胰高血糖素样肽-2(Glucagon-like peptide-2，GLP-2)是由33个氨基酸组成，肠L内分泌细胞分泌的一种肠上皮特异性生长因子，其分泌受肠道营养素[1]和营养水平[2]的调控。GLP-2的功能包括促进肠道发育、增强肠道屏障功能、增加血液流量及抗炎症作用等[3]，而其中最主要的功能就是特异性地促进肠黏膜生长与损伤后修复[4]。大量研究发现，GLP-2可通过抑制隐窝细胞凋亡、促进隐窝细胞增殖来增加绒毛高度和隐窝深度，从而刺激小肠上皮的生长和发育[5]。对断奶仔猪肠上皮细胞的研究发现，低剂量的二肽基肽酶Ⅳ能够促进GLP-2对细胞增殖、代谢和细胞完整性的作用效果[6]。
基于GLP-2在维持其他物种(人、猪、大鼠和小鼠等)肠道稳态中的重要作用，近年来人们开始重视GLP-2在反刍动物肠道发育中的作用。但相较人及单胃动物上的研究，GLP-2在反刍动物上的研究才刚刚起步。较早的研究发现，在代乳料和开食料中添加丁酸钠可以提高犊牛颈静脉血浆中GLP-2的浓度[7]。近年来有研究在奶牛所有胃肠道组织都检测到胰高血糖素GCG(GLP-2的前体物质)及GLP-2受体(GLP-2R)，尤其在小肠细胞中高度表达，证实了在反刍动物胃肠道中同样存在GLP-2信号系统，同时也发现，日粮能量水平的增加可提高小肠GLP-2的分泌量，从而促进小肠的发育，并提高葡萄糖转运载体GLUT-2的表达量[8]。本实验室前期研究发现，皮下注射GLP-2可以促进犊牛小肠黏膜的生长及血液的流通[9]。近年来的研究结果也证实，GLP-2可作为药物通过改善小肠黏膜细胞自我更新来缓解犊牛腹泻[10]。最新研究进展表明，甜味素可以通过刺激GLP-2分泌从而促进犊牛小肠上皮的生长发育[11]。基于以上研究背景可以看出，GLP-2系统存在于反刍动物肠道中，并且其可促进其肠道发育，但其中所涉及的分子机制并不清楚。
单胃动物上的大量研究表明，GLP-2与小肠上皮的GLP-2R结合，刺激IGF-1的分泌，接着IGF-1结合IGF-1R，激活相应的信号通路，通过调节细胞周期蛋白和相应的蛋白激酶来加快细胞周期进程，促进细胞增殖[12]。反刍动物同样存在GLP-2系统，但其促进小肠发育的机制是否与单胃动物一致并不清楚。因此，本研究采用体外注射GLP-2试验，对羔羊小肠上皮Cyclins、CDKs、GCG、GLP-2R、IGF-1和IGF-1R mRNA表达进行研究。研究结果将对深入认识GLP-2调节羔羊小肠发育的分子机制具有重要意义。
1 材料与方法 1.1 试验设计与动物饲养试验选择10只体况良好，胎次一致，体重相近的新生羔羊(湖羊)，随机分为两组，每组5只。GLP-2组按50 μg·kg-1BW，每天分2次皮下注射GLP-2，间隔12 h, 连续注射14 d。对照组注射相应体积的0.5%牛血清白蛋白(BSA)生理盐水，注射时间同GLP-2组。牛血清白蛋白按1:200的比例溶解在生理盐水中，配置成0.5%的BSA生理盐水溶液，GLP-2溶解于0.5%的BSA生理盐水溶液(0.4 mg·mL-1)，现配现用。GLP-2由南京肽业生物科技有限公司合成，BSA购自南京建成生物有限公司。10日龄时，羔羊开始自由采食开食料、苜蓿(18.09%粗蛋白, 26.06%粗纤维)和燕麦草(10.05%粗蛋白, 28.71%粗纤维)。试验期间，自由哺乳和饮水，每周最后一天于晨饲开食料前称量羔羊体重。羔羊28日龄时，对照组和GLP-2组分别皮下注射BSA和GLP-2。试验开始前，两组羔羊的体重没有显著差异((6.18±0.47) kg vs. (5.80±0.26) kg, P=0.504)。试验开食料参考NRC(2007)[13]建议的绵羊羔羊饲养标准配制，开食料组成及营养水平见表 1。
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表 1 开食料组成与营养水平(干物质基础) Table 1 Ingredient and nutrient levels of the starter diet (dry matter basis) |
羔羊42日龄时，第一次注射2 h后进行屠宰，屠宰前用含40单位肝素钠的采血管采集颈静脉血，于4 ℃ 3 000 r·min-1离心15 min后收集血浆，之后将其储存在-20 ℃，待测血常规。屠宰后立即收集有代表性的瘤胃内容物(至少200 mL)，四层无菌纱布过滤后立即测定pH，同时取过滤后的瘤胃液10 mL, 分装于2个5 mL的离心管，-20 ℃保存，待测挥发性脂肪酸(VFA)浓度。屠宰后5 min之内，将消化道分离称量各器官重(瘤胃、瓣胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠)，采集十二指肠、空肠及回肠组织在冰的磷酸盐缓冲溶液(PBS)里清洗3次，将其组织剪成0.5 cm × 0.5 cm的小碎块装在2 mL的冻存管里置于液氮中保存，用于后续RNA的提取。
