2. 中国农业科学院草原研究所, 呼和浩特 010010
2. Institute of Grassland Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Hohhot 010010, China
紫花苜蓿(Medicago sative L)为多年生豆科牧草，因其产量高、品质好、适应性强而被广泛种植，对我国北方草产业发展起到了举足轻重的作用[1-3]。我国北方地理位置和气候特殊，紫花苜蓿普遍存在越冬率低、根颈部易受冻害死亡的问题[4]。适度刈割会提高苜蓿越冬率，延长其青绿期。刈割过高会造成草产量的损失，刈割过低则会损伤根颈部，如何确定其适宜留茬高度，是摆在苜蓿生产面前的一道难题[5]。遭受低温胁迫时，根部会积累大量的脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖等，积累渗透调节物质含量不但可以降低植物细胞的水势，增强细胞持水能力，还会在植物返青时提供一定的能量和物质[6-8]；保护酶活性也是影响抗寒能力的因素，与越冬率有密切的关系[9-10]。
目前，有关根型、品种、播种方式等因素对苜蓿抗寒能力的影响已有大量研究[11-13]，但对苜蓿末茬不同留茬高度和抗寒能力之间关系的研究还鲜有报道。因此，本试验参照当地种植常用“金皇后”、“准格尔”、“WL323”3个苜蓿品种为材料，分析测定不同刈割留茬高度处理下根内渗透调节物质含量、细胞膜质过氧化和保护酶活性的变化，结合以上抗寒指标的变化趋势，采用隶属函数法对3个品种末茬不同刈割留茬高度处理的抗寒能力进行综合评价，为末茬苜蓿适宜留茬高度提供理论依据和技术支持。
1 材料与方法 1.1 试验区概况试验地位于内蒙古包头市九原区哈林格尔镇西南部，地理位置为110°37′~110°25′E，40°3′~40°15′ N。试验地北部与蒙古国东戈壁省接壤，南临黄河，东西接土默川平原和河套平原，阴山山脉横贯中部。试验地属半干旱中温带大陆性季风气候，全年风大雨少，年平均风速1.2 m·s-1，年降水总量421.8 mm。全年平均气温为7.2 ℃，7月份平均温度24.2 ℃，1月份平均温度－9.8 ℃，无霜期为170 d，年日照时数2 882.2 h。
1.2 试验设计“金皇后”、“准格尔”和“WL323”苜蓿种子均由内蒙古自治区草原站提供，3个苜蓿品种均为2012年5月20日种植，土壤类型相同，条播，播种量为12 kg·hm-2，播种前未施加任何底肥，播种后用机器镇压。人工除杂草，苜蓿返青期、现蕾期和入冬前分别灌溉1次，小区之间设置1 m保护带。所选苜蓿种植年限为3年，均按完全随机设计，小区面积为9 m2(3 m×3 m)。参照当地刈割技术，设置A0(0 cm)、A1(5 cm≥A1>0 cm)、A2(10 cm≥A2>5 cm)、A3(15 cm≥A3>10 cm)4个处理，3次重复。
1.3 取样和测定方法2015年8月20日进行最后一次刈割，参照当地苜蓿收获间隔(30 d左右)，于2015年9月至2016年4月，每月20日挖取试验材料根部，分析各项生理指标值。
参照酸性茚三酮法分析脯氨酸含量，参照考马斯蓝G-250染色法测定可溶性蛋白含量，参照蒽酮比色法测定可溶性糖含量，参照硫代巴比妥酸法测定丙二醛含量，参照高锰酸钾法分析过氧化氢酶活性，参照氮蓝四唑光化还原法分析超氧化物歧化酶活性[14]，3次重复。
1.4 数据分析利用Excel 2013和SAS 9.1处理软件进行数据分析。利用Fuzzy隶属函数法[13]进行综合评定，公式：
| $ S\left( {{X_{ijk}}} \right) = \frac{{{X_{ijk}} - {X_{\mathit{min}}}}}{{{X_{ijk}} - {X_{\mathit{max}}}}} $ |
式中，S(Xijk)为第i个品种第j个温度第k项指标的隶属度，Xijk第i个品种第j个温度第k项指标的测定值，Xmin、Xmax分别为所有测试材料中第k项指标的最小值和最大值。
2 结果 2.1 试验区季节温度变化如图 1所示，试验地日均最高、最低温度从10月开始下降，1月降至最低值，5月上升至最高值，试验地温度整体呈“V”型变化。1月日均最高温度在0 ℃以下，其他月份均在0 ℃或以上；日均最低温度从11月降至0 ℃以下，4月份温度上升至0 ℃以上。
