固醇调节元件结合蛋白(SREBPs)是调控细胞内胆固醇和甘油三酯合成，维持脂肪稳态的主要调控因子[1-2]。固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白(SREBP cleavage activating protein，SCAP)是SREBP的结合蛋白。哺乳动物SCAP蛋白一般由跨膜螺旋(TM)和羧基(C)末端组成，其中SCAP的TM构成了一个固醇敏感结构域，C末端结构域与SREBP前体在内质网膜形成复合物[3-4]。在细胞内胆固醇减少后，SREBP-SCAP复合物从内质网转移到高尔基体，随后SREBP前体蛋白的N末端发生蛋白酶水解，生成的SREBP片段进入细胞核调控靶基因转录，而SREBP前体蛋白的C末端通过未知机制从SCAP中移除，SCAP蛋白再从高尔基体回到内质网，然后与新合成的SREBP前体蛋白循环结合[5]。
已经有多个研究发现，SCAP-SREBP是调控固醇和脂肪代谢的关键信号通路[6]，介导了细胞内cAMP等多种分子对机体脂肪代谢的调节[7-8]。对反刍动物的研究发现，奶牛乳腺作为分泌乳脂的主要器官，胰岛素及一些信号分子能够调控乳腺上皮细胞的SREBP基因表达[9-10]。本实验室前期通过构建奶牛SREBP表达载体及硬脂酰辅酶A去饱和酶基因(SCD)启动子载体发现，在奶牛乳腺上皮细胞中SREBP1可以促进SCD基因的转录[11-12]，但在SCAP作用下对SREBP1调控SCD基因转录的影响还不清楚。
本研究通过在奶牛乳腺上皮细胞转染SCD启动子载体，共转染SCAP和SREBP1真核表达载体，分析对SCD启动子活性及其基因表达的影响，为阐明奶牛乳腺细胞中SCAP-SREBP1通路对于脂肪代谢基因的转录调控机制打下基础。
1 材料与方法 1.1 试验材料奶牛乳腺上皮细胞由实验室保存，奶牛SCAP真核表达载体(pcDNA3.1-SCAP)、SREBP1真核表达载体(pcDNA3.1-SREBP1)、奶牛pGL3-SCD2/SCD3启动子载体为实验室前期构建的SCD基因启动子荧光素酶报告基因表达载体[11](序列长度分别为381和417 bp，其中奶牛pGL3-SCD3含有SRE元件，结构见图 1)由实验室构建，荧光定量PCR仪(Eppendorf，德国)，Opti-mem无血清培养基(Gibco，美国)，DMEM培养基(Hyclone)，Lipofectamine3000(Thermo，美国)，双荧光素酶检测试剂盒(Promega，美国)，SYBR Green(百泰克)，c-MYC Antibody(9E10)(Santa Cruz，美国)，Alexa Fluor® 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)(Invitrogen, 美国)，二氧化碳培养箱(Sanyo，日本)，Fluroskan Ascent FL荧光和化学发光检测仪(Thermo，美国)，激光共聚焦显微镜(Carl Zeiss LSM 5 PASCAL，德国)。
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图 1 奶牛pGL3-SCD2/SCD3启动子的结构 Figure 1 Structure of dairy pGL3-SCD2/SCD3 promoters |
将奶牛乳腺上皮细胞接种于24孔板培养，放入5% CO2、37 ℃的培养箱中进行培养。将构建好的pGL3-SCD2和pGL3-SCD3启动子用Lipofectamine3000转染至细胞，进行不同的转染处理分组：对照组(转染1.0 μg pcDNA3.1质粒)，SCAP组(转染1.0 μg SCAP质粒)，SREBP1组(转染1.0 μg SREBP1质粒)，SCAP+SREBP1组(转染1.0 μg SCAP+1.0 μg SREBP1质粒)，作用24 h后收集细胞加入裂解液，同时转染内参海肾荧光素酶质粒，采用荧光和化学发光检测仪检测荧光素酶活性并进行分析，相对启动子荧光素酶活性=萤火虫荧光素酶活性/海肾荧光素酶活性。
1.2.2 荧光素酶活性检测SCAP与SCD启动子的量效关系乳腺上皮细胞接种于24孔板，将pGL3-SCD3质粒瞬时转染细胞，进行不同的转染处理分组：对照组(2.0 μg pcDNA3.1)，SREBP1组(1.0 μg pcDNA3.1+1.0 μg SREBP1)，SCAP(0.1)组(0.1 μg SCAP+0.9 μg pcDNA3.1+1.0 μg SREBP1)，SCAP(0.5)组(0.5 μg SCAP+0.5 μg pcDNA3.1+1.0 μg SREBP1), SCAP(1.0)组(1.0 μg SCAP+1.0 μg SREBP1质粒)，作用24 h后，收集细胞进行启动子活性检测，采用回归分析检测SCAP质粒含量与SCD基因启动子活性之间的量效关系。