1.3 羔羊瘤胃及血液生理参数测定用便携式pH计(HI 9024C; HANNA Instruments，美国)当场测定瘤胃液pH。利用气相色谱仪(GC-14B, 岛津, 日本; 毛细管柱: 30 m×0.32 mm×0.25 mm膜厚度)测定挥发性脂肪酸(VFA)浓度，具体步骤参照秦为琳[14]的方法(柱温为110 ℃，汽化室温度为180 ℃，检测器为180 ℃)。血浆葡萄糖浓度采用葡萄糖试剂盒(上海荣盛生物药业)，利用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法测定。血浆GLP-2浓度根据GLP-2荧光酶免疫试剂盒(Phoenix Europe GmbH，德国)操作说明测定。血浆葡萄糖和GLP-2试剂盒的测量范围分别是3.89~6.11 mmol·L-1和0~10 000 pg·mL-1。
1.4 羔羊小肠上皮RNA的提取和cDNA的合成取100 mg小肠上皮组织置于研钵中，倒入液氮快速充分研磨，按照Trizol试剂(TaKaRa，日本)的使用说明提取小肠上皮组织总RNA。提取的总RNA使用Nano Drop分光光度计检测RNA的浓度和纯度。所有样品的吸收比例(OD260 nm/OD280 nm)都为1.8~2.0，证明RNA纯度较高。用1.4%的琼脂糖胶检测RNA的完整性。将所有RNA浓度调整到1 μg·μL-1，置于－80 ℃冰箱保存备用。用含基因组RNA酶的反转录试剂盒(PrismScript RT reagent kit with gDNA Eraser(TaKaRa，日本))进行cDNA的合成。
1.5 引物的合成和实时定量PCR利用Q5 Real-time PCR仪(Applied Biosystems，美国)对目的基因及内参基因GAPDH进行定量，GAPDH 引物序列参照文献[15]，实时定量PCR分析所用引物采用Primer 5.0软件设计，由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列见表 2。用SYBR® Premix Ex Taq TM(TaKaRa，日本)试剂盒进行定量。反应条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环；95 ℃，15 s；60 ℃ 1 min；95 ℃，15 s。反应体积20 μL：10 μL SYBR Premix Ex Taq，0.4 μL ROX Reference Dye II, 10 μmol·L-1上下游引物各0.4 μL，2 μL样品cDNA，6.8 μL无菌水。所有样品设3个重复。目的基因的相对表达量以管家基因GAPDH作为内参进行校正，数据分析采用2-△△CT的方法。
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表 2 本研究中所用引物序列 Table 2 Sequences of primer used in this study |
结果以“平均值±标准误(means±SE)”表示。数据采用SPSS 20.0中的独立样本t检验进行显著性分析。采用GraphPad Prism 6.01 (www.graphpad.com)软件分析目的基因的mRNA表达量。P < 0.05表示差异显著。
2 结果 2.1 注射GLP-2对羔羊体重的影响如图 1所示，与对照组相比，GLP-2组羔羊出生重(P=0.947)、7日龄重(P=0.809)、14日龄重(P=0.845)、21日龄重(P=0.704)、28日龄重(P=0.504)、35日龄重(P=0.306)和42日龄重(P=0.224)无显著变化。
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图 1 注射GLP-2对羔羊体重的影响 Figure 1 The effect of GLP-2 injection on body weight of lambs |
如表 3所示，与对照组羔羊相比，GLP-2组羔羊空肠重(P=0.083)和回肠重(P=0.060)有升高的趋势，而瘤胃湿重(P=0.906)、瘤胃干重(P=0.585)、瓣胃湿重(P=0.804)、瓣胃干重(P=0.464)、十二指肠重(P=0.272)、盲肠重(P=0.540)及结肠重(P=0.295)无显著变化。
