, PAN Yang-yang, YE Xiao-lin, LI Gu-yue, HE Hong-hong, WANG Meng, FAN Jiang-feng, CUI Yan, YU Si-jiu
牦牛是能够适应高寒低氧环境的珍稀物种，主要分布在我国青藏高原海拔3 000 m以上的地区，具有重要的经济价值，但其自然繁殖率低，限制了牧区的发展。在牦牛上应用辅助生殖技术(Assisted reproductive technology，ART)是提高其繁殖率的重要手段，而雄性牦牛提供高质量的精子是体外繁殖成功的前提。睾丸支持细胞(Sertoli cell，SC)是唯一与生精细胞(Germ cell，GC)直接接触的体细胞，其共同构成睾丸曲细精管。睾丸支持细胞结构上紧密相连构成了血-睾屏障(Blood-testis barrier，BTB)，为生殖细胞的发育提供独特的微环境[1]。睾丸支持细胞产生一系列蛋白质来调控垂体激素的释放，从而影响生殖细胞减数分裂的活性并促进精子的释放[2]，对生精过程起到至关重要的调控作用。成年雄性动物睾丸的大小、生殖细胞的数量以及精子质量与SC的数量直接相关[3]。
细胞周期蛋白(Cyclins)是调控细胞周期进程的一系列蛋白质。细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)高表达于细胞G1期，与细胞周期蛋白依赖性激酶4和6(Cyclin-dependent kinase4/6，CDK4/6)结合，形成Cyclin D1-CDK4/CDK6复合物，之后与磷酸化的视网膜母细胞瘤蛋白(Phosphorylation retinoblastoma protein，pRb)结合，使细胞由G1期进入S期，促进细胞周期进程。G1/S是细胞周期中重要的时间点，其决定细胞是否进行分裂增殖[4-5]。研究表明，Cyclin D1促进睾丸间质细胞的增殖并抑制其凋亡[6]。将小鼠胚胎干细胞中Cyclin D1基因的部分外显子用非编码序列替换，得到缺乏Cyclin D1蛋白的突变鼠，其在发育过程中表现出生殖障碍等多种症状[7]。胰岛素样生长因子-I(Insulin-like growth factor-I，IGF-I)是一种促生长因子，对生殖器官的功能起到重要的调控作用。IGF-I通过调控Bax和Bcl-2等凋亡相关基因，降低了卵丘细胞[8]、卵母细胞[9]和睾丸间质细胞[10]等的凋亡率，同时还提高精子在低温环境中的运动能力及冷冻复苏的活性[9, 11]。IGF-I显著提高牦牛冻精活性和体外授精胚胎的囊胚产量，并且降低了囊胚中细胞凋亡比率[12-13]。缺乏胰岛素受体(Insulin Receptor，InsR)和胰岛素样生长因子受体(Insulin-like growth factor Receptor，IGFR)的小鼠，睾丸支持细胞增殖率降低，从而导致精子产量降低，成年后睾丸的尺寸比正常鼠小75% [14]。IGF-I在维持与生殖相关细胞的正常生理功能方面发挥着重要作用，然而IGF-I是否调控睾丸支持细胞中周期相关蛋白的表达尚不清楚，牦牛Cyclin D1基因的克隆及生物信息学分析在国内外也尚未见报道。
本研究以牦牛睾丸支持细胞为研究对象，克隆牦牛Cyclin D1基因的CDS序列，并对其进行生物信息学分析；同时研究IGF-I对Cyclin D1在睾丸支持细胞中表达的影响。研究结果将为调控睾丸支持细胞的发育提供试验依据，为探索精子发生机制和提高精子质量奠定一定的理论基础。
1 材料与方法 1.1 主要仪器与试剂细胞培养箱(Thermo，美国)、PCR仪(Rio-Rad，美国)、荧光定量PCR仪(Applied Biosystems，美国)、倒置荧光显微镜(Olympus，日本)；DMEM/F-12、胎牛血清(Fetal Bovine serum，FBS)(Gibco)；胰蛋白酶、胶原蛋白酶、透明质酸酶、IGF-I(Sigma)；总RNA提取试剂盒(Omega)；反转录试剂盒、GoTaq Green Master Mix(Promega)；胶回收试剂盒(GenStar)；SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ、pMD 18-T Vector(TaKaRa)；Fasl多克隆兔抗、CyclinD1多克隆兔抗以及羊抗兔多克隆抗体(博奥森)。
1.2 样品采集及细胞培养与鉴定2016年10月在青海省西宁市乐家湾屠宰场，采取健康5~8月龄(此阶段为牛睾丸支持细胞的增殖分化期)牦牛的睾丸样品。获得样品后，将其放入生理盐水(含双抗)中，再置于冰盒密封，4 h内送到实验室，并对其进行处理。牦牛睾丸支持细胞的体外分离培养与鉴定参考M.D.Anway等[15]和H.Zhang等[16]的操作方法，采用两次酶消化法获得睾丸支持细胞，20 mmol·L-1 Tris-Hcl低渗处理和饥饿培养以纯化细胞，再用含10% FBS的培养液培养细胞，细胞生长至80%以上融合时，用0.25%的胰酶消化细胞，调整细胞密度为5×104·mL-1，爬片培养48 h，采用Fasl免疫细胞化学方法鉴定细胞。
