2. 兰州联邦饲料有限公司, 兰州 730060
2. Lanzhou Federal Feed Limited Company, Lanzhou 730060, China
饲料间组合效应(Associative effective，AE)是指来自不同饲料来源的营养物质、非营养物质及抗营养物质间互作的整体效应[1-2]。当饲料的整体互作使饲粮内某养分的利用率或采食量指标高于各个饲料原料单项数值的加权值时，为“正组合效应”；若饲粮的整体指标低于各个饲料原料数值的加权值，为“负组合效应”；若二者相等，为“零组合效应”。饲喂反刍动物的饲料间的组合效应在精饲料和粗饲料之间表现得最明显。在精粗比完全一致的前提下，组合效应仍有很大的不同。研究组合效应的方法分为体外试验、体内消化代谢试验和动物试验3种[3]。自K.H.Menke等[4]发现气体产量同有机物消化率高度相关以来，体外产气法被众多学者应用于不同种类的饲料间组合效应研究。饲粮精粗比是决定瘤胃发酵特征的主要因素之一。给生产水平较高的动物饲喂典型饲粮，当其采食量受到自身因素的限制而需用精料补充料的添加来满足其能量需要时，就有可能发生饲料间负组合效应。王加启和冯仰廉[5]发现精料和粗料的负组合效应点为精粗比大于70%。A.T.Dolebo等[6]通过将不同精料水平下不同干草来源组合成的饲粮饲喂波尔山羊羯羊试验，评估出一种能预测饲料间负组合效应的方法。孟庆翔和熊易强[7]发现，精料占日粮的比例为20%~60%时对日粮干物质的消化率无显著影响。在中国，各种秸秆可收集利用总量为68 595×104 t, 平均可收集系数为0.81；残留田间和收集过程中浪费的秸秆占19%。其中，适宜加工饲喂的秸秆为58 764×104t，占85.67%[8]。农作物秸秆普遍存在着含氮量低、采食量少、消化性差、可利用能低等缺陷，单独饲喂仅能满足维持需要，严重制约着反刍动物生产水平的提高，限制了农作物秸秆的广泛应用。为此，研究人员提出给饲喂农作物秸秆的家畜补饲优质牧草苜蓿可以提高其利用率。
本试验运用体外产气法研究在不同精粗比(70:30、60:40、50:50、40:60、30:70、20:80)和不同水平苜蓿(0、10%、20%、30%)下，与小麦秸/氨化小麦秸分别配比后，各饲粮配方样的组合效应。
1 材料与方法 1.1 试验材料小麦秸(Wheat straw, WS)、苜蓿干草来源于甘肃临洮县；氨化小麦秸(Ammonium bicarbonate treated wheat straw，ABWS)由本试验中小麦秸制作而成；精料补充料购于兰州联邦饲料有限公司。
ABWS制作方法：按每千克小麦秸(按干物质计)，尿素用量40 g，以适量水溶解尿素后均匀喷洒在小麦秸上(使麦秸含水量为45%)，密封25 ℃贮存20 d。
精料补充料配方组成：玉米84.87%，豆粕7.32%，棉籽粕3.66%，食盐1.71%，预混料2.44%。
1.2 试验设计本试验共设6个精粗比(Concentrate:Roughage, C:R)(70:30、60:40、50:50、40:60、30:70、20:80)和4个苜蓿水平(Alfalfa)(0%、10%、20%、30%)。精料补充料为精料部分，小麦秸/氨化小麦秸与苜蓿干草为粗饲料部分。即精料补充料:小麦秸:苜蓿干草共24个饲粮组合，精料补充料:氨化小麦秸:苜蓿干草共24个饲粮组合，本试验共48个饲粮组合。具体饲粮配方样见表 1。
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表 1 由小麦秸或氨化小麦秸基础料和添加不同比例的精料补充料组成的饲粮配方 Table 1 The mixtures of WS or ABWS basal diets supplemented with different levels of alfalfa and the concentrate |