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表 3 注射GLP-2对羔羊器官重量的影响(n=5) Table 3 Effects of GLP-2 injection on organ weight of lambs(n=5) |
如表 4所示，与对照组羔羊相比，GLP-2组羔羊显著升高了血浆GLP-2浓度(P=0.025)；GLP-2组羔羊瘤胃pH(P=0.624)、总VFA浓度(P=0.331)、乙酸浓度(P=0.169)、丙酸浓度(P=0.427)、丁酸浓度(P=0.164)、其他VFA浓度(P=0.970)、乙丙酸比(P=0.855)及血浆葡萄糖浓度(P=0.842)相对于对照组没有显著变化。
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表 4 注射GLP-2对羔羊瘤胃发酵和血液参数的影响(n=5) Table 4 Effects of GLP-2 injection on rumen fermentation and blood parameters of lambs(n=5) |
如图 2A所示，与对照组相比，GLP-2注射显著升高了十二指肠上皮Cyclin B1(P=0.001)、Cyclin D1(P=0.044)、CDK1(P=0.028)及CDK6(P=0.016)的mRNA表达，而Cyclin A、Cyclin E1、CDK2和CDK4的mRNA表达没有显著变化(P>0.05)；GLP-2组空肠上皮Cyclin A(P=0.028)、Cyclin B1(P=0.016)、CDK1(P=0.013)、CDK4(P=0.023)和CDK6(P=0.028)mRNA表达显著高于对照组，而Cyclin D1、Cyclin E1、CDK2的mRNA表达没有显著变化(P>0.05)；GLP-2注射显著升高了回肠上皮Cyclin A(P=0.025)、Cyclin D1(P=0.001)、CDK2(P=0.013)、CDK4(P=0.020)的mRNA表达，而Cyclin B1、Cyclin E1、CDK1及CDK6的mRNA表达没有显著变化(P>0.05)。
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图 2 注射GLP-2对羔羊小肠上皮细胞周期蛋白和GCG、GLP-2R、IGF-1和IGF-1R mRNA表达的影响 Figure 2 The effect of GLP-2 injection on mRNA expression of small intestinal epithelial cell cycle proteins and GCG, GLP-2R, IGF-1, IGF-1R of lambs |
如图 2B所示，与对照组相比，GLP-2注射显著升高了十二指肠上皮GCG(P=0.036)和IGF-1R(P=0.031)，空肠上皮GCG(P=0.049)、IGF-1(P=0.027)、IGF-1R(P=0.036)和GLP-2R(P=0.011)，回肠上皮GCG(P=0.025)、IGF-1(P=0.029)、IGF-1R(P=0.029)及GLP-2R(P=0.032)的mRNA表达；但对十二指肠上皮IGF-1(P=0.712)和GLP-2R(P=0.227)的mRNA表达没有显著影响。
3 讨论本研究发现，皮下注射GLP-2并没有影响羔羊的体重，与C.C.Taylor-Edwards等[9]在犊牛上的研究结果一致。这可能是由于试验动物采食相同的日粮，能量摄入相同导致的。但相对于注射前，注射GLP-2后羔羊体重增加加快，一方面可能是由于GLP-2的作用，另一方面可能是受日龄增长的影响。本研究发现，GLP-2并没有影响羔羊除小肠以外其他胃肠道的重量。C.C.Taylor-Edwards等[8]在牛前胃组织中检测到GCG和GLP-2R mRNA的表达较低，但在小肠组织中表达较高。皮下注射GLP-2可能会使GLP-2经过血液循环到达瘤胃，但由于瘤胃上皮缺乏GLP-2R的介导，无法启动相应的下游通路，因此没有影响羔羊瘤胃发育。同时发现，GLP-2注射也没有显著影响羔羊瘤胃发酵，这可能与两组羔羊采食相同的日粮有关。本研究中一个有趣的发现是，GLP-2注射对羔羊空肠和回肠重量有增加的趋势，这与在非反刍动物中的发现类似[16]。这种增加可能是由于小肠隐窝细胞的增殖导致绒毛高度、隐窝深度和黏膜层的增加。GLP-2诱导小肠黏膜生长在非反刍动物中已有很多依据[17]，而在反刍动物中的研究相对较少。