1.3 引物设计根据GenBank中牛(Bos taurus)的CyclinD1和β-actin序列，利用Primer Premier 5.0软件设计牦牛的CDS序列扩增引物Cyclin D1-C、荧光定量检测引物Cyclin D1-Y和β-actin内参引物。引物序列送上海华大基因科技公司合成。引物序列详见表 1。
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表 1 目的基因和内参基因引物序列 Table 1 Primer sequences of target and reference genes |
当原代SC生长至80%以上融合时，提取细胞总的RNA，再反转录成cDNA，置于冰箱-20 ℃，保存备用。以cDNA为模板，Cyclin D1-C为引物进行PCR扩增。反应体系：cDNA 2 μL，上下游引物各0.5 μL，GoTaq Green Master Mix 10 μL，ddH2O 7 μL。反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环; 72 ℃ 5 min。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳，对目的条带进行胶回收，将纯化后的DNA与pMD 18-T Vector载体连接，转染到JM109感受态细胞，培养获得的菌液，送至上海生工生物工程公司进行测序。测序完成之后，将结果进行拼接，并对其进行生物信息学分析。利用NCBI在线软件Open reading frame finder(ORF Finder)对基因进行开放阅读框(Open reading frame，ORF)分析；利用MEGA7.0软件，采用邻接法(Neighbor-Joining)绘制系统进化树；利用DNAMAN对核苷酸和氨基酸的同源性进行分析。
1.5 细胞免疫荧光法对蛋白质表达进行定位选取纯化后的牦牛SC，将细胞密度调整为5×104·mL-1进行细胞爬片。培养48 h后，用4%多聚甲醛固定细胞，置于冰箱，4 ℃过夜；0.5%Tritonx-100透化1 h；1%BSA溶液室温封闭2 h；CyclinD1抗体稀释液(1:100)孵育细胞，冰箱4 ℃过夜；二抗稀释液(1:100)孵育细胞，室温2 h；5 ng·mL-1的DAPI染细胞核3 min；置于倒置荧光显微镜下拍照。每个步骤之间用PBS将玻片洗净，且二抗孵育后应避光操作。
1.6 qRT-PCR检测CyclinD1基因表达选取纯化后的牦牛SC，以1×105·mL-1的细胞密度接种于6孔板中，每孔接种2 mL细胞悬液，培养24 h(使细胞全部处于静止期)后，加入IGF-I，使其终浓度分别为0、25、50、100、150 ng·mL-1，每个浓度3个重复，24 h后提取细胞总RNA。IGF-I作用时间根据牦牛睾丸支持细胞分裂周期选取[16]。反转录后，将cDNA浓度调至200 ng·μL-1，通过qRT-PCR检测CyclinD1 mRNA的表达。反应体系：cDNA 1 μL，上下游引物各0.5 μL，SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ 10 μL，Rox Reference DyeⅡ 0.4 μL，ddH2O 7.6 μL，共20 μL。反应条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s, 60 ℃退火34 s，共40个循环。
1.7 Western blotting检测CyclinD1蛋白表达细胞培养及因子作用等与1.6中相同，提取细胞总蛋白。获得的蛋白质样品与蛋白上样缓冲液(4×)按3:1混合，置于100 ℃温箱中，煮10 min，使蛋白质充分变性；变性后的蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离；在300 mA恒定电流条件下，将凝胶上的目的蛋白转到PVDF膜上；用5%脱脂奶粉溶液，将膜封闭2 h；Cyclin D1抗体4 ℃孵育过夜；二抗常温孵育2 h；加电化学发光显色液(Electrochemi-luminescence, ECL)避光显色，X光片曝光，扫描蛋白条带。
1.8 数据分析采用SPSS21.0软件对Cyclin D1基因和蛋白的相对表达量进行单因素方差分析，相对表达水平为“平均值±标准误(X±SE)”表示。P > 0.05为差异不显著，P < 0.05为差异显著，P < 0.01为差异极显著。
2 结果 2.1 牦牛睾丸支持细胞培养与鉴定纯化培养获得原代牦牛SC(图 1 A)和三代SC(图 1 B)，均生长良好。Fasl免疫细胞化学法显示，Fasl蛋白在该细胞表达呈阳性(图 1 C)，阴性对照不表达(图 1 D)，由此可确定试验所用为纯度较高的牦牛睾丸支持细胞。
