畜牧兽医学报  2018, Vol. 49 Issue (11): 2359-2370. DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2018.11.007    PDF    
转录组揭示禁水环境下双峰驼结肠组织适应机制
凌宇, 齐昱, 曹俊伟, 王申元, 周欢敏, 张焱如     
内蒙古农业大学生命科学学院, 呼和浩特 010019
摘要:旨在了解骆驼属在缺水条件下组织环境适应机制。本研究选取6峰6~9岁的成年阿拉善双峰驼,随机分为2组,第一组为对照组(colon1_3),正常采食饲料与水;第二组为禁水组(colon3),不给骆驼饮水,其他处理(饲草量)与对照组相同,禁水24 d。采用Illumina HiSeq 2000测序平台通过对禁水(试验组)与正常饮水(对照组)条件下双峰驼结肠组织进行转录组测序,并对转录组数据进行质控、比对、差异表达、GO和KEGG分析。结果显示,禁水组与对照组比较共获得差异表达基因2 122个,其中上调表达基因813个,下调表达基因1 309个。GO分析结果显示,禁水组下调表达基因最为显著富集的条目有30条,上调表达基因中未得到统计学意义的富集条目。KEGG富集分析显示,禁水组下调表达基因显著富集到剪接体、蛋白外排、内质网蛋白合成过程、RNA转运、核糖体合成、mRNA检测、RNA降解代谢途径;上调表达基因富集到的通路包含局部细胞黏连、溶酶体功能等。上述结果表明,禁水环境下,结肠组织下调表达基因多于上调表达基因,下调表达基因多参与RNA加工和蛋白质合成,这些功能有利于骆驼在缺水环境下,减少RNA的合成,降低结肠组织的代谢速率。
关键词双峰驼    结肠    转录组    水代谢    
Transcriptome Reveals the Adapting Mechanism of Colon Tissues of Bactrian Camel in Water-deficient Environment
LING Yu, QI Yu, CAO Jun-wei, WANG Shen-yuan, ZHOU Huan-min, ZHANG Yan-ru     
College of Life Sciences, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010019, China
Abstract: The aim of this study was to understand the mechanism of tissue environmental adaptation in the absence of water in Camelus. In this study, six 6-9 years old adult Alashan Bactrian camels were randomly divided into 2 groups, the first group was the control group (colon1_3), in which the animals were fed with normal feed and water, the second group was the no drinking water group (colon3), in which the animals were in the absence of water for 24 d, other treatment (forage) was the same as the control group. The Illumina HiSeq 2000 sequencing platform was used to sequence the transcriptome of Bactrian camel colon tissue in the control and no drinking water groups, and the transcriptome data were used to perform quality-controlled, alignment, differentially expressed, GO and KEGG analysis. The results showed that, compared with control group, a total of 2 122 differentially expressed genes were obtained in the no drinking water group, among which 813 genes were up-regulated and 1 309 genes were down-regulated. GO enrichment analysis results showed that 30 terms in the no drinking water group were significantly enriched by down-regulated expression genes. There was no statistically significant enrichment term by the up-regulated expression genes. The KEGG pathway analysis showed that the down-regulated expression genes in no drinking water group were significantly enriched in multiply pathways, including spliceosome, protein export, protein processing in endoplasmic reticulum, RNA transport, ribosome biogenesis in eukaryotes, mRNA detection, RNA degradation metabolic pathways. The up-regulated expression genes in no drinking water group were enriched in focal adhesion, lysosome function, and so on. The results of this study indicate that the number of down-regulated expression genes in colon are more than up-regulated expressed genes in water-deficient environments, and the functions of these down-regulated expression genes are mainly associated with RNA processes and protein synthesis pathways. These genes are favorable for camels to reduce the RNA synthesis and the metabolic rate of colon tissue in water-deficient environments.
Key words: bactrian camel     colon     transcriptome     water metabolism    

