畜牧兽医学报  2018, Vol. 49 Issue (4): 859-864. DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2018.04.026    PDF    
引用本文
董建国, 王瑞, 曲哲会, 赵瑜, 刘涛. 2014—2015年豫南地区猪流行性腹泻病毒S基因变异分析[J]. 畜牧兽医学报, 2018, 49(4): 859-864.  
DONG Jian-guo, WANG Rui, QU Zhe-hui, ZHAO Yu, LIU Tao. Genetic Variations of S Gene of Porcine Epidemic Diarrhea Virus in Sourthern Henan Province from 2014 to 2015[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2018, 49(4): 859-864.  
2014—2015年豫南地区猪流行性腹泻病毒S基因变异分析
董建国, 王瑞, 曲哲会, 赵瑜, 刘涛     
信阳农林学院牧医工程学院, 信阳 464000
收稿日期：2017-08-23
基金项目：大别山区动物重大疫病综合防控技术（CXTD-201602）；预防兽医学教学团队（JXTD201701）
作者简介：董建国(1986-)男, 河南信阳人, 讲师, 博士, 主要从事动物重大传染病流行病学的研究, E-mail:dongjianguo213@163.com
通信作者：刘涛, E-mail:decai@163.com
摘要：为分析河南地区猪流行性腹泻病毒（PEDV）的变异情况，本研究设计合成扩增S基因全长的引物，利用RT-PCR方法，对2014—2015年采集病料中38株PEDV S基因进行扩增、克隆和序列测定，并根据结果构建进化树和进行序列比对分析。S基因进化树分析表明：所有PEDV S基因扩增片段与近年来中国和美国分离的变异毒株亲缘关系较近。序列比对分析表明：扩增的PEDV S基因编码的S蛋白中存在氨基酸的插入和缺失。并且，一些扩增S基因片段在编码的S蛋白的C端有11个氨基酸的缺失。许多扩增的S基因在编码的S蛋白的中和表位COE和2C10区域存在氨基酸突变。这些结果为了解河南地区PEDV变异流行情况和控制PED的暴发提供了基础研究理论。
关键词：猪流行性腹泻病毒(PEDV)    S蛋白    分子特性    进化分析    
Genetic Variations of S Gene of Porcine Epidemic Diarrhea Virus in Sourthern Henan Province from 2014 to 2015
DONG Jian-guo, WANG Rui, QU Zhe-hui, ZHAO Yu, LIU Tao     
College of Animal Husbandry and Veterinary, Xinyang Agriculture and Forestry University, Xinyang 464000, China
Abstract: To investigate the variation of PEDV S gene in Henan province, specific primers were designed and synthesized, S genes of 38 PEDV strains from different pig farms in Henan provinces from 2014-2015 were amplified by RT-PCR, then cloned and sequenced. The phylogenetic relationships and protein characterization of the full-length PEDV S protein in Henan of China were analyzed with other PEDV reference strains. Phylogenetic analysis indicated that all the amplified S genes had a close relationship with some variant strains isolated from China and USA in recent years. Sequence alignment analysis showed that extensive amino acid (AA) insertion and deletion were found in the S protein. Furthermore, there were 11 AA deletion at the C terminal of S protein encoded by amplicated S gene. Many strains had wide AA substitution in the neutralizing epitopes COE and 2C10. These results will provide valuable research basis for understanding the variant characterization of PEDV and controlling the outbreak of PED in this area.
Key words: PEDV     S protein     molecular characterization     phylogenetic analysis    

猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea, PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起的猪的一种高度接触性肠道传染病[1]，以排水样粪便、呕吐、脱水和食欲下降、精神沉郁为主要特征。对刚出生的仔猪危害最大。该病于1971年在英国首次暴发，随后瑞士、法国、中国、日本、朝鲜和美国等国家均发生该病，呈地方流行性[2-5]。PEDV是有囊膜的RNA病毒，属于冠状病毒科α冠状病毒属成员。PEDV基因组全长28 kb左右，包括7个开放阅读框，它们分别编码四个结构蛋白(S、E、M和N)及三个非结构蛋白(pp1a、pp1ab和ORF3)。PEDV S蛋白由1 383个氨基酸组成，是最大的结构蛋白。S蛋白是糖蛋白，位于病毒粒子表面[6]。有研究表明S蛋白能够激活宿主产生中和抗体。已经发现四个中和表位(COE：aa 499—638，SS2：aa 748—755，SS6：aa 764—771，2C10：aa 1 368—1 374)[7-9]。因此，S蛋白在PEDV遗传演化中具有重要作用。

