2. 中国动物卫生与流行病学中心, 青岛 266032;
3. 河北出入境检验检疫局技术中心, 石家庄 050051;
4. 江苏省农业科学院兽医研究所, 南京 210014;
5. 河北农业大学动物医学院, 保定 071001
, ZHANG Zhi2, GU Wen-yuan1, LIU Tian-ju1, LI Chong1, WANG Jian-chang3, LI Bin4, YUAN Wan-zhe5, WANG Yu-qing1, HAN Qing-an1
2. China Animal Health and Epidemiology Center, Qingdao 266032, China;
3. Inspection and Quarantine Technical Center, Hebei Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shijiazhuang 050051, China;
4. Institute of Veterinary Medicine, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China;
5. College of Veterinary Medicine, Hebei Agricultural University, Baoding 071001, China
猪病毒性腹泻是猪场常见疾病之一，主要病原是猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(porcine transmissible gastroenteritisvirus, TGEV)和猪轮状病毒(porcine rotavirus, PoRV)。这三种腹泻病毒以单独或混合感染方式引起猪群呕吐、水样腹泻、脱水、逐渐消瘦等临床症状，对仔猪危害较大，可导致仔猪高死亡率，造成养猪业严重的经济损失[1-2]。自2010年以来，我国多省大范围暴发以严重腹泻和仔猪高死亡率为症状的猪腹泻病，在2011年和2012年最为严重，PEDV变异株的流行是导致此次疫情暴发的主要原因[3-4]。在河北地区，2010年开始暴发腹泻疫情，腹泻病高发时期在2011年至2012年间，与其他省份的报道基本一致，而在2013年河北省腹泻病发生率明显回落[5-7]。2013年后，河北省邻近地区腹泻病发生情况略有不同，山东省部分地区腹泻病呈现缓和态势[8-9]，而在山西、辽宁等地腹泻病仍呈现高发生率和高死亡率[10-11]。为摸清当前河北地区猪病毒性腹泻的流行状况和遗传变异规律，2016年4月至2017年2月，本研究采集河北省11个地市无害化处理厂、门诊部和屠宰场发病猪样品，进行PEDV、TGEV和PRoV的流行病学调查和PEDV S基因的遗传变异分析，为河北省猪病毒性腹泻的综合防控提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 流行病学调查和样品采集2016年4月至2017年2月期间，通过对河北省11个地市的无害化处理厂和门诊部送检的1 855例患猪病例进行背景分析，腹泻发病猪180例。对腹泻发病猪采集小肠组织或小肠内容物用于后续检测。
1.2 主要试剂与设备Taq DNA聚合酶、dNTPs购自上海生工科技有限公司；磁珠法病毒DNA/RNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；猪传染性胃肠炎病毒/流行性腹泻病毒/轮状病毒三重核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)购自中山大学达安基因股份有限公司。
组织研磨仪购自德国Qiagen公司；核酸提取仪购自赛默飞世尔生物科技公司；四通道荧光PCR仪购自西安天隆科技有限公司。
1.3 样品处理和检测方法取腹泻病料小肠组织样品或肠内容物加1 mL PBS制成组织匀浆，反复冻融3次；5 000 r·min-1离心5 min，取200 μL上清液进行核酸提取。按荧光PCR检测试剂盒说明书配制反应体系并加入模板，利用荧光PCR仪，参照试剂盒说明书设定扩增程序进行荧光RT-PCR，待扩增结束后按说明书进行结果判定。
1.4 PEDV S基因引物的设计与目的片段扩增以PEDV流行株AJ1102株为参考模板，利用Oligo 6.0软件设计三对用于扩增PEDV S基因的引物(表 1)，利用RT-PCR对9份来源不同的PEDV阳性病料扩增S基因，经测序拼接后获得完整的S基因序列。
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表 1 PEDV S全长基因扩增序列 Table 1 The primers used for amplification of PEDV S gene |
PCR产物胶回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；将胶回收产物送上海生工科技有限公司进行测序。
1.6 测序结果分析通过BioEdit将所克隆获得的S基因与GenBank上发表的33条国内外PEDV S基因推导氨基酸序列进行比对分析(表 2)。利用MEGA 7.0程序软件的邻位相接法(Neighbor-joining法)进行系统进化树的构建，并以Bootstrap值验证进化树的可信度。利用NetNGlyc 1.0 Server对S蛋白糖基化位点进行预测。
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表 2 PEDV参考毒株信息 Table 2 Representative PEDV strains used in this study |