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A.原代SC；B.三代SC；C. Fasl阳性表达；D.阴性对照 A. The first generation of SC; B. The third generation of SC; C. Positive staining for Fasl; D. Negative control 图 1 牦牛睾丸支持细胞的培养和鉴定(标尺：100 μm) Figure 1 The cultivation and identification of the yak Sertoli cells (Scale bar: 100 μm) |
Cyclin D1-C进行RT-PCR扩增后，琼脂糖凝胶电泳显示，预期位置有明显荧光条带(图 2)。利用NCBI在线软件BLAST对拼接后的序列进行比对，Cyclin D1-C扩增产物序列与牛的CyclinD1(NM_001046273.2)序列为99%相似。将牦牛CyclinD1序列提交至GenBank，登录号为KY 420723。
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M. DL2000 DNA分子质量标准；1~2. Cyclin D1基因扩增产物 M. DL2000 DNA marker; 1-2. Cyclin D1 RT-PCR products 图 2 牦牛Cyclin D1基因的RT-PCR产物电泳结果 Figure 2 Agarose gels electrophoresis results of Cyclin D1 RT-PCR products |
ORF分析表明，该基因编码区长888 bp，起始密码子在8 bp处，终止密码子在895 bp处，编码295个氨基酸。系统进化树结果显示(图 3)，牦牛Cyclin D1基因与瘤牛、黄牛和水牛的亲缘关系最近，与山羊和绵羊次之，与人和猫的亲缘关系最远。同源性分析结果表明(表 2)：牦牛Cyclin D1核苷酸序列同源性与黄牛和瘤牛的最高，为99.9%；与人的最低，为92.2%。牦牛Cyclin D1氨基酸序列同源性与黄牛、瘤牛和水牛的同源性均为100%，与人的同源性为93.5%。
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图 3 Cyclin D1基因系统进化树 Figure 3 Phylogenetic tree of Cyclin D1 |
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表 2 牦牛和不同物种间Cyclin D1基因序列和氨基酸序列同源性比较 Table 2 Homologous comparisons of nucleotide and amino acids sequences of yak Cyclin D1 gene with that of other species |
细胞免疫荧光显示(图 4)，Cyclin D1蛋白在SC胞核上高表达，部分细胞核中呈强表达，在SC胞质上呈极微弱表达。
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A. Cyclin D1；B. DAPI；C.合成 A. Cyclin D1;B. DAPI; C. Merge 图 4 牦牛SC Cyclin D1蛋白表达免疫荧光技术检测(标尺：100 μm) Figure 4 The detection of Cyclin D1 protein on yak SC by immunofluorescence method (Scale bar: 100 μm) |
IGF-I作用于体外培养的SC，对获得的样品进行qRT-PCR分析，结果显示(图 5)：IGF-I浓度为25和150 ng·mL-1时，Cyclin D1 mRNA表达量与对照组差异不显著(P > 0.05)，前者表现促进，后者表现抑制；IGF-I浓度为50和100 ng·mL-1时，Cyclin D1 mRNA表达量显著高于其他各组(P < 0.05)，其中50 ng·mL-1组的表达量最高，为对照组的1.65倍。
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不同字母表示差异显著(P < 0.05)；相同字母表示差异不显著(P > 0.05)。下同 Different letters mean significant difference (P < 0.05); same letter means no significant difference (P > 0.05). The same as below 图 5 不同浓度IGF-I对Cyclin D1 mRNA表达的影响 Figure 5 Effect of different concentration of IGF-I on Cyclin D1 mRNA expression |
不同浓度IGF-I加入体外培养的SC，作用24 h，对获得的蛋白样品进行Western blotting，结果显示(图 6和7)：与对照组相比，IGF-I作用组的Cyclin D1蛋白的表达量均有提高，IGF-I浓度为100 ng·mL-1组蛋白表达量与对照组差异不显著(P > 0.05)，IGF-I浓度为25、50和150 ng·mL-1组蛋白表达量显著高于对照组(P < 0.05)，其中，50 ng·mL-1组的蛋白表达量最高，为对照组的1.20倍。
