畜牧兽医学报  2018, Vol. 49 Issue (4): 685-692. DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2018.04.004    PDF    
Wnt10b对山羊前体脂肪细胞分化相关基因表达的影响
林森1,2, 林亚秋1, 朱江江2, 许晴1, 赵越1, 池永东1, 王永1,2     
1. 西南民族大学生命科学与技术学院, 成都 610041;
2. 青藏高原动物遗传资源保护与利用四川省重点实验室, 成都 610041
摘要:旨在利用RNA干扰技术,明确Wnt10b基因对山羊前体脂肪细胞分化的影响。设计合成山羊Wnt10b siRNA序列,利用胶原酶消化法获得山羊皮下和肌内前体脂肪细胞。利用有效的siRNA序列干扰山羊皮下和肌内前体脂肪细胞Wnt10b基因表达后,检测其对细胞分化及脂肪细胞分化标志基因表达的影响。结果表明,筛选获得有效的山羊Wnt10b siRNA序列,转染山羊皮下和肌内前体脂肪细胞后,Wnt10b被显著干扰,其mRNA表达量分别下调63%(P < 0.01)和67%(P < 0.01);油红O染色结果显示,干扰Wnt10b基因可明显抑制山羊皮下和肌内脂肪细胞的脂滴积聚;且干扰Wnt10b基因后,在皮下前体脂肪细胞分化过程中C/EBPβPPARγSREBP1和AP2基因出现极显著下调(P < 0.01),LPL出现显著下调(P < 0.05);而在肌内前体脂肪细胞分化过程中,AP2和LPL基因出现极显著下调(P < 0.01),C/EBPβ出现显著下调(P < 0.05),Pref1出现极显著上调(P < 0.01)。本试验发现,Wnt10b基因可能通过调控C/EBPβPPARγSREBP1和LPL的表达来促进山羊皮下前体脂肪细胞分化,通过调控AP2、LPLC/EBPβPref1的表达来促进山羊肌内前体脂肪细胞分化。
关键词山羊    Wnt10b基因    RNA干扰    皮下脂肪细胞    肌内脂肪细胞    
Effect of Wnt10b on the Expression of Precursor Adipocytes Differentiation Related Genes in Goat
LIN Sen1,2, LIN Ya-qiu1, ZHU Jiang-jiang2, XU Qing1, ZHAO Yue1, CHI Yong-dong1, WANG Yong1,2     
1. College of Life Science and Technology, Southwest Minzu University, Chengdu 610041, China;
2. Key Laboratory of Sichuan Province for Qinghai-Tibetan Plateau Animal Genetic Resource Reservation and Exploitation, Chengdu 610041, China
Abstract: The aim of this study was to investigate the effect of Wnt10b gene on the precursor adipocytes differentiation of goat by RNA interference. The goat Wnt10b siRNA sequence was designed and compounded, and the goat subcutaneous and intramuscular precursor adipocytes were obtained by collagenase digestion. The effect of Wnt10b gene expression on the cell differentiation and adipocyte differentiation marker genes expression were detected by using the effective siRNA sequence to interfere the expression of Wnt10b gene in goat subcutaneous and intramuscular precursor adipocytes.The results showed that an effective goat Wnt10b siRNA sequence was obtained, and the expression of Wnt10b was down-regulated by 63% (P < 0.01) and 67% (P < 0.01), respectively after transfection in goat subcutaneous and intramuscular precursor adipocytes. Results of Oil red O staining showed that the accumulation of lipid droplets were inhibited significantly by Wnt10b RNAi in goat subcutaneous and intramuscular adipocytes. The C/EBPβ, PPARγ, SREBP1 and Pref1 genes were extremely significantly down-regulated in the subcutaneous precursor adipocyte differentiation after Wnt10b RNAi (P < 0.01), LPL was significantly down-regulated (P < 0.05). The AP2 and LPL were extremely significantly down-regulated (P < 0.01), C/EBPβ was significantly down-regulated (P < 0.05), and Pref1 was extremely significantly up-regulated (P < 0.01) in intramuscular precursor adipocytes differentiation. In this study, it was found that Wnt10b gene could promote the differentiation of goat subcutaneous precursor adipocytes by regulating the expression of C/EBPβ, PPARγ, SREBP1 and LPL, and promote the differentiation of goat intramuscular precursor adipocytes by regulating the expression of AP2, LPL, C/EBPβ and Pref1.
Key words: goat     Wnt10b gene     RNA interference     subcutaneous adipocytes     intramuscular adipocytes    