对全年送检的1 855例患猪病例进行统计分析，其中腹泻病例共180例，占全年总送检病例的9.70%。对腹泻病样品检测结果进行统计，发现25份病料有PEDV检出，检出率为13.89%；9份病料有PoRV检出，检出率为5.00%；TGEV仅在3份病料中检出，检出率为1.67%(表 3)。对河北地区11地市检出结果进行分别统计，结果显示，各地市PEDV和TGEV检出情况与河北省基本一致，但少数地市PoRV的检出率偏高(图 1)。综合以上结果表明，当前PEDV仍是引起河北地区猪群腹泻病的主要病毒性病原。
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表 3 河北地区腹泻相关病毒检测情况 Table 3 The positive rate of PEDV, TGEV and PoRV |
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图 1 河北省11地市腹泻相关病原调查结果 Figure 1 Investigation of diarrhea related pathogen from Hebei province |
对腹泻病样品按猪年龄分类进行结果统计，结果显示，PEDV在仔猪和育肥猪中均有较高检出率，在仔猪中检出率最高，可达19.28%；TGEV和PoRV则在育肥猪中检出率最高，分别达6.90%和13.79%(表 3)。
对腹泻病样品按采样点来源进行结果统计，结果显示，PEDV在无害化处理厂检出率高达30.00%，而TGEV和PoRV没有检出；另外，PEDV和PoRV在门诊部均有一定检出，检出率分别为17.60%和6.40%，TGEV检出率仅为1.60%(表 3)。
在全年所检样品中，PEDV和TGEV发生率均在寒冷的冬春季节最高，在盛夏季节发生率最低；而PoRV发生率在春夏、夏秋季节变换时最高，在盛夏和深冬发生率较低(图 2)，表明在河北地区，春冬季节仍是病毒性腹泻病原多发季节，而夏季较少发生。
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图 2 不同月份腹泻相关病原调查结果 Figure 2 Investigation of diarrhea related pathogen collected from different months |
在检出腹泻相关病原的样品中，PEDV单独感染率最高，达54.70%，PoRV单独感染率为22.11%，TGEV单独感染率为10.54%。在所检测具有腹泻相关病原的样品中，PEDV和TGEV共感染率为5.91%，PEDV和PoRV共感染率为6.17%，TGEV和PoRV共感染较少发生，共感染率仅为0.51%(图 3)。所检样品中未发现3种腹泻相关病原共感染情况。以上结果表明，PEDV引起的腹泻疾病主要以单独感染为主。
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图 3 腹泻相关病原混合感染情况 Figure 3 Investigation of diarrhea related pathogen of single infection and co-infection |
S蛋白被认为是PEDV关键毒力蛋白，其遗传变异往往造成毒株毒力改变[12-13]。本研究选取来源不同的9份PEDV病料对S基因进行扩增并进行测序，得到9株PEDV S基因序列，并上传至GenBank(登录号：MG132631~MG132639)。经相似性比较分析，发现本研究所获得的9条S基因核苷酸序列相似性为96.8%~100.0%，推导氨基酸序列相似性为96.4%~100.0%。与GenBank上发表的33条国内外PEDV S基因推导氨基酸序列构建遗传进化树(图 4)，发现进化树主要分为G1、G2和INDELs三支，本研究所获得的9条S基因全部位于G2上。G2这一大支又可以分为G2a和G2b小支，本研究所获得的9条S基因序列中，HB1601(MG132631)和HB1603(MG132632)株位于G2b分支，与美国流行毒株遗传关系较近；HB16123(MG132637)、HB16134(MG132638)和HB16135(MG132639)株位于G2b分支，与中国流行毒株遗传关系较近；HB1604(MG132633)和HB1605(MG132634)株以及HB1619(MG132635)和HB1622(MG132636)株位于G2a分支，与当前国内外流行毒株遗传关系较远。
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图 4 河北地区PEDV毒株S基因氨基酸序列遗传进化树 Figure 4 Phylogenetic analyses of PEDV strains based on the amino acid sequences of S gene |