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1~5. 0、25、50、100、150 ng·mL-1 IGF-I 1-5.0, 25, 50, 100, 150 ng·mL-1 IGF-I 图 6 Cyclin D1和β-actin蛋白检测 Figure 6 The detection of Cyclin D1 and β-actin protein |
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图 7 不同浓度IGF-I对Cyclin D1蛋白表达的影响 Figure 7 Effect of different concentration of IGF-I on Cyclin D1 protein expression |
本研究成功克隆出牦牛Cyclin D1基因的CDS序列(GenBank登录号：KY 420723)。生物信息学分析显示，牛属动物Cyclin D1核酸序列同源性达到99%以上，氨基酸序列完全一致，与其他物种相比均有较高同源性，表明Cyclin D1基因在进化过程中具有保守性。Cyclin D1蛋白在细胞中呈周期性表达，于G1期表达量最高。异步生长的人成纤维细胞免疫荧光结果显示，Cyclin D1蛋白在绝大多数细胞中呈阳性表达，且定位于细胞核[17]。本研究中，用于免疫荧光检测的SC未做同步生长处理，其结果显示，绝大多数细胞核中高表达Cyclin D1蛋白，这与前人的研究结果一致，但胞核中Cyclin D1的荧光强度并不同，可能由于细胞处于周期进程中的不同阶段。
A. Dance等[18]通过细胞计数证明，IGF-I促进体外培养的牛SC数目增殖。本研究则从分子水平进行探究，分析不同浓度的IGF-I对牦牛睾丸支持细胞中Cyclin D1基因和蛋白表达的影响，结果显示：添加IGF-I后，Cyclin D1基因和蛋白的表达量总体上升，且具有剂量依赖性，表明IGF-I可以通过调控Cyclin D1的表达，促进SC周期进程，引起细胞增殖；但高浓度的IGF-I可能激活了抑制Cyclin D1表达的途径，在本研究中，IGF-I为150 ng·mL-1时，试验组Cyclin D1 mRNA表达量低于对照组(P>0.05)，可能与PI3K介导的胰岛素家族的负调控机制有关[19]。P.Ye等[20]研究发现，100 ng·mL-1的IGF-I作用于大鼠少突胶质细胞24 h，Cyclin D1 mRNA表达量为对照组的7倍；Y. Jiang等[21]发现，100 ng·mL-1的IGF-I作用于鼠系膜细胞，Cyclin D1蛋白表达量为对照组的1.6倍。在本研究中，IGF-I为100 ng·mL-1时，Cyclin D1 mRNA和蛋白的表达量分别为对照组的1.21和1.05倍。IGF-I作用于细胞时，首先与细胞表面的受体相结合，激活下游分子。研究显示，不同组织器官中IGF-I及其受体的含量[22-23]与活性[24]均不同。因此，以上差异可能与试验对象在机体内的位置及功能有关，提示生长因子对生殖器官的调控可能存在特异性。本研究中Cyclin D1基因和蛋白表达呈现一定差异性，可能是由于Cyclin D1蛋白表达过程受到多条信号通路的调控。目前研究表明，Cyclin D1至少存在两条转录后调控通路，即mTOR和/或PI3-p70S6通路和PI3 -eIF4E通路，它们可与Ras偶联，对Cyclin D1进行蛋白翻译水平的调控[25]。Ras是生长因子作用靶标，将刺激细胞生长的信号传递给下游分子，促进细胞周期进展[26]。同时，IGF-I还可以激活PI3K/Akt和MEK/ERK激酶途径，调控Cyclin D1的表达[27]。因此，Cyclin D1在SC上的表达可能受到多方面的调控。
雄性动物成年后，SC在体内不再进行增殖分化，雄性动物的生精质量在其成年之前就已决定[3]。SC的成熟障碍是多数雄性生殖障碍的根本原因，且SC的成熟障碍可能在出生之前就已经存在[28-29]。总结本研究及前人成果发现，IGF-I上调牦牛SC中Cyclin D1蛋白的表达，同时还可抑制多种生殖相关细胞的凋亡。因此，IGF-I可能通过促进牦牛SC周期进程，抑制其凋亡，从而促进SC的增殖和成熟，使其数量和质量维持正常。这对提高牦牛的生精能力及精子质量具有重要意义。
4 结论本研究成功克隆牦牛Cyclin D1基因(GenBank登录号：KY 420723)，生物信息学分析显示，其在进化过程中高度保守，Cyclin D1蛋白主要在SC胞核表达。IGF-I上调SC中Cyclin D1基因和蛋白的表达，具有剂量依赖性，最佳作用浓度为50 ng·mL-1。IGF-I可以通过影响SC中Cyclin D1的表达调控睾丸发育，从而影响雄性胚胎的生殖发育和成年动物的精子质量。
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