2010年以前，PED在中国呈散发状态。但是，2010年以后，新的变异毒株在中国许多地区出现，导致刚出生小猪严重腹泻，给我国养猪业造成巨大的经济损失。PEDV变异毒株能够引起1~10日龄仔猪几乎100%的感染率和80%~100%的致死率[10-11]。河南是中国中部养猪最多的省份，但是近些年部分猪场发生PED，导致大规模的仔猪死亡。因此，本研究调查了最近河南地区不同PEDV分离株S基因的改变情况，以便进一步了解该地区PEDV的流行病学，为疾病的防控提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 病料

河南省各地区疑似暴发PEDV的自然发病猪，采集发病猪肠道组织及内容物，无菌处理，于-80 ℃冻存备用。

1.2 细胞和菌体

所用宿主菌E. coli DH5α感受态细胞由信阳农林学院牧医工程学院传染病实验室保存并提供。

1.3 主要试剂

病毒DNA/RNA提取试剂盒购自Magen公司；反转录试剂盒购于Promega公司；RT-PCR相关试剂盒购自TOYOBO生物科技有限公司和Vazyme公司；DNA Marker DL2000等购自TaKaRa公司；胶回收试剂盒购自Promega公司；EB替代染料，；pEASY-Blunt Simple Cloning Vector和Trans-5α感受态细胞均购自北京全式金生物技术有限公司。

1.4 引物设计与合成

根据GenBank中发布的CV777和近些年发布的PEDV变异毒株序列保守区域设计4对特异性引物，将S基因分成4个片段(S1、S2、S3、S4)进行扩增，每两段之间有一部分重叠区域，引物由上海生工生物工程公司合成。引物信息见表 1。

表 1 PEDV S基因扩增引物序列 Table 1 Sequences of amplified PEDV S gene
1.5 核酸提取及目的基因反转录扩增

将处理的病料根据Magen公司产品试剂盒进行病毒核酸的提取，然后根据TaKaRa反转录试剂盒，以四个片段的下游引物进行病毒RNA的反转录扩增合成cDNA。运用TaKaRa高保真酶扩增S基因，扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定条带大小。

1.6 基因克隆和序列分析

PCR扩增产物通过1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，使用Promega公司胶回收试剂盒对目的片段进行胶回收，然后连接到北京全式金生物有限公司的pEASY-Blunt Simple Cloning Vector上，经过转化挑菌鉴定后送往测序公司进行测序。将测序正确的序列运用Lasergene的SeqMan软件进行序列拼接，随后用于Lasergene的Meglian软件和Mega5.0对全长S基因进行序列比对分析和构建系统进化树。

将所获得的PEDV S基因核苷酸序列均上传至GenBank。

2 结果 2.1 S基因核苷酸序列

38株PEDV临床样品信息和S基因扩增片段大小见表 2，S基因在GenBank中的编号为KY211038到KY211075。

表 2 临床样品信息和扩增片段大小 Table 2 Clinical sample information and amplification fragment size
2.2 S基因的演化分析

运用MEGA5.2软件对S基因的氨基酸序列进行进化分析。如图 1所示，扩增的PEDV S基因片段均属于Group2，DR13毒株和CV777毒株属于Group1。Group2又进一步的被分为五个亚组，ZMD10/11S、PDS1/2S、NY9S和XY5S这几个PEDV S基因片段与GD-1、CHGD-01亲缘性较近，属于Subgroup2；LY1S、NY1/5S、XY2S与变异毒株BJ-2011-1、AH2012、AJ1102亲缘关系近，属于Subgroup3；扩增的S基因片段ZMD3/4/5/7/8/9S、XY1/4/6S、NY2/3/4/6/7/10S和LH2S与USA Colorado 2013变异毒株亲缘关系较近，属于Subgroup4；其他扩增的S基因片段与PEDV CH ZMDZY 11有更近的亲缘关系，属于Subgroup5。

图 1 PEDV S基因的进化树分析 Figure 1 Phylogenetic tree analysis of PEDV S gene
2.3 S蛋白氨基酸变异分析