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图 1 试验地温度变化 Figure 1 Temperature variation in experimental area |
由表 1可知，3个苜蓿品种不同留茬高度处理根内WSS含量均呈先升后降的变化趋势，9月开始各品种根内WSS含量上升，1月达到峰值；除3、4月份外，不同品种WSS含量多少依次为“准格尔”>“金皇后”>“WL323”，且基本上同一品种A3处理WSS含量均高于其他处理。2月气温回升，WSS含量仍较高，说明越冬期间苜蓿根内WSS含量维持在较高水平上。翌年4月天气回暖，WSS作为再生资源被利用，含量下降。
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表 1 3个苜蓿品种不同留茬高度根内可溶性糖含量 Table 1 Water soluble sugar contents in root of 3 alfalfa cultivars with different stubble heights |
由表 2可知，各处理根内Pro含量随气温变化呈先上升后下降的变化趋势。11月气温降至零摄氏度以下，各品种不同处理根内Pro含量受低温胁迫的影响上升，其中，Pro含量以1月20日“准格尔”A3处理最高，以9月20日“金皇后”A0处理最低。至翌年4月，温度回升，苜蓿返青，各品种不同处理Pro含量大幅度下降。
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表 2 3个苜蓿品种不同留茬高度处理根内脯氨酸含量 Table 2 Proline contents in root of 3 alfalfa cultivars with different stubble heights |
由表 3可知，各处理SP含量随温度变化呈先上升后下降的变化趋势。从9月开始，各品种SP含量开始上升，其中，“金皇后”各处理SP含量在12月20日升至最高，“准格尔”和“WL323”各处理SP含量在1月20日升至最高；进入翌年1月份，随着外界气温的回暖，各品种不同处理SP含量逐渐下降，在4月20日降至整个生育期最低值。
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表 3 3个苜蓿品种不同留茬高度处理根内可溶性蛋白含量 Table 3 Soluble protein contents in root of 3 alfalfa cultivars with different stubble heights |
由表 4可知，各处理SOD活性整体呈上升-下降-上升-下降或上升-下降的变化趋势。“金皇后”、“WL323”和“准格尔”各处理SOD活性分别在12月20日、1月20日和12月20日上升至最大，SOD活性最低值为4月20日各品种A0处理。
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表 4 3个苜蓿品种不同留茬高度处理根内SOD活性 Table 4 SOD activity in root of 3 alfalfa cultivars with different stubble heights |
由表 5可知，随着外界温度的降低，CAT活性呈先上升后下降的趋势。9月20日、10月20日和12月20日期间，同品种不同处理CAT活性不同，且不同处理间差异不显著(P>0.05)；11月20日，“金皇后”和“WL323”品种A0和A1处理的CAT活性差异不显著(P>0.05)，但与A2和A3处理差异显著(P < 0.05)，“准格尔”品种A1和A2处理的CAT活性差异不显著(P>0.05)，与A0和A3之间差异显著(P < 0.05)。翌年1~3月，各品种不同处理根内CAT活性降低，4月份降至最低。
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表 5 3个苜蓿品种不同留茬高度处理根内CAT活性 Table 5 CAT activity in root of 3 alfalfa cultivars with different stubble heights |
