2. 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心, 扬州 225009
2. Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Yangzhou 225009, China
牛流行热(bovine ephemeral fever，BEF)是由牛流行热病毒(bovine ephemeral fever virus，BEFV)引起的黄牛、奶牛、肉牛及水牛的一种急性、非接触性传染病。该病由媒介昆虫蚊和库蠓传播，发病动物出现发热、眼鼻分泌物增多、肌肉收缩僵硬、暂时性的跛足、关节肿胀等症状，通常发病快而病程短，持续1~3 d，严重时可表现为黏膜化脓、颤抖、瘫痪及死亡。BEF传播迅速，流行面广，广泛分布于埃及、赞比亚、肯尼亚、澳大利亚、印度、印度尼西亚、巴勒斯坦、日本和中国等多个国家，造成严重的经济损失[1-2]。BEFV是弹状病毒科(Rhabdoviridae)、暂时热病毒属(Ephemerovirus)的代表性物种，与同属的阿德莱德里弗病毒(ARV)、贝里墨病毒(BRMV)、科汤卡恩病毒(KOTV)、奥博第安病毒(OBOV)、金伯利病毒(KIMV)、马拉科病毒(MALV)、普仲病毒(PUCV)、库尔平耶病毒(KOOLV)以及雅塔病毒(YATV)具有相似的基因结构[3-7]。
BEFV基因组为单股负链RNA，编码核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)和依赖RNA的RNA多聚酶(L)5种结构蛋白[8]。G蛋白横跨病毒囊膜，是BEFV关键免疫保护性抗原，也是病毒中和抗体的作用靶点，该蛋白含4个抗原位点，其中G1、G2、G3是主要中和位点[9]。在G蛋白和L蛋白编码基因之间含5个开放阅读框(ORF)，编码非结构蛋白GNS和附属蛋白α1、α2、α3、β、γ，为暂时热病毒所特有[10]。GNS蛋白与G蛋白结构相似，来源可能与G基因重复复制有关。α1具有病毒离子孔道蛋白作用，并且定位于高尔基复合体，可与核质转运受体蛋白β1以及核质转运受体蛋白-7结合，在核质转运过程中发挥作用[11]。
在我国建国前后就有BEF流行的记载[12]，但直至1955年才被正式报道，于1976年分离获得病毒HVRI1/Bejing-1/JB76H株[13]、amH株以及BH株[14]。目前，该病在我国台湾以及内地的26个省区均有流行，感染动物包括黄牛、奶牛、水牛、牦牛、白牦牛等[15-18]。BEF的流行具有一定的周期性，在我国中部流行周期为5~7年，小范围流行周期短至2~3年[19]。1976年以来，研究人员从北京、浙江、河南、山东分离获得了不同时期的毒株，包括Beijing-1、JT02L、LS11、LYC11以及BEFV-SD等，均属于东亚分支[19-20]。本实验室对早期分离的JT02L株基因组进行分析，发现α3和β基因的ORF均发生较大的变化，而且在β和γ基因间隔存在外源序列的重组，可能与病毒的毒力密切相关[21]，但目前没有关于我国BEFV近期分离株的基因组信息，因此我们测定获得了HN1/2012株的全基因组序列，并与澳大利亚、中东、国内早期的参考毒株进行了系统比较分析。
1 材料与方法 1.1 试验材料牛流行热病毒HN1/2012株牛体传代病毒抗凝血，保存于本实验室。该毒株于2012年7月采自河南省洛阳市周边急性发热的高热期奶牛，本实验室定期于每年冬天无蚊、蠓活动时接种抗体阴性的成年牛进行传代，采集高热期(体温达40.0 ℃以上)的EDTA抗凝血，于－80 ℃保存。
1.2 主要试剂RNA提取试剂RNAiso Plus、一步法RNA RT-PCR试剂盒PrimeScriptTM One Step RT-PCR Kit Ver.2、Premix TaqTM、DNA纯化试剂盒、DL2000 DNA Marker、质粒提取试剂盒，购自大连TaKaRa公司；pGEM T-easy载体、连接酶为Promega公司产品；感受态细胞Trans5α购自北京全式金生物技术有限公司，其他试剂均为国产或进口分析纯。
1.3 引物设计根据GenBank中收录的澳大利亚BEFV BB7721株的全基因组序列(GenBank登录号：AF234533)以及我国早期分离株Beijing-1的部分基因组序列(GenBank登录号：JX564640、U72399、AY854642)设计覆盖BEFV基因组的11对引物(表 1)，用于扩增11个DNA片段。每相邻的2个DNA片段具有部分重叠，用于后续基因组序列拼接。