在动物生产中,根据不同部位脂肪经济价值的不同其选育的方向也不同,一方面,希望动物有更低的皮下脂肪和内脏脂肪等体脂含量,另一方面,又需要适量提高肌内脂肪以改善肉品质[1]。动物生长过程中脂肪组织的增加一部分来自于前体脂肪细胞的增殖和分化[2-3],脂肪分化受诸多转录因子、信号通路等共同调控。同时不同的脂肪细胞其储存和释放脂质的能力及其功能特性也不同,也预示了在分子水平上不同脂肪细胞之间的差异[4]。因此了解脂肪沉积的信号分子机制对于提高肉品质具有重要的经济意义。

Wnt(Wingless-type MMTV integration site family)蛋白是一种重要的信号分子,在细胞增殖、分化、迁移等发育过程中发挥关键作用[5]。其中Wnt/β-catenin信号通路是脂肪细胞分化的重要调节通路之一[6],Wnt家族成员中,Wnt10b是抑制脂肪细胞分化的主要分子开关[7],其同样也涉及到肥胖的发病机制[8-9]。研究发现,Wnt10b转基因小鼠较野生型小鼠相比,其脂肪组织总量存在极显著的下降[7, 10],H.F. Luo等[11]和J.Y. Jeong等[12]研究指出,猪和牛的Wnt10b mRNA表达水平与其肌内脂肪含量表现出较强的负相关。上述研究结果表明,Wnt10b基因是影响动物脂肪沉积的关键候选基因,但其在山羊脂肪沉积中是否发挥相似的作用,且在不同部位(皮下和肌内)的脂肪沉积中是否发挥相同的调控作用尚未见报道。

因此,本试验以简州大耳羊体外培养的皮下和肌内前体脂肪细胞为研究对象,利用RNA干扰技术使Wnt10b基因被干扰后,利用形态学检测确定其对脂肪细胞脂滴积聚的影响,利用实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR)检测两种前体脂肪细胞成脂诱导分化过程中脂肪细胞分化标志基因的表达变化,进而阐明Wnt10b基因对山羊不同部位前体脂肪细胞分化的影响及其可能的作用机制。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 样品采集

本试验选用四川省简阳大哥大牧业有限公司的1只7日龄健康简州大耳羊公羊(Capra hircus)作为研究对象。

1.1.2 主要试剂

Ⅰ型胶原酶、Ⅱ型胶原酶、油酸和油红O购自Sigma公司;Opti-MEM购自Gibco公司;Lipofectamine® RNAIMAX Reagent购自Invitrogen公司;胰蛋白酶、PBS和DMEM/F12培养基购自Hyclone公司;胎牛血清购自Gemini公司;TRIzol试剂和荧光定量试剂盒购自大连TaKaRa公司;反转录试剂盒购于Thermo公司。

1.2 方法 1.2.1 siRNA的设计

根据GenBank上山羊Wnt10b mRNA序列(登陆号:KU950832.1),选择不同位点设计两对Wnt10b siRNA,这两对序列经相似性软件比对分析不与已知的任何基因存在同源性。Wnt10b siRNA由Invitrogen公司合成,序列信息见表 1,分别命名为Wnt10b siRNA-1和Wnt10b siRNA-2。Negative control由公司提供。siRNA成品为已退火的冻干粉,使用前用DEPC水去重悬将其溶解成20 μmol·L-1的样品。所有siRNA样品经HPLC纯化。

表 1 山羊Wnt10b基因的siRNA序列 Table 1 Sequence of siRNA for goat Wnt10b
1.2.2 细胞培养

试验羊带回实验室后,颈动脉放血,用新洁而灭清洗2~3次,再用75%酒精擦拭消毒,在无菌细胞培养间分别取其皮下脂肪组织和背最长肌组织,用3倍双抗的PBS清洗3次后在超净工作台对其进行分离修剪,分别加入2倍体积的Ⅱ型和Ⅰ型胶原酶分别消化1.5和1 h(每隔5 min震荡1次),后加入等体积的10%胎牛血清培养液终止消化,然后分别过400和200目筛网,将滤液分装到离心管中,2 000 r·min-1离心5 min,弃上清,加入红细胞裂解液将沉淀吹散,静置5 min,2 000 r·min-1离心5 min,弃上清,用完全培养基重悬沉淀,取适量的重悬液分别放到60 mm培养皿中,加入适量完全培养基混匀后,即获得前体脂肪细胞,于37 ℃,5%CO2的恒温培养箱中培养,隔2 d换液1次。