由表 6可知，各处理MDA含量整体上呈先降低后升高的变化趋势。“金皇后”品种A0和A1处理MDA含量在1月20日降至最低，且与同期A2、A3处理差异显著(P < 0.05)，A2和A3处理MDA含量在2月20日降至最低，与同期A0、A1处理差异显著(P < 0.05)。“准格尔”品种A0、A3和A1、A2处理MDA含量在分别2月20日和1月20日降至最低。“WL323”品种各处理MDA含量在11月20日降至最低，其中，A1和A3处理之间差异不显著(P>0.05)，与其他处理差异显著(P < 0.05)。
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表 6 3个苜蓿品种不同留茬高度处理根内MDA含量 Table 6 MDA contents in root of 3 alfalfa cultivars with different stubble heights |
牧草在遭受低温胁迫时，受多种因素交互作用，单一的以其中一种指标来判定这个生理生化反应过程，很难准确的反映牧草真正的抗寒能力。因此，利用隶属函数值法对各项指标定量转换后进行综合评价，综合评价值越高，说明其抗寒能力越强，反之则弱。低温环境下3个苜蓿品种不同留茬高度抗寒见图 2。
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图 2 3个苜蓿品种不同留茬高度处理抗寒能力综合评判 Figure 2 Comprehensive evaluation of cold-resistance of 3 alfalfa cultivars with different stubble heights |
由图 2可知，苜蓿品种抗寒能力顺强弱为准格尔>金皇后>WL323，留茬高度处理抗寒能力强弱为A3>A2>A1>A0。
3 讨论低温胁迫下，根内贮藏性物质含量是植物能否安全越冬的重要保障，已发现植物内其含量的积累与细胞渗透浓度有直接关系[11-12, 15]。本试验中，随着环境温度的降低，苜蓿根内Pro和WSS含量均不同程度增加，增强了细胞的渗透调节能力，一定程度上抑制了体内活性氧的过氧化作用，有效的降低了因过氧化作用对活性氧、膜脂和蛋白质的消耗[16-18]。SOD和CAT是苜蓿遭受外界环境胁迫时的保护酶[19]，在遭遇低温胁迫后其活性会增加，通过协同作用清除体内活性氧和自由基，对细胞起到了一定的保护作用[20-22]。第二年气温回暖，贮藏性物质含量减少，这是植物为了增加细胞保水能力而采取的一种保护措施；此时恰逢返青，物质和能量代谢加快，此阶段根内营养由库端变为源端[23]。
光合作用是牧草体内十分复杂的生理生化过程，牧草抗寒性也依赖于叶片光和效率的改善和光合速率的提高[24]。本试验证明，苜蓿不同留茬高度处理根内贮藏性物质含量不同，主要是由于适当的留茬可以增强苜蓿叶片的光合能力，维持高净光合速率时间较长，有利于光合产物的积累，说明苜蓿保持适当的留茬，可以诱导内部调节产生有利于抗寒能力提高的应激性反应[25]。留茬过低苜蓿叶片光合作用受到抑制，光合速率降低；而留茬过高容易造成苜蓿产量的降低。有研究表明，不同留茬高度处理根内贮藏性物质含量不同，通过适当的留茬可以提高牧草抗寒能力[26]，与本研究结果相同，因为叶量是苜蓿光能利用、干物质积累与分配、产量形成的重要基础，适当留茬为功能叶片提供了物质基础，叶片产生的有机物遭遇低温胁迫时由地上部分向根部输送碳水化合物，为根部越冬提供了物质和能量基础，减轻细胞膜在逆境下遭受的伤害，增强了细胞的保水和持水能力，表现为苜蓿越冬率提高[27-28]。
苜蓿的抗寒能力受本身遗传特性、生理构造及形态学指标的综合影响，不同苜蓿品种对低温胁迫的反应不同。因此，单纯的以某一种抗寒指标很难评价植物对寒冷的适应能力。隶属函数法是通过分析多种抗寒指标后，对植物抗寒能力做出的综合评价[29-30]。本试验利用隶属函数法对根内SOD、CAT活性和MDA、WSS、Pro、SP含量6项生理指标进行综合评价后，得出3个苜蓿品种抗寒能力强弱为准格尔>金皇后>WL323，这与陶雅等[31]的研究结果一致，说明不同苜蓿品种由于其生理结构的差异，导致其抗寒能力不同。同一苜蓿品种末茬不同留茬高度抗寒能力强弱为A3>A2>A1>A0。
4 结论在自然环境下不同苜蓿品种抗寒能力不同，本研究结果显示，3个苜蓿品种抗寒能力强弱为准格尔>金皇后>WL323，为了提高苜蓿抗寒能力，建议末茬留茬高度应为10~15 cm。
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