人工唾液按K.H.Menke和H.Steingass[9]的方法配制，配方：400 mL蒸馏水+0.1 mL微量元素溶液(A)+200 mL缓冲液(B)+200 mL常量元素溶液(C)+1.0 mL刃天青溶液(D)，用CO2气体饱和并升温至39 ℃后，加40 mL还原液(E)，继续通入CO2，直至溶液由淡蓝色转变为无色。人工唾液中A、B、C、D、E各溶液配方：A.微量元素溶液：13.2 g CaC12·2 H2O+10.0 g MnC12·4 H2O +1.0 g CoCl2·6 H2O +8 g FeC13·6 H2O，加蒸馏水溶解，定容至1 000 mL；B.缓冲溶液：4.0 g NH4HCO3 +35 g NaHCO3，加蒸馏水溶解，定容至1 000 mL；C.常量元素溶液：5.7 g Na2HPO4(无水)+6.2 g KH2PO4 (无水)+0.6 g MgSO4·7 H2O，加蒸馏水溶解，定容至1 000 mL；D.指示剂溶液：0.1%(W/V)刃天青溶液，即100 mg刃天青溶解于100 mL蒸馏水；E.还原剂溶液(现配现用)：4.0 mL(1 mol·L-1) NaOH+625 mg Na2S·9 H2O +95 mL蒸馏水。体外发酵培养液配制：将瘤胃液与人工唾液按1:2的体积比混合，搅拌均匀即可。
1.3.2 瘤胃液供体动物及其饲养试验动物为3只装有永久性瘤胃瘘管的青年小尾寒羊，体重(30±5) kg。饲喂饲粮精粗比为30:70，即小麦秸秆700 g·d-1和精料补充料300 g·d-1。每天喂料两次(08:00和16:30)，自由饮水。在早饲前抽取3只瘘管羊的瘤胃液，混合后经4层纱布过滤至预热处理过的收集瓶，置于39 ℃恒温水浴箱中保存，连续通入CO2，待用。
1.3.3 各饲粮组合体外产气培养程序准确称取待测饲料样品约200 mg(干物质基础)，置于体外产气管中，加入始终用CO2气体饱和的微生物培养液30 mL，排出注射器中气体，用胶管和夹子封住注射器前端，记录下产气管活塞的初始刻度读数(mL)。在39 ℃恒温水浴锅上放上自制72孔有机玻璃支架，将注射器头朝下插入支架孔中培养(水浴锅水面高度必须要淹没注射器内培养液高度)分别培养各饲料组合和4种饲料原料2、4、6、9、12、24、36、48、72、96 h。每个饲料组合3个重复。每批样品培养时做3个空白样，记录注射器活塞的位置读数(mL)，并记录培养过程中空白管以上10个时间点的产气量(Gas production，GP)。在每次产气管读数后，均需两手掌相对转动注射器，起到震荡器的作用以模拟瘤胃运动。某时间点的GP(mL)=该段时间样品GP-对应时间段内空白管GP。
1.4 测定项目和方法 1.4.1 饲料常规营养水平按常规法(AOAC)[10]测定小麦秸、氨化小麦秸、苜蓿干草、精料补充料的干物质(Dry matter，DM)、粗蛋白质(Crude protein，CP)、粗脂肪(Ether extract，EE)和粗灰分(Ash)含量，按P.J.Van Soest等[11]方法测定中性洗涤纤维(Neutral detergent fiber，NDF)含量。
1.4.2 体外GP测定2、4、6、9、12、24、36、48、72、96 h的GP。GPt=200×(Vt－V0) /W，式中，t为发酵开始后的某一时间(h)；GPt为样品在t时刻的产气量(mL)；Vt为样品发酵t小时后培养管刻度读数；V0为样品在开始培养时空白培养管刻度读数；W为样品干物质重(mg)。
1.4.3 产气参数计算利用‘fit curve’软件(MLP；Lawes Agricultural Trust)，根据E.R.Фrskov和I.McDonald[12]的产气模型公式将各种样品在2、4、6、9、12、24、36、48、72、96 h时间点的GP代入，计算消化动力参数。模型公式：GP= a+b(l-exp(-ct))，式中，t为发酵开始后的某一时间(h)；a为快速产气部分；b为缓慢产气部分；c为b的产气速度常数；a+b为潜在产气量; exp(-ct)是指e的(-ct)次方。