将所得到的S基因与PEDV变异毒株AH2012进行氨基酸序列比对，发现所测9条S基因氨基酸序列均有多处突变。其中，处于G2b分支上的毒株突变位点较多，达38~39个；处于G2a分支上的毒株与CV777相似突变位点较多，达14个(表 4)。此外，HB1601和HB1603在382—383位氨基酸(TY)发生独特缺失，HB1619和HB1622株在234—236位有三个独特氨基酸插入(SAW)(表 4)。经NetNGlyc 1.0 Server软件预测AH2012株S蛋白有67处潜在糖基化位点，其中29处为NXT/S糖基化位点。对所获得的9条S基因氨基酸序列进行糖基化位点预测，发现多条S基因序列因氨基酸突变导致缺失或引入预测糖基化位点，其中HB1601株缺失一处预测NXT/S糖基化位点，HB16123、HB16134和HB16135株增加两处预测糖基化位点，HB1604和HB1605株分别增加一处预测糖基化位点(表 4)。与33株参考序列相比，所获得9条S基因氨基酸序列均发生多处独特氨基酸突变，其中HB1601、HB1603、HB1605、HB16123、HB16134和HB16135株在S蛋白核心抗原展示区域均有独特突变发生(表 4)。
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表 4 河北省PEDV S基因突变位点分析 Table 4 Sequence analysis of mutant amino acid sites of PEDV S gene from Hebei province |
PEDV、TGEV和PoRV是引起猪腹泻病的主要病毒性病原，均以腹泻症状为主要临床特征，难以区分。河北地区自2010年开始暴发猪群腹泻病，在2011年和2012年疫情最为严重，2013年疫情趋于稳定[7, 14]。本研究对2016年2月至2017年4月河北地区送检临床样品进行发病情况统计和PEDV、TGEV和PoRV病原学检测。调查结果显示，当前河北省猪群腹泻病发生率较2010—2013年有明显缓解。不同于国内南方地区全年腹泻病均呈高发态势[6, 15-18]，春冬季节为河北地区病毒性腹泻病多发季节。通过对腹泻病料调查，发现PEDV仍是腹泻病的主要病毒性病原，同时还发现少数地区正在流行PoRV，甚至个别地区PoRV是腹泻病的主要病原，这提示PoRV在河北省大面积流行的风险正在提高。
2011—2015年间，全国各地PEDV流行毒株以引起仔猪高发病率和高死亡率为主要特征，在保育猪和育肥猪中检出率较低[19-20]。本研究中，PEDV引起猪群腹泻病以单独感染为主，其在腹泻病样品中检出率较之2010—2013年均显著降低，但在育肥猪腹泻病料中有较高的检出率。母源抗体是保护猪群尤其仔猪抵抗PEDV感染的重要途径，然而其抗体水平往往受病毒感染滴度影响[21-22]。本研究中，河北地区育肥猪的高感染率提示成年猪分泌抗体水平较之2010—2013年可能显著提高，进而增强对猪群免疫保护能力，降低河北省猪群整体PEDV感染率。
PEDV S蛋白是病毒发生环境适应的关键蛋白，其遗传变异通常与病毒毒力相关，在分析流行毒株的流行趋势和遗传变异中具有重要的进化意义[23]。2010年来，全国多地报道PEDV流行毒株S蛋白与经典毒株变异较大，且分别进化形成多种不同分支[24-27]。Y. Y. Gao等通过对S蛋白遗传进化分析发现2010年后华北猪场中流行的PEDV毒株与韩国来源毒株进化关系较近[23]。本研究中，所获得9条PEDV S蛋白氨基酸序列同源性为96.4%~100.0%。遗传进化分析表明，河北省PEDV S蛋白分处于G2亚群中的2个不同进化分支，均与疫苗株CV777遗传关系较远。其中HB1601和HB1603株与美国分离株亲缘性较近，HB16123、HB16134和HB16135与国内其他地区分离株亲缘性较近，HB1604、HB1605株和HB1619、HB1622株分处的G2a分支则与当前国内外流行毒株遗传关系较远，表明，河北地区流行的PEDV优势毒株可能发生了改变，多种毒株并存。
PEDV S蛋白是Ⅰ型糖蛋白，有27~30个潜在的糖基化位点，这些糖基化位点往往与病毒毒力相关[13, 27]。其在S1区N端包含1个信号肽(l~18 aa)，在S1和S2膜外域编码4个抗原表位(499—638、748—755、764—771和1 368—1 374 aa)，其中499—638 aa为诱导中和抗体产生的核心区域，亦称为COE抗原区域[28-29]。T. Sato等将PEDV在细胞上连续传代致弱，发现S蛋白信号肽、S1和S2膜外区的氨基酸突变是造成毒株毒力减弱的关键因素[30]。本研究对9株PEDV S蛋白氨基酸序列分析，结果显示与国内流行毒株AH2012相比，9株S蛋白氨基酸序列均发生多处突变，部分突变位点与CV777疫苗株相同。同时，与33株参考序列相比，9株S蛋白氨基酸序列在S蛋白膜外区均发生多处独特性突变，表明PEDV S蛋白在河北地区的进化方向具有多样性，其是否影响S蛋白毒力和抗原性尚不得而知。其中，HB1601和HB1603在382—383 aa缺失两位氨基酸(TY)，HB1619和HB1622在234—236 aa插入三位氨基酸突变位点(SAW)，这一插入缺失特征目前尚未有报道。通过生物信息学软件分析发现，在HB1601、HB16123、HB16134、HB16135、HB1604和HB1605株中一些位点突变的发生可能会引起S蛋白糖基化位点失活或引入，推测这些位点突变有可能导致S蛋白毒力改变。此外，与33株参考序列相比，G2a分支和G2b分支S蛋白在COE区分别发生两处和三处独特性突变，这些突变可能会影响COE诱导中和抗体能力，改变毒株抗原性。综上，河北地区PEDV S基因进化分支较多，S蛋白的多种独特突变可能导致PEDV流行毒株毒力和抗原性改变，这一推测有待进一步研究证实。
4 结论2016年河北地区腹泻发生率较以往有所下降，PEDV对仔猪的感染情况有所缓解，而对育肥猪感染率较高。PEDV S基因氨基酸序列分析表明，河北省PEDV流行毒株分布在G2群中的2个进化分支，部分毒株发生独特氨基酸突变。
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