1.2.3 siRNA干扰效果筛选及检测

取F3代的皮下前体脂肪细胞和肌内前体脂肪细胞进行培养,当细胞生长至70%~80%融合时进行转染,转染前4 h将完全培养液弃掉,每孔细胞加入450 μL无双抗10%胎牛血清培养液(12孔板)。分别取3 μL转染试剂与2 μL的siRNA(20 μmol·L-1)加入到50 μL的Opti-MEM中(对照组添加Negative control,试验组添加siWnt10b),充分混匀,室温孵育5 min。将siRNA-转染试剂混合液滴加到细胞中,充分混匀,置于37 ℃、5% CO2培养箱内培养,6 h后每孔细胞添加1 mL油酸诱导液(100 μmol·L-1)进行诱导分化。

转染48 h后收集细胞,TRIzol法提取总RNA,检测RNA浓度和纯度后反转录为cDNA,采用qPCR技术检测干扰效果,反应体系为20 μL:SYBR® Premix Ex Taq TM (2×) PCR 10 μL,10 μmol·L-1上下游引物各1 μL,模板cDNA 1 μL,ddH2O 7 μL。反应条件:95 ℃预变性3 min;95 ℃变性10 s,62 ℃退火10 s,72 ℃延伸15 s,40个循环。试验设置3个生物学重复,2个平行对照。

1.2.4 油红O染色

干扰Wnt10b基因后利用油红O染色检测其对山羊前体脂肪细胞分化的形态学影响。称取0.5 g油红O加入100 mL 98%的异丙醇配成油红O储存液,使用之前取4 mL蒸馏水加入6 mL油红O储存液制成油红O工作液,过滤后备用。弃去培养基后用PBS清洗3遍,10%甲醛固定30 min,弃去甲醛,PBS清洗2遍,加入油红O工作液染色8 min,弃去油红O,PBS清洗数遍后显微镜下观察并拍照。

1.2.5 干扰Wnt10b对脂肪细胞分化标志基因表达的影响

检测皮下前体脂肪细胞和肌内前体脂肪细胞分化过程中干扰Wnt10b后对脂肪分化标志基因CCAAT增强子结合蛋白α(CCAAT enhancer binding protein α,C/EBPα)、CCAAT增强子结合蛋白β(CCAAT enhancer binding protein β,C/EBPβ)、激活蛋白2(Activator protein 2,AP2)、脂蛋白脂肪酶(Lipoprotein lipase,LPL)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(Peroxisome proliferator-activated receptor γ,PPARγ)、固醇调节元件结合蛋白1(Sterol regulatory element binding protein 1,SREBP1)及前脂肪细胞因子1(Preadipocyte factor 1,Pref1)表达量的影响。定量引物序列信息见表 2。qPCR反应体系及条件同1.2.3。

表 2 荧光定量PCR引物 Table 2 Primers for quantitative real-time PCR(qPCR)
1.2.6 数据处理与分析

数据用“平均值±标准差(Mean ± SD)”表示,用2-ΔΔCt对实时定量PCR数据进行均一化处理,其中ΔCt(目的基因)=Ct(目的基因)-Ct(内参基因)ΔΔCt=ΔCt(样品组)-ΔCt(对照组)。利用SPSS 18.0软件中的One-way ANOVA进行显著性检验分析。当P < 0.05时,认为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 山羊皮下和肌内前体脂肪细胞中Wnt10b基因干扰效率检测

分离获得的原代山羊皮下、肌内前体脂肪细胞,培养24 h后,可观察到大量椭圆形、梭形细胞贴壁(图 1)。待细胞传至F3代,培养到70%~80%融合时,分别将Wnt10b siRNA-1和Wnt10b siRNA-2转染入山羊皮下和肌内前体脂肪细胞,48 h后收集细胞,TRIzol法提取细胞中总RNA,并将其反转录为cDNA进行定量检测,荧光定量结果显示,Wnt10b siRNA-2(在皮下脂肪细胞中大约降低63%,在肌内脂肪细胞中大约降低67%)相对于Wnt10b siRNA-1更能显著干扰Wnt10b基因的表达(图 2)。