1.4.4 各饲粮组合效应的估算饲粮组合效应=(实测值—加权估算值)×100/加权估算值，式中，实测值为实际测定的样品产气量(mL)，加权估算值=精料补充料实测值×精料补充料配比(%)+ WS(ABWS)的实测值×WS(ABWS)配比(%)+苜蓿实测值×苜蓿配比(%)。
1.5 数据分析采用SPSS 16.0软件，使用ANOVA分别对数据进行单因子方差分析，差异显著时采用Tukey法进行多重比较，P < 0.05为差异显著，P < 0.01为差异极显著，P>0.05为差异不显著。
2 结果 2.1 试验用饲料原料的营养水平及产气参数由表 2可见，ABWS比WS的CP和EE含量分别增加了247.3%和85.9%；NDF含量降低。小麦秸、苜蓿和精料的a值均为负值，说明3种饲料均存在产气滞后效应。
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表 2 试验饲粮营养成分及产气参数 Table 2 Nutrients and in vitro gas parameters of trial diets |
固定精粗比时，比较不同苜蓿水平下小麦秸基础日粮中各产气指标，单因子方差分析结果(表 3)，对于GP24 h，C:R为70:30时，20%苜蓿组极显著高于其他3组(P < 0.01)，10%、30%组极显著高于0组(P < 0.01)；C:R为40:60时，10%、20%、30%组显著高于0组(P < 0.05)。对于潜在产气量(a + b)值，C:R为70:30时，20%、30%、10%组极显著高于0组(P < 0.01)。对于缓慢产气速度常数c，C:R为50:50时，30%组显著高于其他3组(P < 0.05)；C:R为40:60时，30%组极显著高于0、10%、20%组(P < 0.01)，20%组显著高于0组(P < 0.05)；C:R为30:70时，30%组极显著高于0组(P < 0.01)，10%、20%组显著高于0组(P < 0.05)。对于AE，C:R为70:30时，20%组极显著高于30%、10%、0组(P < 0.01)，30%组极显著高于10%、0组(P < 0.01)，10%组极显著高于0组(P < 0.01)；C:R为50:50时，30%组极显著高于10%组(P < 0.01)，显著高于0组(P < 0.05)；C:R为40:60时，30%组极显著高于0组(P < 0.01)，10%、20%组显著高于0组(P < 0.05)。
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表 3 小麦秸基础料中补饲不同比例苜蓿体外培养后的产气参数及24 h产气量的组合效应 Table 3 Gas production characteristics and AE at 24 h in vitro batch incubation when WS basal diet supplemented with different levels of alfalfa |
固定精粗比，比较不同苜蓿水平下氨化小麦秸基础日粮中各产气指标，单因子方差分析结果(表 4)，对于GP24 h，C:R为70:30时，30%苜蓿组极显著高于0组(P < 0.01)，10%组显著高于0组(P < 0.05)；C:R为60:40时，10%组显著高于30%组(P < 0.05)；C:R为50:50时，20%、10%、0组极显著高于30%组(P < 0.01)。对于(a + b)值，C:R为70:30时，10%组显著高于30%组(P < 0.05)；C:R为40:60时，10%、20%、0组极显著高于30%组(P < 0.01)，10%、20%组显著高于0组(P < 0.05)；C:R为20:80时，0、30%组显著高于20%组(P < 0.05)。