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表 1 引物序列 Table 1 The sequences of the primers |
根据RNAiso Plus试剂操作说明，从BEFV HN1/2012传代病毒抗凝血提取总RNA。将保存于－80 ℃的抗凝血充分解冻后取300 μL至无RNase离心管中，加入800 μL RNAiso Plus，加入200 μL氯仿，混合均匀后室温放置5 min。然后12 000 g 4 ℃离心15 min，吸取上清液转移至另一新离心管中，加入700 μL的异丙醇混匀、室温放置10 min后，12 000 g 4 ℃离心10 min。弃去上清并加入800 μL 75%乙醇，混匀后12 000 g 4 ℃离心5 min，小心弃去上清，室温干燥沉淀5 min，加入50 μL无RNase水溶解RNA。
1.5 RT-PCR和基因克隆根据一步法RNA RT-PCR试剂盒说明书配制反应液，反应体系为利用2 ×Buffer 25 μL、RNase Free dH2O 18 μL、上游引物和对应的下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL、Enzyme Mix 2 μL、RNA 3 μL，混匀后按反应程序50 ℃ 30 min；94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，反应35个循环后72 ℃终延伸10 min。扩增结束后，用1%琼脂糖电泳并切胶回收目的条带，与pGEM T-easy载体连接后转化Trans5α感受态细胞，挑取单个菌落，利用Premix Taq进行菌落PCR鉴定，将初步鉴定为阳性重组菌培养、提取质粒送南京金斯瑞生物科技有限公司进行序列测定。
1.6 基因组序列、基因结构及演化分析利用美国国家生物技术信息中心(NCBI)网站中的VecScreen在线软件分析测序获得的各片段并去除载体序列，之后利用DNAStar软件包中的SeqMan软件进行序列拼接，获得病毒全基因组序列。参考GenBank收录的澳大利亚BB7721株的基因组信息(AF234533)，根据BEFV基因的转录起始(TI)和转录终止/多聚腺苷酸化(TTP)序列，确定各基因的位置及对应的开放阅读框(ORF)，推导各基因的氨基酸序列，注释后提交GenBank，获序列号。利用DNAStar软件包中的MegAlign软件，采用Clustal W的方法进行比对，分析各基因和核苷酸及其编码氨基酸与参考毒株BB7721(AF234533)、Ad12/TUR(KY012742)、JT02L(KY315724)的序列相似性。以HN1/2012株糖蛋白G基因的胞外结构域编码序列(1 572 nt)进行BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)在线比对分析，下载同源序列，利用重组检测软件包RDP4中的RDP、GENECONV、Chimaera、MaxChi、SiScan、3Seq、LARD等方法进行检测，分析HN1/2012株基因可能发生的重组。利用Mega6软件包进行序列比对，构建系统发生树，分析HN1/2012株的分类地位。
2 结果 2.1 RT-PCR扩增用设计的11对引物进行RT-PCR扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳，得到了与预期大小相符的11个目的片段，与预期大小一致，片段长度分别为820、2 079、1 458、2 071、2 025、631、1 304、2 012、2 181、1 701、556 bp(图 1)。
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M. DL2000相对分子质量标准；1~11.引物对1~11(参见表 1)RT-PCR扩增产物 M. DL2000 DNA marker; 1-11. RT-PCR product amplified with primer pairs 1-11 (see Table 1) 图 1 RT-PCR扩增BEFV全基因组 Figure 1 The RT-PCR amplification of complete genome of BEFV |
菌落PCR鉴定显示，成功将11个基因片段克隆到pGEM T-easy载体中。将阳性重组菌培养提取质粒经测序、拼接，获得了HN1/2012株的全基因组序列，全长为14 899 nt。该序列已提交GenBank，登录号为KM276084。