1.2.3 免疫荧光观察SREBP1蛋白在细胞核的表达在24孔板中加入细胞爬片后接种培养乳腺上皮细胞，进行不同的转染处理分组：对照组(Control，转染1.0 μg pcDNA3.1 +1.0 μg SREBP1)，SCAP组(SCAP，转染1.0 μg SCAP+1.0 μg SREBP1质粒)，培养12 h后用PBS漂洗3次，多聚甲醛固定后用PBS漂洗，室温脱脂奶粉封闭2 h后，c-myc(9E10)一抗(1：500)4 ℃孵育过夜，PBS漂洗后用绿色荧光标记的驴抗鼠IgG二抗(1：1 000)37 ℃孵育1 h，进行免疫荧光标记，PBS漂洗后，DAPI复染细胞核，封片后在激光共聚焦显微镜下观察细胞核中SREBP1的荧光表达情况。
1.2.4 荧光定量PCR检测SCD基因mRNA的表达将乳腺上皮细胞经过胰酶消化后分散到12孔板中培养，进行不同的转染处理分组：对照组(转染1.0 μg pcDNA3.1)，SCAP组(转染1.0 μg SCAP质粒)，SREBP1组(转染1.0 μg SREBP1质粒)，SCAP+SREBP1组(转染1.0 μg SCAP+1.0 μg SREBP1质粒)，培养48 h后Trizol提取RNA，反转录成cDNA。在NCBI上搜索奶牛SCD基因序列(NM_173959)，并用Primer3 Plus设计荧光定量引物(表 1)，以cDNA为模板，利用SYBR Green扩增荧光定量PCR检测SCD基因mRNA的表达。同时以牛UXT基因(NM_001037471)作为内参基因，利用相对定量法计算不同处理对SCD基因mRNA表达的倍数差异。
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表 1 荧光定量PCR引物 Table 1 Primers used for quantitative real-time PCR analysis |
试验数据采用SPSS10.0软件进行统计学分析，Sigmaplot作图，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001。
2 结果 2.1 奶牛乳腺上皮细胞中SCAP对SCD启动子转录的影响由图 2可知，在乳腺上皮细胞中转染pGL3-SCD2启动子后，与对照组相比，SREBP1组和SCAP组的SCD2启动子活性值有所下降，而SCAP+SREBP1组SCD2启动子活性值显著下降(P＜0.05)。在转染pGL3-SCD3启动子的乳腺上皮细胞中，与对照组相比，SCAP组对启动子活性无显著影响，SREBP1组启动子活性值极显著升高到114.53 (P＜0.01)，SCAP+SREBP1组启动子活性值极显著升高到192.81(P＜0.001)，并且SCAP+SREBP1组与SREBP1组之间SCD3启动子活性值也达到极显著差异(P＜0.01)。
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图 2 SCAP对SCD基因启动子活性的影响 Figure 2 Effect of SCAP on promoter activity of SCD gene |
由图 3可知，与对照组转染pcDNA3.1相比，转染SREBP1组启动子活性值为55.66 (P＜0.01)，随着SCAP质粒含量的增加，SCD基因启动子活性值从64.41(SCAP= 0.1 μg)增加到169.07(SCAP=1.0 μg)，回归分析发现，SCAP质粒浓度与SCD基因启动子活性呈极显著的量效关系(P＜0.01)。
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Control. 2.0 μg pcDNA3.1;SREBP1. 1.0 μg pcDNA3.1+1.0 μg SREBP1;SCAP(0.1). 0.1 μg SCAP+0.9 μg pcDNA3.1+1.0 μg SREBP1;SCAP(0.5). 0.5 μg SCAP+0.5 μg pcDNA3.1+1.0 μg SREBP1;SCAP(1.0). 1.0 μg SCAP+1.0 μg SREBP1 图 3 SCAP调控SCD基因启动子活性的量效关系 Figure 3 Dose-response relationship between SCAP and SCD promoter activity |