A.皮下前体脂肪细胞培养24 h;B.肌内前体脂肪细胞培养24 h A. Primary cultured goat subcutaneous preadipocyte on 24 h; B. Primary cultured goat intramuscular preadipocyte on 24 h 图 1 原代培养脂肪细胞的形态 Figure 1 Morphology of the primary cultured adipocytes
A.皮下脂肪细胞;B.肌内脂肪细胞。**.差异极显著(P < 0.01);*.差异显著(P < 0.05)。n=3;内参基因为GAPDH A. Subcutaneous adipocyte; B. Intramuscular adipocyte. **. Extremely significant difference(P < 0.01); *. Significant difference(P < 0.05); Reference gene is GAPDH 图 2 Wnt10b mRNA干扰效率分析 Figure 2 Interference efficiency analysis of Wnt10b gene
2.2 山羊皮下和肌内前体脂肪细胞的油红O染色

收集细胞后进行油红O染色,结果显示,无论是皮下或肌内前体脂肪细胞,在干扰Wnt10b基因后,其细胞中脂滴的聚集均明显少于对照组(图 3)。

A.皮下脂肪细胞;B.肌内脂肪细胞 A. Subcutaneous adipocyte; B. Intramuscular adipocyte 图 3 山羊皮下和肌内前体脂肪细胞的油红O染色分析(400×) Figure 3 Oil red O staining analysis of goat subcutaneous and intramuscular adipocytes(400×)
2.3 干扰Wnt10b对山羊脂肪细胞分化标志基因表

达的影响qPCR结果显示,在皮下前体脂肪细胞分化过程中,干扰山羊Wnt10b基因后,C/EBPαAP2基因的表达水平没有发生显著性变化(P>0.05),而C/EBPβLPLPPARγSREBP1和Pref1的表达量呈不同水平的下降,大约分别下降77%(P < 0.01),42% (P < 0.05),38% (P < 0.01),52% (P < 0.01)和20% (P < 0.01)(图 4A)。而在肌内前体脂肪细胞分化过程中,干扰山羊Wnt10b基因后,C/EBPαPPARγSREBP1的表达水平并未发生显著性变化(P>0.05),C/EBPβAP2和LPL的表达量呈不同水平的下降,大约分别下降38%(P < 0.05)、53%(P < 0.01)和51%(P < 0.01),而Pref1表达量极显著上调(P < 0.01),大约上调1.8倍(图 4B)。

A.皮下脂肪细胞;B.肌内脂肪细胞 A. Subcutaneous adipocyte; B. Intramuscular adipocyte 图 4 山羊前体脂肪细胞分化过程中干扰Wnt10b对7个脂肪细胞分化标志基因表达的影响 Figure 4 Effect of Wnt10b RNAi on 7 genes related to adipocyte differentiation in goat preadipocyte differentiation
3 讨论

动物脂肪沉积与肉质性状密切相关,过量的脂肪沉积会影响动物产品的风味和品质,适量的肌内脂肪含量可调节肉的嫩度、风味与多汁性[13],因此近年来畜牧工作者对动物脂肪沉积关键基因的功能研究备受关注。研究表明,Wnt信号通路参与调控脂肪的发育与代谢[14],其中Wnt10b通过经典Wnt信号通路抑制C/EBPαPPARγ,以此来抑制脂肪细胞的分化[15]。但以往关于Wnt10b基因在成脂分化中的研究多集中于小鼠和人,未见在山羊上的报道,因此本研究在干扰Wnt10b基因后,利用形态学确定其对山羊皮下前体脂肪细胞和肌内前体脂肪细胞分化的影响,并检测了这个过程中脂肪细胞分化标志基因表达的变化,为阐明该基因调控山羊肌内脂肪沉积提供重要数据。