对于c值，C:R为50:50时，0组极显著高于30%组(P < 0.01)，10%、20%组显著高于30%组(P < 0.05)；C:R为40:60时，10%组极显著高于20%、30%组(P < 0.01)，0组显著高于20%、30%组(P < 0.05)；C:R为20:80时，20%组极显著高于0组(P < 0.01)。对于AE，C:R为70:30时，30%、10%组显著高于0组(P < 0.05)；C:R为60:40时，10%组显著高于30%组(P < 0.05)；C:R为50:50时，10%、20%、0组极显著高于30%组(P < 0.01)；C:R为40:60时，0组显著高于20%组(P < 0.05)。
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表 4 氨化小麦秸基础料中添加不同水平苜蓿体外培养的产气参数及24 h产气量的组合效应 Table 4 Gas production characteristics and associative effect at 24 h in vitro batch incubation when ABWS basal diet supplemented with different levels of alfalfa |
在小麦秸基础日粮中，C:R为70:30时，20%苜蓿组AE值为14.09%，30%组为3.50%；C:R为60:40时，20%组AE为1.90%；C:R为50:50时，30%组AE为5.67%，20%组为2.02%；C:R为40:60时，30%组AE为5.60%。其他18个组合的AE值均为负值。6种精粗比，0、10%组均为负AE值；在C:R为30:70、20:80时，0、10%、20%、30%组的AE值均为负值。说明小麦秸基础日粮中，较高水平(30%、20%)苜蓿补饲更易发生正组合效应。在24个氨化小麦秸饲粮组合中，有8个组合是负AE，16个组合为正AE。说明氨化小麦秸中补饲苜蓿比小麦秸中补饲苜蓿更易产生正AE，且高精粗比(70:30、60:40、50:50)时，10%苜蓿组(13.43%、16.46%、10.80%)AE较大。本试验结果表明，氨化小麦秸(10%)比小麦秸(30%、20%)需要更少比例的苜蓿，就可以达到正组合效应，更有利于节约优质的苜蓿干草。原因可能是氨化处理提高了小麦秸含氮量，降低了中性洗涤纤维的含量。
卢广林等[13]研究了相同营养条件下肉牛秸秆型、苜蓿-秸秆型、青贮-秸秆型、苜蓿-青贮-秸秆型、黄贮-秸秆型、黄贮-苜蓿-秸秆型6组饲粮瘤胃体外发酵的AE，结果发现，发酵参数变化显著不同，进一步证实了反刍动物饲粮中饲料营养价值的非加性。这与本试验中WS和ABWS中补饲不同水平苜蓿表现出不同的AE值结果一致。孟梅娟等[14]采用体外产气法评价小麦秸与米糠粕按100:0、75:25、50:50、25:75、0:100的比例组合发现，从产气量、干物质降解率、AE看，最优组合是75:25；从纤维降解率AE看，最优组合是25:75。张勇等[15]用体外产气法评价油菜秆与玉米、豆粕不同组合的AE发现，当油菜秆:玉米:豆粕为55:30:15时，瘤胃发酵效率最高，正AE值最大，为最优组合。王典等[16]给5月龄白萨杂交母羊饲喂精料:全株玉米青贮料:马铃薯淀粉渣-玉米秸秆混合青贮料分别为40:60:0、40:45:15、40:30:30、40:15:45，结果表明，马铃薯淀粉渣-玉米秸秆混合青贮料能替代75%的全株玉米青贮料，与精料组合后产生了正AE值。上述孟梅娟等[14]、张勇等[15]、王典等[16]研究结果与本研究中WS、ABWS与苜蓿、精料补充料配比后产生正AE结果一致。崔占鸿等[17]发现，青贮玉米秸秆与苜蓿青干草以25:75，青贮玉米秸秆与燕麦青干草以50:50，苜蓿青干草与燕麦青干草以25:75或50:50组合时AE较大。王志军等[18]研究苜蓿、沙打旺、高丹草、狼尾草和黑麦草间的组合效应，依据MFAEI原理，从6种饲草组合筛选出2个最优组合:A组为苜蓿:沙打旺:狼尾草=40:40:20，MFAEI为1.13；B组为苜蓿:沙打旺:高丹草=40:40:20，MFAEI为1.21。吕永艳等[19]报道，将苜蓿干草、青贮玉米秸和羊草分别按100:0、80:20、60:40、40:60、20:80、0:100两两组合，结果表明，用MFAEI综合评价时青贮玉米秸-苜蓿、青贮玉米秸-羊草、苜蓿-羊草3组依次按60:40、40:60、80:20组合时能产生最大正AE。以上研究均表明，优质牧草苜蓿与其他牧草、秸秆适当配比后，能产生正AE，这与本试验结果一致。