为了深入了解S基因的特性，运用MegAlign软件对所有扩增的S基因编码的S蛋白的氨基酸序列与参考毒株进行比对分析。结果显示：扩增的S基因片段之间核苷酸序列的相似性在96.0%~100%；编码的氨基酸序列的相似性在94.7%~100%；扩增的S基因片段与参考毒株之间核苷酸序列的相似性为84.6%~100%；编码的氨基酸序列的相似性为79.3%~100%。与经典毒株CV777、LZC相比，所有扩增的S基因编码的S蛋白在第55—58氨基酸位点均有5个氨基酸的插入，在第159—160氨基酸位点有2个氨基酸的缺失。与其他分离的PEDV不同的是，NY1/5S的S蛋白在第358—363氨基酸位点有6个氨基酸的插入，XY6S的S蛋白在第393—394氨基酸位点有2个氨基酸的插入。除了经典毒株CV777与LZC，所有扩增的S基因编码的S蛋白在第55—58氨基酸位点均有4个氨基酸的插入，在第159—160位氨基酸位点均有2个氨基酸的缺失。然而，扩增的XY4S、ZMD4/5/7/8/9S、NY4/8/10S S基因编码的S蛋白在第1 362—1 366氨基酸位点有5个氨基酸的缺失，XY3/8/9S、XC1S在第161位以及第1 362—1 366位氨基酸位点有6个氨基酸的缺失。XY4S、ZMD4/5/7/8/9S、NY4/8/10S、XY3/8/9S与XC1的S蛋白与其他毒株相比在C端有11个氨基酸的缺失。

PEDV的S蛋白是一个含有四个中和表位的一型糖蛋白。四个中和表位：COE(499—638 aa)、SS2(748—755 aa)、SS6(764—771 aa)与2C10(1 368—1 374 aa)。所有扩增的S基因片段的中和表位与代表毒株进行分析比对，结果显示：氨基酸的替换主要位于COE与2C10两个区域，中和表位SS2与SS6两个区域相对比较保守。在中和表位COE区域，LY1S有三个位点的氨基酸突变，分别如下：562位的赖氨酸突变为天冬氨酸，607位的丝氨酸突变为甘氨酸，608位的甘氨酸突变为颉氨酸。NY1S与NY5S有两个相同的突变，即：538位的苯丙氨酸突变为丝氨酸，608位的甘氨酸突变为颉氨酸。XY2S有四个突变，即：580位的赖氨酸突变为精氨酸，592位的丙氨酸突变为脯氨酸，607位的丝氨酸突变为天冬氨酸，608位的甘氨酸突变为丝氨酸。XC2、XX1S、LH1S与XY7S毒株有三个相同的突变，分别如下：520位的组氨酸突变为精氨酸，526位的异亮氨酸突变为苏氨酸，583位的赖氨酸突变为天冬酰胺。JZ1S有两个氨基酸突变，即：526位的异亮氨酸突变为苏氨酸，583位的赖氨酸突变为天冬酰胺。在中和表位2C10区域，很多扩增的S基因编码的S蛋白在1 371氨基酸位点或1 375氨基酸位点有一个突变。ZMD4/11S、LY1S、NY1/5S、XY2S与ZMD3S均在1 375氨基酸位点由丙氨酸突变为颉氨酸。XY3/4/8/9S、ZMD4/5S、NY4/8/10S、ZMD7/8/9S与XC1S毒株均在1 371氨基酸位点由谷氨酰胺突变为亮氨酸。然而，所有扩增的S基因编码的S蛋白在SS2与SS6两个中和表位没有一个氨基酸突变。

3 讨论 3.1 关于PEDV S基因扩增测序

目前，PEDV在中国流行并且很多学者已经报道PEDV变异毒株正在不断出现，经典毒株制作的PEDV弱毒疫苗可能对于新出现的PEDV变异毒株不具有完全的保护能力[12-15]。本研究中，2014年至2015年中国中部河南省各地区猪场腹泻病料中，扩增到38株PEDV的S全基因片段并测序。将扩增的S基因与参考毒株进行遗传演化分析。结果表明：所有扩增的S基因与新分离的变异毒株CH/ZMDZY/11、AH2012、USA Colorado 2013以及2011年后中国和美国分离的毒株亲缘关系很近，均属于Group2。遗传演化分析结果与先前的报道相似[16-17]，证明现今在河南省境内流行的PEDV毒株为变异毒株。