2.3 基因组结构分析根据BEFV基因的TI和TTP序列对HN1/2012株基因组进行分析注释，结果发现HN1/2012株与参考毒株BB7721、Ad12/TU具有相似的基因组结构：各基因均含有保守的TI序列UUGUCC，在转录形成的mRNA含有5′-cap-AACAGG-结构；除β基因的TTP序列为GUAC[U]6，其余基因的TTP序列均为GUAC[U]7，在转录的mRNA具有CATG(A)7结构。此外，α1基因和α2基因由于具有共同的TI和TTP序列而位于同一转录单元内，在α2的ORF 75—230位编码另一读码框不同的附属蛋白α3。HN1/2012株基因组包含前导序列(50 nt，1—50位)、N基因(1 328 nt，51—1 378位)、P基因(858 nt，1 405—2 262位)、M基因(691 nt，2 306—2 996位)、G基因(1 896 nt，3 044—4 939位)、基因(1 785 nt，4 993—6 777位)、α1α2基因(638 nt，6 815—7 452位)、β基因(459 nt，7 492—7 950位)、γ基因(400 nt，7 981—8 380位)、L基因(6 470 nt，8 360—14 829位)、尾随序列(70 nt，14 830—14 899位)。相邻的基因由基因间隔区(IGR)连接，包括：N-P(26 nt)、P-M(43 nt)、M-G(47 nt)、G-GNS(53 nt)、GNS-α1α2(37 nt)、α1α2-β(39 nt)、β-γ(30 nt)、γ-L(-21 nt，即基因之间含21 nt重叠区)。HN1/2012株G基因在转录起始信号下游与ORF之间的非编码区存在一个A碱基缺失，总体符合经典的BEFV基因组特征。
2.4 基因组变异分析序列比较分析发现，HN1/2012株全基因组与本实验室测定的我国2002年分离株JT02L的核苷酸相似性最高(99.3%)，其次为土耳其2012年分离株Ad12/TUR(92.3%)和澳大利亚1968年分离株BB7721(90.5%)。在核苷酸水平，不同BEFV毒株之间最为保守的基因组功能区段为前导序列和尾随序列，其次为N基因(平均相似性为95.8%)、γ基因、L基因和α1基因(平均相似性为94.2%~94.8%)，M基因、β基因、G基因、GNS基因的核苷酸序列变异较大(平均相似性为93.0%~94.0%)。在氨基酸水平，N蛋白氨基酸序列最为保守(平均相似性为99%)，其次为M蛋白、L蛋白、G蛋白(平均相似性为97.2%~98.1%)。γ蛋白、β蛋白、GNS蛋白、α1蛋白的氨基酸变异较大(平均相似性91.4%~94.9%)。P、α2、α3基因核苷酸和氨基酸平均相似性分别为89.9%~91.9%和71.5%~90.8%，均存在较大变异。总体上，HN1/2012株基因组各基因与JT02L株相比变异较小，与我国早期分离株Beijing-1的抗原G基因的相似性也高于国外分离株BB7721和Ad12/TUR，但其附属蛋白尤其α3与参考毒株Beijing-1的核苷酸、氨基酸均存在较大差异(表 2)，说明附属蛋白在我国BEFV毒株演化中也可能发挥作用。HN1/2012株与河南地区2011年BEFV分离株LS11、LYC11以及2002年浙江分离株JT02L的G蛋白表位一致。与我国疫苗株JB76H相比，这些毒株G3表位突变发生于53位(K→N)和263位(G→E)；G4表位(G蛋白455—482位)的突变发生于461位(K→E)和475位(I→M)，与山东2011年分离株变异基本相同，但后者在476位增加了E→D突变；G1表位(487—503位)和G2表位(168—189位)在我国大陆分离株保守(图 2)。
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表 2 HN1/2012株与参考毒株各基因编码区核苷酸和编码氨基酸的相似性 Table 2 Percentage of nucleotide and amino acid similarity between individual gene coding region of HN1/2012 and reference viral strains |
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图 2 HN1/2012株与参考毒株G蛋白表位比较 Figure 2 Comparation of the epitopes on the G protein of HN1/2012 strain and reference viral strains |