骆驼科现存的物种分别为双峰驼(bactrian camel)、单峰驼(arabian camel)、原驼(guanaco)、大羊驼(llama)、小羊驼(vicugna)、羊驼(alpaca)。其中骆驼属包含双峰驼和单峰驼。严苛的生存环境使得骆驼属进化出抗旱、抗病、耐粗饲、耐高温的特性,使骆驼成为蒙古高原的优势畜牧品种。目前,人们对骆驼的研究主要集中在骆驼属的进化历史,以及人工选择在骆驼遗传物质中留下的驯化痕迹,也发现双峰驼在长期进化中形成了胰岛素不敏感[1]。已有的转录组研究显示,骆驼肾能够很好的利用血液中高浓度的葡萄糖,维持肾细胞的高渗透特征,证明高浓度血糖对于双峰驼本身正常生理代谢是有利的[2],但针对于双峰驼耐旱的生理学特征的研究尚属空白。

动物在消化吸收过程中,小肠和胃等组织主要负责食物中特定氨基酸和矿物质的消化吸收。结肠作为消化系统的末端组织,承担着代谢产物存储与收集的任务。与小肠不同的是,结肠主要功能是吸收食物残渣中大量的水分,将废物残渣中最后的水分和盐回收。结肠对水吸收的机制是通过黏膜渗透压梯度进行的,梯度渗透是水逆肠内渗透梯度的重吸收。肠内壁的细胞将钠离子泵入细胞间隙,提高细胞间液的渗透压,这种高渗液体产生渗透压,通过紧密连接和相邻细胞的渗透将水驱入侧向细胞间隙,再穿过基膜进入毛细血管,同时钠离子再次泵入细胞间液中[3-4]。虽然水在每个单独的步骤中沿着渗透梯度下行,但总体而言,由于将钠离子泵入细胞间液中,水通常逆着渗透梯度行进运输。尽管与肠腔内的液体相比,毛细血管的血液是低渗的,但这允许大肠吸收水分。人类结肠约1.5 m长,每天吸收1.5 L水,对水分回收有着重要的作用。

尽管人们对于骆驼的水代谢能力有所了解,但目前尚未有研究揭示其水代谢的机制。本研究对极端缺水环境下的骆驼结肠进行基因表达测序与分析,为人们进一步探讨缺水环境下骆驼结肠的水适应方式提供基础数据及理论支持。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 试验动物处理与样品采集

选取6峰6~9岁的成年阿拉善双峰驼,随机分为2组,第一组为对照组(colon1_3),正常采食饲料与水;第二组为禁水组(colon3),不给骆驼饮水,其他处理(饲草量)与对照组相同,禁水24 d。

1.1.2 仪器与试剂

样品总RNA提取采用TaKaRa公司RNA提取试剂盒(TaKaRa RNAiso Plus 9108)。总RNA质控试剂盒为RNA nanoAssay(Agilent公司)。使用RNase Free Water溶解样品,检测试剂盒为RNA6000,检测仪使用Agilent 2100。

1.2 方法 1.2.1 组织RNA提取及RNA质量检测

分别采集6峰骆驼的结肠组织,置于液氮中充分研磨,按照TaKaRa公司RNA提取试剂盒说明书提取总RNA,提取总RNA样品经Agilent 2100检测仪检测,检测样品总量、RNA完整度以及OD值。

1.2.2 文库构建

样品检测合格后,poly A作为mRNA序列中的特征序列,以此特征来捕获组织中所有的mRNA,方法是用带有Oligo(dT)的磁珠富集双峰驼样本mRNA。随后加入片段缓冲液将mRNA打断成短片段,以mRNA为模板,用六碱基随机引物(random hexamers)合成一链cDNA,然后加入缓冲液、dNTPs和DNA polymerase Ⅰ合成二链cDNA,随后利用AMPure XP beads纯化双链cDNA。纯化的双链cDNA再进行末端修复、加A尾并连接测序接头,然后用AMPure XP beads进行片段大小选择,最后进行PCR富集得到最终的cDNA文库。

1.2.3 文库检测

测序文库构建完成后,先使用Qubit2.0进行初步定量,稀释文库至1 ng·μL-1,随后使用Agilent 2100对文库的插入片段大小进行检测,符合预期后,使用qPCR方法对文库的有效浓度进行准确定量(文库有效浓度>2 nmol·L-1),以保证文库质量。