3.2 关于PEDV S基因进化树分析

另外，Group2又进一步被分为五个亚组，分别为Subgroup1、Subgroup2、Subgroup3，Subgroup4和Subgroup5。扩增的ZMD10/11S、PDS1/2S、NY9S、XY5S S基因片段与从中国南部分离出的GD-1、CHGD-01毒株亲缘相近，属于Subgroup2。LY1S、NY1/5S和XY2S属于Subgroup3，与中国北部、东部、中部分离的变异毒株BJ-2011-1、AH2012、AJ1102亲缘关系相近。进一步分析得出，ZMD3/4/5/7/8/9S、XY1/4/6S、NY2/3/4/6/7/10S与LH2S毒株与USA Colorado 2013毒株亲缘关系相近，属于Subgroup4[18]。其他扩增的S基因片段与中国中部分离的CH ZMDZY 11毒株亲缘关系相近，属于Subgroup5[19]。这些结果表明，本次从河南省扩增的38株PEDV S基因片段经历了不同的变异演化。

3.3 关于PEDV S蛋白氨基酸序列比对分析

对于中国PEDV野毒毒株S基因全长进行演化分析，将会有助于更好地了解中国河南省PEDV毒株的遗传演化关系。分析结果表明：所有扩增的PEDV S基因片段都有一个共同的重要特点，即编码的S蛋白有氨基酸的插入和缺失。扩增的38株PEDV S基因编码的S蛋白在第55—58位氨基酸位点均有4个氨基酸的插入，在第159—160位氨基酸位点均有2个氨基酸的缺失，与之前的研究报道相似[20]。

3.4 关于PEDV S蛋白免疫原性分析

PEDV的S蛋白属于Ⅰ型糖蛋白，包括四个中和表位，分别为COE(499—638 aa)、SS2(748—755 aa)、SS6(764—771 aa)与2C10(1 368—1 374 aa)。序列比对分析结果表明，扩增的38株PEDV S基因编码的S蛋白在中和表位SS2与SS6是保守的，未发生突变。与经典毒株CV777相比，在中和表位COE区域，XY2S、XC2、XX1S、LH1S、XY7S、LY1S和JZ1S毒株均有氨基酸突变。在中和表位2C10区域，扩增的38株PEDV S基因中有20株编码的S蛋白有1个氨基酸突变。另外，XC2S、XX1S、LH1S与XY7S四株与美国分离的USA Colorado 2013毒株有相似的氨基酸突变[12]。有7株与BJ-2011-1、USA Colorado 2013、CH/ZMDZY/11相似，第1 375位的丙氨酸突变为颉氨酸[7, 12, 20]。PEDV的S蛋白是一个位于病毒表面的糖蛋白，并且诱导宿主产生中和抗体[6, 20]。这些扩增的S基因编码的S蛋白的中和表位氨基酸的突变是否会影响机体中和抗体的产生，有待进一步的研究。

4 结论

扩增河南地区2014—2015年采集病料中的38株猪流行性腹泻病毒(PEDV)的S基因并测序。分析显示所有PEDV S基因扩增片段与近年来中国和美国分离的变异毒株亲缘关系较近；扩增的PEDV S基因编码蛋白中存在氨基酸的插入和缺失；部分编码蛋白序列在C端有11个氨基酸的缺失；许多编码蛋白序列的中和表位COE和2C10区域存在氨基酸突变。