基于上述结果，本研究发现GLP-2注射对羔羊小肠重量有增加的趋势，接下来，我们将进一步研究GLP-2促进羔羊小肠发育的分子机制。单胃动物上的许多研究表明，GLP-2具有促进肠黏膜生长发育，肠上皮隐窝细胞增殖的作用[18-19]，而小肠上皮细胞增殖又与细胞周期的变化密切相关。细胞周期的推进主要受细胞周期蛋白(Cyclins)及其相关激酶(Cyclin dependent protein kinases, CDKs)的调控。细胞周期包括静止期(G0期)、分裂间期(G1期、S期和G2期)和有丝分裂期(M期)[20]。研究发现，CyclinD1与CDK4或CDK6形成的复合物对于G1阶段至关重要[21]，而G1阶段是真核生物细胞分裂周期中的关键步骤。本试验中，GLP-2处理显著升高了十二指肠上皮CyclinD1、CDK6的mRNA表达水平，空肠上皮CDK4及CDK6的mRNA表达水平和回肠上皮CyclinD1、CDK4的mRNA表达水平。这可能是由于注射GLP-2上调了小肠上皮CyclinD1、CDK4和CDK6的基因表达，使细胞周期G1期持续时间缩短，从而推进细胞周期进程，促进肠上皮细胞增殖。CyclinA在S和G2/M阶段扮演着重要角色[22]。在S期，CyclinA-CDK2复合物通过关键DNA复制因子的磷酸化驱动染色体复制[23]。本研究中，GLP-2注射促使空肠上皮CyclinA和回肠上皮CyclinA、CDK2基因表达上调，这可能是GLP-2促进了细胞周期过程中DNA复制。注射GLP-2使十二指肠上皮和空肠上皮CyclinB1和CDK1基因表达上调。据报道，哺乳动物CyclinB1-CDK1复合物在G2后期发挥着重要作用[24]。CyclinE1-CDK2可以促进细胞周期由G1期进入S期[25]，但本试验中两组小肠上皮的CyclinE1 mRNA的表达水平并没有显著差异。在一定程度上，小肠上皮细胞周期基因mRNA表达变化并不能完全反映细胞周期进程变化。因此认为，CyclinA、CyclinB1、CyclinD1、CDK1、CDK4和CDK6是与肠道发育相关的重要基因。GLP-2可能通过上调这些基因的表达，加速细胞周期进程，促进小肠的发育。
GLP-2的生物活性不仅与分泌量有关，也与血液中活性GLP-2的比例有关。本研究发现，体外注射GLP-2，升高了血浆GLP-2浓度，这表明体外注射GLP-2可能诱导了羔羊自身GLP-2的分泌。此外，外源GLP-2注射可提高羔羊小肠上皮GCG、GLP-2R的mRNA表达量，表明外源注射的GLP-2可能通过血液循环到达小肠，激活小肠GLP-2前体物质(GCG)及其受体(GLP-2R)的表达。对小鼠的研究表明，GLP-2R主要在肠道的皮下肌成纤维细胞而非隐窝细胞表达[26]，这就暗示，GLP-2促进肠道隐窝细胞增殖可能需要其他生长因子的介导。之后一系列的研究结果也进一步证实了以上假说。当敲除小鼠的IGF-1R基因后，GLP-2促进小肠隐窝细胞生长的作用被完全消除[27]。皮下肌成纤维细胞体外培养试验也发现，在培养基中添加GLP-2使得IGF-1的分泌量显著增加[28]。以上结果证实，GLP-2刺激小肠隐窝细胞的增殖需要通过IGF-1介导[3]。本研究发现，注射GLP-2使羔羊十二指肠上皮IGF-1R，空肠和回肠上皮IGF-1、IGF-1R的mRNA表达上调。这可能是当GLP-2与GLP-2R结合后，促进了羔羊小肠上皮IGF-1的表达和分泌，这和P.E.Dube等[27]的研究结果一致。J.Jasleen等[29]报道，在体外试验中，GLP-2处理肠上皮细胞系可以促进细胞周期蛋白A和D1的表达。E.E.Connor等[30]发现，牛的小肠中细胞周期蛋白D1和GLP-2R的表达呈正相关。许多研究证实，IGF-1能够诱发CyclinD1表达的上调，之后与相应的细胞周期依赖蛋白激酶CDK4和CDK6形成复合物而启动细胞增殖[31-32]。但是，IGF-1与IGF-1R结合后，必须通过相关的信号转导途径将细胞外信号转导至细胞内，才能发挥其调节细胞周期的功能。外源GLP-2注射导致羔羊小肠上皮IGF-1及IGF-1R表达上调，并且与小肠上皮细胞周期蛋白表达变化一致。这一结果暗示，GLP-2调节羔羊小肠上皮细胞周期的作用可能与IGF-1信号通路存在一定关联。研究结果将对深入认识GLP-2调节羔羊小肠发育的分子机制具有重要意义。
4 结论皮下注射GLP-2对羔羊体重、胃肠道各器官重量和瘤胃内环境都没有显著影响，但空肠重和回肠重有增加的趋势，同时，升高了血浆中GLP-2浓度，促进了小肠上皮发育相关基因的表达。本研究结果表明，外源注射GLP-2可促进羔羊的小肠发育。
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