1.2.4 测序与原始测序数据过滤评估

文库检测合格后,把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求,将各组中3峰动物取等量RNA混池后进行测序。测序获得原始数据,由于测得的碱基存在可能的错误,每个碱基测序错误率通过Q30进行过滤。同时GC含量分布检查用来评估有无AT、GC分离现象,判断是否在测序或文库构建过程中对碱基造成影响。本研究根据上述标准使用FastQC软件衡量测得的碱基质量。

1.2.5 参考序列比对

本研究的物种属于哺乳动物,所以选取使用软件TopHat2,参数mismatch为2,其余选用默认参数,选取NCBI已有双峰驼基因组,版本号Ca_bactrianus_MBC_1.0(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCF/000/767/855/GCF_000767855.1_Ca_bactrianus_MBC_1.0/GCF_000767855.1_Ca_bactrianus_MBC_1.0_genomic.fna.gz),基因组GFF文件(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCF/000/767/855/GCF_000767855.1_Ca_bactrianus_MBC_1.0/GCF_000767855.1_Ca_bactrianus_MBC_1.0_genomic.gff.gz)。将过滤后的测序序列进行基因组定位分析。

1.2.6 基因表达水平分析及差异表达分析

本研究采用HTSeq(v0.6.1),参数为-munion定量基因表达水平。获得基因表达量列表,采用TMM和DEGSeq(1.10.1)对基因进行差异表达分析,并根据|log2(Fold change)|>1,且q-value<0.005筛选显著差异表达基因。

1.2.7 差异表达基因GO富集分析

通过软件GOSeq对colon1-3与colon3比较得到的差异表达基因集合进行GO富集分析,基于GO数据库的功能,本研究对差异表达基因按照分子功能(molecular function)、生物过程(biological process)和细胞组成(cellular component)3个部分进行分类。显著富集的条件为校正P-value<0.05。

1.2.8 差异表达基因KEGG富集分析

本研究使用KOBAS(2.0)(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/download.php)进行pathway富集分析,由于pathway显著性富集分析以KEGG数据库中pathway为单位,应用超几何检验,找出与整个基因组背景相比,在差异表达基因中显著性富集的pathway,故将校正P-value<0.05作为条件来筛选显著富集通路。

2 结果 2.1 禁水组与对照组双峰驼结肠组织RNA提取质量检测

禁水组与对照组结肠组织提取RNA后,经Agilent 2100检测样品浓度、RNA完整度(RIN值)及28S:18S。禁水组与对照组的RNA总量分别为24.12和54.00 μg,大于10 μg,RIN值分别为8.6和8.1,均大于7,28S:18S均为1.5,可用于后续试验分析。

2.2 禁水组与对照组双峰驼结肠组织RNA测序数据统计分析

通过Hiseq 2000测序平台,本研究获得对照组结肠组织总片段数(clean reads) 51 533 346条,Q30为91.28%,GC含量为48.32%;禁水组结肠组织总片段数(clean reads)为50 771 578条,Q30为91.02%,GC含量为53.62%(表 1),测得的数据总量和质量合格。

表 1 对照组与试验组结肠RNA测序数据统计 Table 1 Sequencing data statistics of colon RNA of bactrian camel in the control and experimental groups
2.3 禁水组与对照组双峰驼结肠组织测得reads与参考基因组比对分析

将测得的reads与参考基因组进行比对,结果显示,禁水组结肠与参考基因组的总比对率为90.58%,单一位点比对率为89.08%;对照组与参考基因组的总比对率为92.48%,单一位点比对率为91.62%(表 2)。

表 2 样品与参考基因组比对 Table 2 Sample alignment to reference genome
2.4 禁水组与对照组双峰驼结肠组织基因表达定量及差异表达基因分析

本研究统计了各表达区间基因在禁水组与对照组中的分布情况,根据经验值RPKM大于1代表基因表达,本研究结果显示,对照组与禁水组表达基因数量分别为总量的69.29%和66.35%(表 3)。

表 3 不同表达区间基因数量统计 Table 3 Statistics of the number of genes in different expression intervals

本研究将|log2(Fold change)|>1且q-value<0.005设定为差异基因的筛选标准,禁水组与对照组经过筛选后,发现显著差异表达基因2 122个。其中禁水组上调表达基因为813个,下调表达基因1 309个(图 1)。