参考文献
[1] 殷震, 刘景华. 动物病毒学[M]. 2版. 北京: 科学出版社, 1997: 681-688.
YIN Z, LIU J H. Animal virology[M]. 2nd ed. Beijing: Science Press, 1997: 681-688. (in Chinese)
[2] BRIDGEN A, DUARTE M, TOBLER K, et al. Sequence determination of the nucleocapsid protein gene of the porcine epidemic diarrhoea virus confirms that this virus is a coronavirus related to human coronavirus 229E and porcine transmissible gastroenteritis virus[J]. J Gen Virol, 1993, 74(Pt 9): 1795–1804.
[3] CHANG S H, BAE J, KANG T J, et al. Identification of the epitope region capable of inducing neutralizing antibodies against the porcine epidemic diarrhea virus[J]. Mol Cells, 2002, 14(2): 295–299.
[4] CHEN J F, WANG C B, SHI H Y, et al. Molecular epidemiology of porcine epidemic diarrhea virus in China[J]. Arch Virol, 2010, 155(9): 1471–1476. DOI: 10.1007/s00705-010-0720-2
[5] CHEN X, YANG J X, YU F S, et al. Molecular characterization and phylogenetic analysis of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) samples from field cases in Fujian, China[J]. Virus Genes, 2012, 45(3): 499–507. DOI: 10.1007/s11262-012-0794-x
[6] 张强敏, 郭福生, 尹燕博, 等. 猪流行性腹泻病毒分子生物学特征[J]. 中国病毒学, 2002, 17(4): 381–384.
ZHANG Q M, GUO F S, YIN Y B, et al. Molecular biological traits of Porcine epidemic diarrhea virus[J]. Virologica Sinica, 2002, 17(4): 381–384. (in Chinese)
[7] GAO Y Y, KOU Q W, GE X N, et al. Phylogenetic analysis of porcine epidemic diarrhea virus field strains prevailing recently in China[J]. Arch Virol, 2013, 158(3): 711–715. DOI: 10.1007/s00705-012-1541-2
[8] GE J W, LIU D Q, LI Y J. Construction of recombinant lactobacilli expressing the core neutralizing epitope (COE) of porcine epidemic diarrhea virus and a fusion protein consisting of COE and Escherichia coli heat-labile enterotoxin B, and comparison of the immune responses by orogastric immunization[J]. Can J Microbiol, 2012, 58(11): 1258–1267. DOI: 10.1139/w2012-098
[9] HUANG Y W, DICKERMAN A W, PIÑEYRO P, et al. Origin, evolution, and genotyping of emergent porcine epidemic diarrhea virus strains in the United States[J]. mBio, 2013, 4(5): e00737–13.
[10] 刘孝珍, 陈建飞, 时洪艳, 等. 2011年猪流行性腹泻病毒的遗传变异分析[J]. 中国预防兽医学报, 2012, 34(3): 180–183.
LIU X Z, CHEN J F, SHI H Y, et al. Genetic variation analysis of porcine epidemic diarrhea virus isolated in 2011[J]. Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine, 2012, 34(3): 180–183. (in Chinese)
[11] LEE D K, PARK C K, KIM S H, et al. Heterogeneity in spike protein genes of porcine epidemic diarrhea viruses isolated in Korea[J]. Virus Res, 2010, 149(2): 175–182. DOI: 10.1016/j.virusres.2010.01.015
[12] MARTHALER D, JIANG Y, OTTERSON T, et al. Complete genome sequence of porcine epidemic diarrhea virus strain USA/Colorado/2013 from the United States[J]. Genome Announc, 2013, 1(4): e00555–13.
[13] PARK S J, MOON H J, YANG J S, et al. Sequence analysis of the partial spike glycoprotein gene of porcine epidemic diarrhea viruses isolated in Korea[J]. Virus Genes, 2007, 35(2): 321–332. DOI: 10.1007/s11262-007-0096-x
[14] PENSAERT M B, DE BOUCK P. A new coronavirus-like particle associated with diarrhea in swine[J]. Arch Virol, 1978, 58(3): 243–247. DOI: 10.1007/BF01317606
[15] SONG D, PARK B. Porcine epidemic diarrhoea virus: a comprehensive review of molecular epidemiology, diagnosis, and vaccines[J]. Virus Genes, 2012, 44(2): 167–175. DOI: 10.1007/s11262-012-0713-1
[16] SPAAN W, CAVANAGH D, HORZINEK M C. Coronaviruses: structure and genome expression[J]. J Gen Virol, 1988, 69(Pt 12): 2939–2952.
[17] SUN D B, FENG L, SHI H Y, et al. Identification of two novel B cell epitopes on porcine epidemic diarrhea virus spike protein[J]. Vet Microbiol, 2008, 131(1-2): 73–81. DOI: 10.1016/j.vetmic.2008.02.022
[18] SUN R Q, CAI R J, CHEN Y Q, et al. Outbreak of porcine epidemic diarrhea in suckling piglets, China[J]. Emerg Infect Dis, 2012, 18(1): 161–163.
[19] TEMEEYASEN G, SRIJANGWAD A, TRIPIPAT T, et al. Genetic diversity of ORF3 and spike genes of porcine epidemic diarrhea virus in Thailand[J]. Infect Genet Evol, 2014, 21: 205–213. DOI: 10.1016/j.meegid.2013.11.001
[20] WANG X M, NIU B B, YAN H, et al. Complete genome sequence of a variant porcine epidemic diarrhea virus strain isolated in central China[J]. Genome Announc, 2013, 1(1): e00243–12.