC-box等(图 2)。采用在线软件Genomatic对湖羊FSHR基因5'-UTR序列进行转录因子结合位点预测，结果显示，在湖羊FSHR基因5'-UTR序列含有GATA -2、SOX3、IRF-1、Sp1、E4FUSF1和SOX10转录因子结合位点(图 2)。采用在线软件Methprimer在湖羊FSHR基因5'-UTR中未检测到CpG岛，但发现多个CpG位点。
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*表示转录起始位点; 黑体字母表示USF1结合位点；虚线表示起始密码子 * indicate transcription start site. Black letters indicate binding site for USF1;Dashed line indicate start codon 图 2 湖羊FSHR基因5'-UTR序列与特塞尔绵羊、牛同源性比对 Figure 2 Alignment of FSHR 5'-UTR sequence in Hu sheep with Texel sheep and cattle |
PAX4(Paired box 4)是一种重要的转录因子，主要通过与靶基因调控区结合调控基因转录[15]，但关于其调控FSHR基因转录和在卵巢中作用的研究还未见报道。本研究首先以湖羊心、肝、脾、肺、肾、胃、肌肉、大肠、小肠、子宫和卵巢11种组织cDNA为模板，采用RT-PCR技术检测各组织中PAX4基因表达情况，结果见图 3。从图 3中可以看出，PAX4基因在湖羊11种组织中均有表达，其中在小肠组织表达量最高，在心和肝等组织高表达，在心、肝、肺、胃、肾、子宫和卵巢等组织中等表达，而在脾、肌肉和大肠等组织中低表达，可见PAX4是一个卵巢组织表达基因。
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M.DL100 marker；1~11.心、肝、脾、肺、肾、胃、肌肉、大肠、小肠、子宫和卵巢 M.DL100 marker; 1-11. Heart, liver, spleen, lung, kidney, stomach, muscle, rectum, intestinal, uterus and ovary 图 3 湖羊PAX4基因组织表达谱 Figure 3 The mRNA expression profile of PAX4 gene in various tissues of Hu sheep |
本研究合成了湖羊PAX4基因过表达载体(pcDNA3.1-PAX4)。pcDNA3.1-PAX4载体经双酶切(图 4A)和直接测序鉴定正确后，瞬时转染体外培养的卵巢颗粒细胞，qRT-PCR检测发现，PAX4过表达组(即转染pcDNA3.1-PAX4)卵巢颗粒细胞中PAX4基因mRNA表达水平极显著高于对照组(P < 0.01)(图 4B)，说明构建的湖羊PAX4基因过表达质粒pcDNA3.1-PAX4可在卵巢颗粒细胞中高效表达，符合试验要求。流式细胞术检测发现，PAX4过表达组卵巢颗粒细胞凋亡率显著高于对照组(P < 0.05)(图 5)，说明PAX4可促进卵巢颗粒细胞凋亡，是一个促凋亡转录因子。
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A.pcDNA3.1-PAX4载体的酶切鉴定；B. pcDNA3.1-PAX4载体转染后PAX4基因表达。M.DL5000 marker；1.pcDNA3.1载体；2.pcDNA3.1-PAX4载体。**.P < 0.01 A.The digested results of pcDNA3.1-PAX4 vector; B.The expression of PAX4 in granulosa cells transfected with pcDNA3.1-PAX4 vector. M.DL5000 marker; 1.pcDNA3.1 vector; 2.The restructuring pcDNA3.1-PAX4 vector. **.P < 0.01 图 4 湖羊PAX4基因过表达载体在卵巢颗粒细胞中的表达 Figure 4 The expression of Hu sheep pcDNA3.1-PAX4 vector in ovarian granulosa cells |
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A、B.流式细胞术检测pcDNA3.1和pcDNA3.1-PAX4转染后颗粒细胞凋亡；C.凋亡率分析。*. P < 0.05 A, B.Flow cytometry was performed to detect cell apoptosis in GCs transfected with pcDNA3.1 and pcDNA3.1-PAX4;C.Apoptosis rate analysis. *. P < 0.05 图 5 湖羊PAX4在卵巢颗粒细胞凋亡中的作用 Figure 5 The role of Hu sheep PAX4 in ovarian granulosa cell apoptosis |