图 1 禁水组与对照组差异表达基因分布 Figure 1 Distribution of differentially expressed genes in no drinking water group and control group
2.5 禁水组与对照组双峰驼结肠组织差异表达基因的GO分析

将差异表达基因按照GO条目进行分类,根据校正P-value<0.05筛选显著富集GO条目,其值越小说明统计结果越显著。结果显示,禁水组下调表达基因富集到的GO条目共2 274条,其中具有统计学显著意义的为30条,包括细胞组分富集条目8条(胞内部分、大分子复合物、细胞器、细胞质、胞内、胞内细胞器、层粘连蛋白-1复合物、层粘连蛋白复合物),生物过程4条(细胞迁移、细胞黏附调节、细胞迁移调节、胚胎发育调节),分子功能18条(核苷酸结合、核苷磷酸结合、水解酶活性(作用于酸酐)、焦磷酸酶活性、阴离子结合、嘌呤核糖核苷三磷酸结合、核苷-三磷酸酶活性、嘌呤核苷结合、核糖核苷结合、嘌呤核糖核苷结合、含磷酸酐中的水解酶活性(作用于酸酐)、嘌呤核糖核苷酸结合、核糖核苷酸结合、有机环状化合物结合、嘌呤核苷酸结合、小分子结合、核苷结合、杂环化合物结合)(图 2)。禁水组上调表达基因富集到的GO条目共1 958条,未发现有统计学意义的GO条目。

图 2 禁水组下调表达基因GO分类 Figure 2 GO classification of down-regulated expression genes in no drinking water group
2.6 禁水组与对照组双峰驼结肠组织差异表达基因的KEGG富集分析

将校正后的P-value (q值)<0.05作为显著pathway的筛选标准,KEGG分析获得禁水组下调表达基因富集的代谢通路20个(图 3),显著富集的包括剪接体(spliceosome)、蛋白输出(protein export)、内质网内的蛋白质过程(protein processing in endoplasmic reticulum)、RNA转运(RNA transport)、核糖体生物合成(ribosome biogenesis in eukaryotes)、mRNA监控(mRNA surveillance)(图 3表 4)。

富集因子为该pathway中富集到的差异表达基因个数与注释基因个数的比值,该值越大,表示富集的程度越高。q值是做过多重假设检验校正之后的P-value,此值越接近于零,表示该富集通路越显著。下图同 Enrich factor is the ratio of the number of differentially expressed genes enriched in the pathway to the number of annotated genes, the larger the value, the greater the degree of enrichment. The q-value is the corrected P-value, the q-value is closer to zero, the pathway is more significant enriched. The same as the following figure 图 3 禁水组下调表达基因KEGG通路分析 Figure 3 Statistics of pathway enriched by down-regulated expression genes in no drinking water group
表 4 禁水组下调表达基因显富集通路 Table 4 Significantly enriched pathways by down-regulated expression genes in no drinking water group

禁水组上调表达基因富集到了20个通路,没有发现有显著富集的通路,结果显示局部黏连(focal adhesion)通路有较高的富集程度(图 4)。

图 4 禁水组上调表达基因KEGG通路分析 Figure 4 Statistics of pathway enriched by up-regulated expression genes in no drinking water group
2.7 禁水组与对照组双峰驼结肠组织缺水适应基因筛选

根据禁水组与对照基因表达分析,本研究筛选出骆驼结肠组织在缺水条件下与缺水适应相关的基因。其中剪接体途径中的20个基因、蛋白质排出途径中的11个基因、蛋白质加工途径中5个基因和RNA转运途径中的4个基因在禁水条件下,在骆驼结肠显示出显著的下调(表 5)。

表 5 双峰驼缺水适应基因 Table 5 Water deficiency adaptive genes screened in bactrian camel
3 讨论 3.1 样品测序与参考基因组比对