孙国强等[20]利用体外发酵法研究发现，全株玉米青贮:花生蔓为70:30和全株玉米青贮:花生蔓:羊草为56:24:20具有最大组合效应。孟梅娟等[21]利用体外产气法，研究了小麦秸与喷浆玉米皮、大豆皮、橘子皮和苹果渣分别按0:100、25:75、50:50、75:25、100:0组合48 h体外发酵发现，小麦秸与大豆皮、喷浆玉米皮的最优组合是75:25，小麦秸与橘子皮、苹果渣的最优组合是50:50。于腾飞等[22]将花生蔓分别与羊草、青贮玉米秸、全株玉米青贮和干玉米秸以0:100、20:80、40:60、60:40、80:20、100:0组合，发现，花生蔓与青贮玉米秸、干玉米秸和羊草均以20:80组合最优，花生蔓与全株玉米青贮以40:60组合最好。袁翠林等[23]将豆秸、花生秧和青贮玉米秸分别以0:100、20:80、40:60、60:40、80:20、100:0两两组合发现，豆秸与花生秧、青贮玉米秸均以20:80，花生秧与青贮玉米秸以60:40组合时综合组合效应指数均达到最大。刘丽英等[24]将玉米秸、苜蓿、燕麦草3种饲草按不同比例混合后体外发酵发现，玉米秸+苜蓿干草和玉米秸+苜蓿干草+燕麦草两个组合中，苜蓿的添加比例在30%以上时，体外发酵积累的pH、IVDOM、GP、TVFA及组合效应显著增加。以上研究表明，小麦秸或玉米秸与其他牧草或粗饲料配比后表现出正AE。这与本试验中小麦秸与适量苜蓿配比能达到正AE一致。
王法明[25]采用人工瘤胃持续发酵法研究发现，①青贮+羊草组合(90:10)，②青贮+苜蓿组合(85:15)，③青贮+羊草+苜蓿组合(70:5:25)，④青贮+羊草+苜蓿+玉米秸秆组合(80:5:10:5)，以上4个配方中体外发酵48 h的累积产气量为：④>③>②>①。高静等[26]采用体外法研究发现，苜蓿:番茄渣:玉米秸为30:10:60、苜蓿:玉米秸为0:50、苜蓿:番茄渣:小麦秸为30:20:50、苜蓿:小麦秸为60:40时的多项AE值最优。张吉鹍等[27]将稻草与苜蓿进行体外发酵发现，经改进的AE多项指标综合指数对稻草分别添补0、20%、40%、60%、80%、100%的苜蓿在12、24、48 h时的IMFAEI自高到低依次为苜蓿水平60%(1.271 1)、40%(1.260 3)、20%(0.826 5)、80%(0.633 3)。张锐等[28]等利用体外产气法评价苜蓿和羊草比例为20:80、40:60、60:40和80:20情况下的AE，测定发酵4、8、12、24、48、72 h的累积产气量，结果饲喂辽宁绒山羊苜蓿和羊草的最佳组合配比为60:40。本试验中，小麦秸基础日粮中，高精粗比(70:30、60:40、50:50)与高苜蓿水平(30%、20%)交叉的几个饲粮组合呈现正AE。氨化小麦秸需要搭配较低比例苜蓿(10%)，小麦秸需要搭配较高比例苜蓿(30%，20%)，才能达到较大AE值，本试验与以上研究结果一致。
4 结论 4.1高精粗比(70:30、60:40、50:50)的小麦秸基础日粮中，补饲30%与20%苜蓿的几个饲粮配方样呈现正组合效应。
4.2氨化小麦秸基础日粮补饲10%的苜蓿即可达到正组合效应，较小麦秸基础日粮补饲30%与20%的苜蓿达到正组合效应的比例少，更能节省苜蓿的使用量。
声明：该试验结论仅是体外试验结果，尚需经动物试验加以证实。
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