由图 4可知，对照组乳腺上皮细胞核中只有少量SREBP1表达绿色荧光，与DAPI染的细胞核蓝色融合(Merge)后主要呈现蓝色。转染SCAP组细胞核中SREBP1绿色荧光表达明显增多，与DAPI重叠后呈现出融合的青光。
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SCAP(-). 1.0 μg pcDNA3.1 +1.0 μg SREBP1;SCAP(+). 1.0 μg SCAP+1.0 μg SREBP1 图 4 SCAP对SREBP1核蛋白表达的影响 600× Figure 4 Effect of SCAP on the nuclear SREBP1 expression 600× |
由图 5可知，与对照组相比，SCAP组细胞中SCD基因的表达量无明显变化。SREBP1组显著上调1.23倍(P＜0.05)，SCAP+SREBP1组显著上调1.54倍(P＜0.05)，而SREBP1组与SCAP+SREBP1组SCD基因表达相比差异不显著(P=0.21)。
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图 5 SCAP与SREBP1对乳腺上皮细胞SCD基因mRNA表达的影响 Figure 5 Effects of SCAP and SREBP1 on mRNA expression of SCD in mammary epithelial cells |
SREBPs是一种调控脂代谢的转录因子，通过包含两个跨膜序列的中心结构域锚定在内质网膜上，其N端结构域是碱性环-螺旋-亮氨酸拉链结构，能够结合靶基因启动子上的增强子序列以激活转录，这些增强子序列被称为固醇应答元件(SRE)[13-14]。本研究前期构建的SCD基因启动子序列，SCD3启动子比SCD2启动子多的36 bp片段中含有SRE序列(图 1)，转染SREBP1后发现SCD3启动子的活性显著升高，这符合SREBP1能够结合在基因启动子SRE上促进转录的性质，其他研究也发现过表达SREBP能够促进SCD基因的转录[15]。SREBP的蛋白活性受到多种分子的调控[16]，其中包括SCAP蛋白[17]。研究表明，采用siRNA沉默小鼠SCAP基因后发现其肝的SREBP信号通路及下游靶基因表达受到抑制[18]。本试验在转染SCAP+SREBP1质粒时发现，SCD3启动子的活性比单独转染SREBP1的活性显著升高，结合SCAP质粒的浓度与SCD3启动子活性呈现出的量效关系，表明SCAP作为SREBP1的结合蛋白，能够增强SREBP1促进SCD基因转录的作用。
SCAP作为SREBP的相互作用蛋白，其调控作用主要体现在SCAP能够通过与SREBP结合转运其到高尔基体进行水解，进一步释放SREBP进入细胞核[19-20]。在SCAP基因敲除的MA10细胞中重新转染SCAP质粒，能够显著增加核SREBP蛋白的表达[7]。本研究采用免疫荧光观察发现，SCAP组的细胞核内有更多的SREBP1蛋白表达(图 4)，表明SCAP增强了SREBP1前体蛋白向核的转运，相应的也会增加下游靶基因的转录，与本研究中SCD基因启动子的结果相互印证(图 2、图 3)。C.M.Cheng等[21]通过免疫荧光发现，在葡萄糖刺激下增加细胞SCAP的表达，也能够提高SREBP在细胞核的表达。SREBP1作为调控奶牛乳腺细胞中脂肪合成的主要转录因子[22]，在乳腺细胞中转染SREBP能够增加脂类基因的表达[23-24]。为进一步验证SCAP及SREBP对SCD基因表达的作用，本研究在乳腺细胞中分别转染这两种质粒，结果发现，SREBP1能够显著上调乳腺细胞SCD基因的表达，这与在羊乳腺上皮细胞中的研究结果相一致[25]，同时发现，SCAP+SREBP1组也能够显著上调细胞中SCD基因的表达，并且其倍数高于SREBP1组。虽然SCAP+SREBP1与SREBP1组之间统计分析差异不显著，但这一结果也佐证了SCAP能够促进SREBP1对于SCD基因的调控作用。
X.Gong等[26]采用晶体衍射法发现，在裂殖酵母SCAP蛋白C端有7个WD重复序列形成的结构域，在与SREBP的C-端结合以促进SREBP前体蛋白转运过程中发挥重要作用，因此进一步研究奶牛等反刍动物SCAP蛋白结构和功能的关系，对于阐明乳腺细胞脂肪合成调控机制具有重要意义。
4 结论本研究发现，SCAP可以通过增加SREBP1蛋白在细胞核中的表达，促进对SCD基因的转录激活作用，为深入阐明奶牛乳腺细胞中SCAP-SREBP1通路对乳脂肪合成的表达调控机制提供了理论基础。
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