双峰驼结肠组织禁水组与对照组参考基因组比对的总比对率分别为90.58%、92.48%,其中多位点比对率为1.5%、0.86%,唯一位点比对率分别为89.08%、91.62%。其中唯一位点比对率反映了测序建库过程的规范性。本研究中,唯一位点比对率高于85%,说明研究中使用的测序质量良好,参考基因组选择合适,并且参考基因组完整,未出现因参考基因组不完整或选择版本不准确导致比对目标的缺失和总比对率的下降;RNA提取质量优异,建库过程合乎规范,获得了合乎测序要求的RNA片段,在建库或RNA提取过程中未出现RNA降解,避免了多位点比对的比例增加和基因表达定量准确性差的现象。测序结果符合后续研究需求。

3.2 双峰驼结肠组织禁水组与对照组差异表达基因的GO富集分析

本研究针对禁水组上调和下调表达基因进行GO富集分析,对所有差异基因进行细胞组分、分子功能和生物过程分类识别。其中下调表达基因显著富集到核苷酸结合、核苷磷酸结合、嘌呤核糖核苷三磷酸结合、核苷三磷酸酶活性、核糖核苷结合等分子功能,这些功能多与细胞的基础代谢功能相关,例如核苷酸结合直接涉及细胞自身所有的功能,包括细胞分裂、增殖、分化等。说明在缺水环境下,骆驼结肠RNA合成功能受到影响,处于下调趋势。这表明,在缺水环境下,骆驼结肠从RNA相关功能阶段降低细胞代谢,从而使得结肠组织适应此环境。

3.3 双峰驼结肠组织禁水组与对照组差异表达基因的KEGG富集分析

KEGG分析通过超几何检验,确定差异表达基因参与的主要代谢通路和信号通路。本研究中,通过对差异表达基因的信号通路分析,显著富集通路包括剪接体(spliceosome)、蛋白输出(protein export)、内质网内的蛋白质加工(protein processing in endoplasmic reticulum)、RNA转运(RNA transport)、核糖体生物合成(ribosome biogenesis in eukaryotes)。

3.3.1 剪接体途径

剪接体途径是真核生物中转录后mRNA前体经过剪接体的加工,将内含子去掉的过程[5]。该过程是真核生物的一种特有现象,在真核生物,细胞剪接体本身是一个蛋白复合体[6]。本研究鉴定到该复合体家族中多个基因的低表达,这表明结肠组织显著降低了转录到翻译过程的活性,由于剪接体功能的降低直接导致可用成熟mRNA的减少,成熟的mRNA是蛋白质合成所必须的,这意味着可用于下游翻译的模板减少,从而导致蛋白质合成活动的减少。

3.3.2 蛋白质输出

蛋白质在内质网合成后,经过蛋白质输出功能将蛋白质从细胞质运输到细胞外部,是一种细胞内的主动转运[7]。Sec蛋白依赖性的蛋白质输出系统将协助新合成的蛋白质转运穿过细胞膜[8]。本研究中,蛋白质输出途径低表达基因的显著富集说明结肠细胞内蛋白质运输功能下降,意味着结肠在缺水条件下降低了蛋白质的转运,这可能与蛋白质合成减少相关。

3.3.3 内质网内的蛋白质加工

内质网作为一种亚细胞器,主要负责蛋白的正确折叠,将折叠后的蛋白包装成运输囊泡,转运给高尔基体[8-10]。本研究中,下调表达基因显著富集于该通路表明在缺水的环境下,结肠蛋白质合成作用降低,可能是在缺水条件下组织为了减少不必要的物质消耗。

3.3.4 RNA转运RNA转运

过程是从细胞核到细胞质RNA转运的基础,在细胞核中产生的RNA不能直接穿过核孔而需要通过移动输出受体穿过核孔复合物,细胞内多数RNA都是由特定的输出受体转运到细胞质[11-12]。本研究中,RNA转运过程被低表达基因的显著富集表明,结肠在缺水环境下,该功能的降低将直接导致细胞内合成的RNA不能转运进入细胞质,这也将导致细胞内可用于蛋白质合成的RNA减少。

3.3.5 核糖体生物合成

核糖体作为制造蛋白质的工厂,其运行正常与否直接影响后续蛋白质的产生。本研究发现,该过程中基因的显著下调表达说明,结肠为适应缺水环境,从核糖体合成的根本上降低了生物合成。