BLAST结果显示，HN1/2012株G蛋白胞外结构域编码区与我国(内地及台湾)、日本分离株以及部分2012年中东分离株(TR/CU15、TR/CU16、TR/CP3)和埃及分离株(EGY12)的核苷酸相似性为95.0%~99.0%，与中东其他分离株的核苷酸相似性为92.0%~93.0%，与澳大利亚分离株的核苷酸相似性为90.0%~91.0%。与GenBank中收录的BEFV全基因组和G基因的参考序列进行重组检测，未发现HN1/2012株基因重组现象。利用Mega6软件进行演化分析，BEFV毒株可分为东亚谱系、中东谱系以及澳大利亚谱系，与之前报道一致[19, 22-25]。HN1/2012株处于东亚分支，这一大的分支还包括我国内地所有的其他BEFV分离株、我国台湾分离株以及日本的分离株(图 3)。土耳其2012年的分离株TR/CU15、TR/CU16、TR/CP3和埃及分离株EGY12也处于东亚分支。HN1/2012株与我国河南2011年分离株LS11的亲缘关系最近，核苷酸和氨基酸的相似性均为99.6%，其次为河南分离株LYC11以及山东2011年分离株，核苷酸和氨基酸相似性分别为98.7%~99.4%和98.8%~99.6%，这些毒株构成了一个新的亚支，在起源上密切相关。此外，HN1/2012株与中国1976年分离株JB76H以及2002年分离株JT02L分支距离较远，但与2013—2014年中国台湾分离株和日本2015年分离株、土耳其2012年分离株CU15、CU16、CP3距离相对较近，可能在演化上密切相关。
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图 3 BEFV毒株G基因系统进化树 Figure 3 Phylogenetic tree based on G gene of BEFV strains |
自1867年在东非首次报道BEF，该病至今已有150余年的历史。影响BEF传播的因素较多，气象和环境因素(如季风及其风速和方向、温度和湿度、季雨)及地理造成媒介昆虫的分布变化、动物的运输都可影响该病的传播，甚至造成不同大陆间远距离传播[2]。继20世纪30年代巴勒斯坦、印度、印度尼西亚、日本报道BEF之后，我国于1955年正式报道在广东省发现该病。至1991年该病在我国多次流行，遍布我国南部和中部的多个省区，而且在北方的辽宁、吉林也有报道[12]。我国河南地区关于该病的记载比较系统，自1983年至今有8次较大的BEF流行，其中最近的报道为2011年，发病率为30%，死亡率达5%[19]，同期在我国山东地区也报道了该病的流行，且分离株与河南2011年分离株在演化上密切相关[26]。
RNA病毒的演化因素包括同源重组、基因突变、病毒基因组节段的重排等。据推测，Shandong2011株在G基因编码区230—472位的变异可能与澳大利亚和中东毒株的同源重组有关[26]。本研究测定了HN1/2012株的基因组序列，分析表明其基因组结构与经典的参考毒株相似。在已知的BEFV基因组序列中，HN1/2012株与我国2002年分离株JT02L的相似性最高，尤其二者编码的P、α1、γ蛋白的氨基酸相似性为100%，但二者G基因存在一定的差异，与早期分离株JB76H的G基因差异相对较大，这些差异表明我国不同地区BEFV抗原基因存在多态性。系统进化分析表明，HN1/2012株与当地同期分离株LS11、LYC11高度同源，而且这些毒株G表位完全一致。目前我国在BEF流行的地区，多采用以JB76H株制备的疫苗对牛进行接种，抗原基因的变异可能更有利于BEFV毒株的生存。重组分析在HN1/2012株基因组和LS11株、LYC11株的G基因均未发现基因同源重组信号，这些毒株的演化可能与免疫压力导致的基因突变密切相关。
4 结论测定了我国近期BEFV分离株HN1/2012基因组序列，解析了其基因组特征，在基因组水平上明确了其与我国2002年分离株JT02L相似性最高，与中东谱系和澳大利亚毒株存在较大差异。G基因的演化分析表明HN1/2012株与同期我国河南株亲缘关系最近，在毒株起源上密切相关。HN1/2012株基因组信息的获得，弥补了我国最近流行周期毒株基因组信息的缺失，为基于全基因组的BEFV分子演化研究奠定了基础。
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