本试验利用油红O染色发现,干扰Wnt10b基因能降低山羊皮下前体脂肪细胞和肌内前体脂肪细胞中脂滴的积聚,S.E. Ross等[15]和W.P. Cawthorn等[16]研究发现,在小鼠3T3-L1细胞中Wnt10b能够抑制成脂分化,这与本试验的研究结果恰恰相反, 但具体的调控机制尚未阐明。研究发现,其他基因在山羊或者其他物种脂肪细胞分化中也存在类似报道。例如,Kruppel样转录因子4(Krupple-like transcription factor 4,KLF4)基因是3T3-L1前体脂肪细胞早期分化所必需的转录因子[17],然而Y.K. Park等[18]却提出了相反的观点,即KLF4对白色、棕色前体脂肪细胞分化无影响。同样KLF13通过PPARγ促进猪前体脂肪细胞分化,但对小鼠3T3-L1前体脂肪细胞分化却没有影响[19]。表明基因在同一物种的不同细胞系或不同物种间的生物学功能存在差异,推测山羊Wnt10b基因可能具有自己独特的调控前体脂肪细胞分化的分子机制,不能完全参照鼠源细胞系中的研究结果。实验室后续将利用过表达等其他手段来进一步阐明Wnt10b在山羊肌内前体脂肪细胞分化和其他物种及细胞系中的不同作用。

为了进一步阐明Wnt10b对山羊前体脂肪细胞调控的分子机制,及分析比较其对不同部位前体脂肪细胞分化的机理是否相同,本研究还在干扰Wnt10b后利用qPCR检测了脂肪细胞分化标志基因的表达变化。机体在前体脂肪细胞向成熟脂肪细胞转变过程中受到诸多转录因子调控。其中关于C/EBPs和PPARs转录因子的表达调控是目前研究最多的。在脂肪分化的早期,C/EBPβC/EBPδ的表达量迅速增加,随后诱导激活PPARγ,同时PPARγ又与C/EBPs共同促进C/EBPα的表达[20]。此外,C/EBPαPPARγ可以促使自身的表达增加,同时两者彼此也可以刺激对方的激活和表达,发挥协同作用[21],这些对于脂肪细胞分化不可或缺。AP2SREBP1和LPL是脂肪细胞分化过程中的关键转录因子,在脂质代谢中起至关重要的作用,其中AP2主要参与胞内脂肪酸的运输[22]SREBP1参与胆固醇、甘油三酯和脂肪酸的合成和代谢[23]LPL的功能主要是水解甘油三酯和作为配体促进机体摄取脂蛋白[24],同时研究报道,猪、牛、羊、鸡等动物的LPL表达量与肌内脂肪含量密切相关[25-28]Pref1作为脂肪细胞分化早期具有分化抑制作用的因子[29],在调节营养代谢和脂代谢平衡,保护脂肪变性等方面起重要作用[30]。本试验发现,Pref1基因在两处不同部位的脂肪细胞中有截然相反的结果,在肌内脂肪细胞中,干扰Wnt10b后脂滴蓄积减少,负调控因子Pref1基因的表达水平上升,肌内脂肪属于功能性组织,其富含的磷脂是影响肉品挥发性风味成分的重要前体物,而皮下脂肪则属于储能组织,Pref1基因主要在脂代谢合成方面起关键作用,这可能与Pref1基因在两种细胞中的表达差异有关,因此对于Wnt10b调控Pref1的作用机制仍需进一步探索。

研究表明,某些生物活性物质如共扼亚油酸在提高肌内脂肪含量的同时,却降低皮下脂肪的沉积[31]。同时研究发现,离体培养猪肌内脂肪前体细胞的聚脂速度要强于皮下脂肪前体细胞,但在体的情况下,肌内脂肪的沉积晚于皮下脂肪,沉积量也少,这提示肌内脂肪细胞可能受局部肌肉组织的微环境调控[32-34]。由以上研究推测,肌内脂肪沉积可能与皮下脂肪沉积存在不同的调控机制。本研究发现,干扰Wnt10b基因后在皮下脂肪细胞分化过程中C/EBPβPPARγSREBP1和LPL基因出现显著下调;在肌内前体脂肪细胞分化过程中,C/EBPβAP2和LPL也出现显著下调,而Pref1出现显著上调。表明Wnt10b基因在皮下和肌内脂肪细胞成脂分化过程中通过调控不同基因而发挥作用,可能具有不同的作用机制。

4 讨论

本试验发现,干扰山羊Wnt10b基因后山羊皮下和肌内前体脂肪细胞分化受到显著抑制,且可能通过调控C/EBPβPPARγSREBP1和LPL基因的表达来抑制山羊皮下前体脂肪细胞分化,通过调控AP2、LPL、C/EBPβPref1来抑制山羊肌内前体脂肪细胞分化。提示Wnt10b基因在山羊不同部位脂肪沉积中发挥调控作用的机制可能不同。

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