3.3.6 mRNA监控mRNA监控

途径是检测和降解异常mRNA的质量控制机制[13]。当细胞RNA合成过程中,因外部环境造成新合成RNA的损伤时,该功能发挥作用[14-15]。例如,该途径能够消除过早的翻译终止密码子作用[16-17]。本研究中, 该途径得到显著富集, 表明试验条件下水胁迫导致了该途径的低表达,这与之前RNA转运和剪接体功能下降直接相关。表明水胁迫下,不仅RNA的成熟过程和转运过程被抑制,与RNA相关的质量监控也受到限制。

3.4 双峰驼结肠组织参与缺水环境适应的基因

P68蛋白是RNA解旋酶DEAD盒家族的成员[18],作为连接分子参与多种细胞过程,促进与许多其他因子的相互作用[19]。该蛋白质参与包括RNA结构改变的途径,作为转录的共调节因子,在剪接调节剂以及小的非编码RNA的加工中起作用[20]。该家族成员含有9个保守基序,包括保守的Asp-Glu-Ala-Asp(DEAD)基序,对ATP结合和水解以及RNA结合和解旋活性有很重要的作用[18]

HSP73蛋白为热休克蛋白70(HSP70)家族成员,属热休克同源蛋白[21],作为分子伴侣发挥作用[22]。同时,在细胞膜组分通过细胞的转运中,该蛋白在囊泡的分解中起ATP酶的作用[23]。HnRNPs为异质核糖核蛋白,作为RNA结合蛋白,它们与异源核RNA(hnRNA)复合[24-25]。这些蛋白质与细胞核中的前mRNA相关,并且似乎影响前mRNA加工和mRNA代谢和转运[26]。hnRNP蛋白质具有不同的核酸结合特性。这种蛋白质也被认为在细胞周期进程中起作用。

BiP蛋白是热休克蛋白70(HSP70)家族的成员,它位于内质网(ER)的内腔中,并参与ER中蛋白质的折叠和装配[27-28]。由于这种蛋白质与许多ER蛋白质相互作用,它可能在监测细胞的蛋白质转运中起关键作用[29]

ERP57基因编码内质网的蛋白质,其与凝集素伴侣钙网蛋白和钙联蛋白相互作用以调节新合成的糖蛋白的折叠[30]。这种蛋白质曾被认为是一种磷脂酶; 然而,已经证明该蛋白质实际上具有蛋白质二硫键异构酶活性。据认为,凝集素和这种蛋白质的复合物通过促进其糖蛋白底物中二硫键的形成来介导蛋白质折叠。该蛋白质还起分子伴侣的作用,可防止蛋白质聚集体的形成[31]。CRM1作为细胞周期调节蛋白,是一种介导富含亮氨酸核输出信号转运的蛋白质[32],该蛋白特异性抑制Rev和U snRNA的核输出[33]。通过控制细胞周期蛋白MPAK和MAPKAP激酶2的定位参与细胞过程的控制,该蛋白还调节NFAT和AP-1[34]。Expt属于RAN-GTPase输出蛋白家族,其介导tRNA从细胞核到细胞质的输出[35]。一旦输出蛋白结合tRNA和GTP结合的RNA,就会发生tRNA向细胞质的转运[36]Bms1可能编码核糖体装配蛋白,在酵母中存在的相似蛋白质在35S-rRNA加工中起作用,其包括一系列对于形成40S核糖体至关重要的切割步骤[37]

上述基因作为下调表达基因,涉及到了蛋白质合成整个过程、核糖体转运、RNA运出细胞核、蛋白质的内质网合成、蛋白质的定位、前体RNA的剪切与成熟、蛋白质信号识别等。这些相关功能基因的低表达直接影响了下游基因从RNA到最终蛋白质的翻译过程。

4 结论

本研究利用HiSeq 2000高通量测序平台对双峰驼在正常饮水与极度缺水环境下的结肠组织进行转录组测序,获得高质量的转录谱。研究发现,禁水环境下,结肠组织下调表达基因多于上调表达基因,下调表达基因多参与RNA加工和蛋白质合成,这些功能有利于骆驼在缺水环境下,减少RNA的合成,降低结肠组织的代谢速率。

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