本研究构建了包含PAX4结合位点(CAGGATTG)的湖羊FSHR基因5'-UTR的双荧光素酶报告载体pGL3-730(图 6A)。将湖羊PAX4基因过表达载体pcDNA3.1-PAX4与FSHR基因5'-UTR双荧光素酶报告载体pGL3-730共转体外培养的卵巢颗粒细胞，收集细胞检测荧光素酶活性，结果见图 6B。从图 6B中可以看出，转染pcDNA3.1-PAX4后，卵巢颗粒细胞中pGL3-730载体的荧光素酶活性显著低于对照组(P < 0.05)。同样地，转染pcDNA3.1-PAX4后，COS-7细胞中pGL3-730载体的荧光素酶活性极显著低于对照组(P < 0.01)(图 6C)。结果说明转录因子PAX4可下调湖羊FSHR基因5'-UTR活性，即抑制FSHR基因的转录活性。
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A.pGL3-730载体的酶切鉴定: M.DL2000 marker; 1~3.pGL3-730酶切产物。B.过表达PAX4对卵巢颗粒细胞中pGL3-730活性的影响; C.过表达PAX4对COS-7细胞中pGL3-730活性的影响。*.P < 0.05；**.P < 0.01 A.The digested results of pGL3-730 vector:M.DL2000 marker; 1-3.The restructuring pGL3-730 vector.B. Overexpression of PAX4 influences luciferase activity of pGL3-730 vector in granulosa cells; C.Overexpression of PAX4 influences luciferase activity of pGL3-730 vector in COS-7 cells.*.P < 0.05;**.P < 0.01 图 6 PAX4对湖羊FSHR基因转录活性的影响 Figure 6 The effect of PAX4 on the transcriptional activity of FSHR gene in Hu sheep |
FSH是促进哺乳动物卵巢卵泡生长、发育、分化和成熟的关键激素，但其生物学功能的发挥必须通过与其靶细胞膜上的受体蛋白(FSHR)结合才能传导信号进入靶细胞内[16]，因此FSHR水平的高低决定了FSH对靶细胞的作用效果，以及响应的生物学特征[17]。研究发现FSHR基因转录调控的研究主要在5'调控区，其中人、模式动物(如小鼠)和主要家畜(如猪、牛)等哺乳动物FSHR基因5'-UTR和核心启动子区均已被成功鉴定，5'调控区结构和序列特征也进行了深入的研究[18-21]。在绵羊中，早在1997年就已鉴定出其FSHR基因的5'-UTR[22]，其核心启动子区也于2001年被发现[23]。另外，国内著名地方绵羊品种湖羊FSHR基因核心启动子区的鉴定工作也于2014年完成[9]，但目前关于绵羊特别是湖羊FSHR基因5'-UTR特征的研究相对较少。本研究通过克隆测序获得了湖羊FSHR基因5'-UTR序列，并发现其包含多个已知的转录调控元件，如E-box、CAAT-box和GC-box等。E-box是目前研究最多的FSHR基因5'-UTR的转录调控元件，在人、大鼠和绵羊等物种中已证实E-box元件可招募大量同源结合因子、上游刺激因子USF1与USF2，调控FSHR基因的转录活性[20]。I.Teino等[24]发现，AHR可通过E-box元件调控小鼠卵巢中FSHR基因的转录活性。另外，CAAT-box可能是RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymerase Ⅱ，Pol Ⅱ)特异性结合的DNA序列元件，控制基因转录的正确起始和频率[25-26]，而GC-box一般位于CAAT-box两侧，是转录因子Sp1结合区域，可激活基因转录[27-28]，但目前关于这2个转录调控元件调控FSHR基因转录的研究还未见报道。湖羊FSHR基因5'-UTR序列中多个转录调控元件的发现，为进一步研究湖羊卵巢组织中FSHR基因的转录调控奠定了基础。
转录因子是一类具有特定功能的蛋白，主要通过与靶基因5'调控区上相应的结合位点组合在一起形成顺式调控模块，共同调控靶基因转录。目前已鉴定的FSHR基因的转录调控因子主要包括转录因子如GATA-1[29]、E2F[29]、GATA-4[30]、GATA-6[30]、AR[31]、DAX-1[31]、OCT-1[32]、FOXL2[33]和YY1[9]等，和表观遗传因子如组蛋白去乙酰化酶MAT2[34]、miR-143[6]和miR-126*[35]等，其中通过作用于5'调控区对FSHR基因进行转录调控的主要还是转录因子。本研究在湖羊FSHR基因5'-UTR序列中预测到多个转录因子结合位点，如GATA-2、SOX3、IRF-1、Sp1、E4F、USF1和SOX10等，其中USF1[20]和GATA家族[32]已被证实可调控哺乳动物FSHR基因转录。PAX4是已知的促进哺乳动物胚胎期内分泌腺体发育的关键转录因子[15]，但目前关于其在卵巢中的作用及对FSHR基因进行转录调控的研究还未见报道。本研究结果发现，PAX4可促进卵巢颗粒细胞凋亡，是一个促凋亡因子，这与FSHR在卵巢颗粒细胞中的作用正好相反[2]。进一步研究发现，PAX4可抑制湖羊FSHR基因转录活性，这与PAX4、FSHR在卵巢颗粒细胞中的作用[2]是一致的，说明PAX4是湖羊FSHR基因的功能性转录因子。
4 结论本研究克隆了湖羊FSHR基因5'-UTR序列，了解了5'-UTR序列特征(如转录调控元件和转录因子结合位点)。转录因子PAX4在湖羊卵巢组织中表达，可促进卵巢颗粒细胞凋亡。荧光素酶活性分析发现，PAX4可抑制湖羊FSHR基因转录活性，是湖羊FSHR基因的抑制性转录因子。
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