2. 农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室, 呼和浩特 010018;
3. 内蒙古骆驼研究院, 阿拉善右旗 737300
2. Key Laboratory of Clinical Diagnosis and Treatment Technology in Animal Disease of Ministry of Agriculture, Hohhot 010018, China;
3. Inner Mongolia Institute of Camel Research, Alxa Right Banner 737300, China
细胞色素p450(CYP)是一种能够催化多种内源性和外源性物质代谢的超家族酶系。近年来，研究者发现，CYP2亚家族是花生四烯酸的主要氧化酶，如CYP2C和CYP2J [1-2]。尤其是花生四烯酸经CYP2J酶代谢产生的表氧化-二十碳三烯酸(EETs)[3]，在机体内许多生理机能中起重要作用，如调节激素分泌、血管紧张度[4]和肾小管分泌等[5]。CYP2J酶的催化功能和花生四烯酸代谢合成紊乱可能会导致许多病理生理现象，如脑梗死[6-8]、心血管疾病[9]、肿瘤[10-11]、炎症[12]以及肾小球滤过障碍[5]等。CYP2J酶除了对内源性物质代谢发挥作用外，还对依巴斯汀、利托那韦、阿司咪唑和特非那定等外源性物质亦有很强的代谢活性[13-17]。此外，一些外源性物质亦对CYP2J酶的活性产生增强或抑制作用，如达那唑和4-羟基托瑞米芬等[18-19]。
目前在哺乳动物中已经发现了多种CYP2J酶，如人(CYP2J2)、兔(CYP2J1)、大鼠(CYP2J3、CYP2J4)、小鼠(CYP2J5、CYP2J6、CYP2J9、CYP2J11)。CYP2J基因在动物心、肝、肾、肠、脑等各组织均有表达[20-22]。然而，CYP2J基因的特性和表达分布在不同物种之间存在着差异。双峰驼是生活在荒漠、半荒漠戈壁草原上的一种古老而神奇的物种[23]，它拥有很多与众不同的生物学特性，一直吸引着诸多研究者的兴趣[24-25]。双峰驼具有很高的杂食链，喜欢采食带刺和带毛、强烈气味和盐碱含量较高的菊科和藜科类植物，还可采食灌木、仙人掌以及富含纤维素和蛋白含量甚少的植物，甚至采食诸如牛心朴子等有毒植物[26]。与牛羊等反刍家畜相比，双峰驼能耐受高达8倍多的盐碱，不吃不喝可维持正常生理机能达数十天。但与其他家畜和动物相比，有关双峰驼的科学研究相对滞后，双峰驼仍保留着它神秘的特性。因此，研究双峰驼CYP2J酶在揭示双峰驼某些独特的生物学特性方面具有非常重要的意义。
本研究首先通过RACE RT-PCR方法获得双峰驼CYP2J基因cDNA的全长，然后运用生物信息学方法对其开放阅读框所编码的蛋白进行分析，最后利用实时荧光定量PCR对CYP2J基因在双峰驼各组织的表达分布进行测定，为下一步分析双峰驼CYP2J酶的功能研究提供有价值的线索。
1 材料与方法 1.1 试验材料和试剂 1.1.1 动物材料试验所需材料采自内蒙古阿拉善右旗一峰12岁的雄性双峰驼，屠宰后立即采集其心、肝、脾、肺、肾、胰腺、血管、小肠、大肠9种组织，预冷生理盐水漂洗后，用滤纸吸取多余水分，并迅速剪成约100 mg的组织块，装入冻存管内，立即放入液氮进行速冻，带回实验室后放入－80 ℃冰箱中保存。
1.1.2 药品试剂SMARTer®RACE 5′/3′Kit试剂盒、PrimeScriptTM RT Master Mix (Perfect Real Time)反转录试剂盒、DL2000 DNA marker、DL5000 DNA marker、DNA loading buffer均购自宝生物工程(大连)有限公司；SYBR®Green Realtime PCR Master Mix试剂盒、高扩增效率RT-PCR Kit (ReverTra -Plus-)和菌落PCR鉴定试剂盒(Quick Taq HS DyeMix)均购自东洋纺(上海)生物科技有限公司；EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ限制性内切酶购自NEB生物工程有限公司；总RNA提取试剂盒购自Axygen生物技术(杭州)有限公司；其它试剂均为国产或进口分析纯。
1.2 双峰驼总RNA的提取按照动物总RNA提取试剂盒说明书提取双峰驼总RNA，利用琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，多功能酶标仪检测总RNA的浓度和纯度。
1.3 引物设计与合成本研究中所用所有引物见表 1，均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
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表 1 双峰驼CYP2J基因克隆及实时荧光定量PCR的引物 Table 1 Primers for CYP2J gene cloning and real-time quantitative PCR of Bactrian camel |
3′RACE按照试剂盒第一链cDNA合成说明书步骤进行，以所提取的双峰驼总RNA为模板，进行反转录，得到第一链cDNA产物，然后用Tricine-EDTA Buffer稀释10倍作为PCR模板。以GSP-3′和long primer为引物进行3′RACE PCR第一轮反应。以第一轮PCR产物为模板，用引物short primer和NGSP-3′进行第二轮巢式PCR。PCR产物经胶回收试剂盒回收后，In-Fusion克隆连接至pRACE载体中，转化至感受态细胞，在含有氨苄青霉素的LB固体培养基上过夜培养后，挑取阳性菌落再次在LB液体培养基上培养，提取质粒并测序。
5′RACE按照SMARTer®RACE 5′/3′Kit试剂盒的说明书操作步骤，首先进行反转录，得到第一链cDNA；然后使用引物GSP-5′和long primer进行第一轮PCR反应，最后使用引物short primer和NGSP-5′进行第二轮巢式PCR。胶回收PCR产物，In-Fusion克隆至pRACE载体中，转化到感受态细胞，在含有氨苄青霉素的LB固体培养基上过夜培养后，挑取阳性菌落再次在LB液体培养基上培养，提取质粒并测序。
使用DNAMAN软件对3′RACE和5′RACE得到的序列进行拼接，获得CYP2J基因cDNA的全长序列。利用NCBI的ORF Finder得到CYP2J基因开放阅读框和其编码的氨基酸序列。
1.5 双峰驼CYP2J基因开放阅读框的扩增为进一步验证上述拼接后序列的准确性，在开放阅读框外侧分别设计引物CYP2J-F、CYP2J-R，以双峰驼cDNA为模板，采用东洋纺公司的高保真酶，按照说明书配制50 μL反应体系，反应程序设定为98 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，反应进行30个循环。按照胶回收试剂盒说明回收扩增产物，回收产物连接到克隆载体pTA2中，并转化E. coli DH5α感受态细胞中，菌落PCR和双酶切鉴定，挑取阳性克隆测序验证。
1.6 双峰驼CYP2J蛋白的生物信息学分析运用生物信息学软件分析CYP2J蛋白的结构和功能：ProtParam软件(http://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白的理化性质、分子量及等电点等；ProtScale软件(http://web.expasy.org/protscale/)预测蛋白的亲疏水性；TMHMM软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)预测蛋白的跨膜结构域；ProtCompv.9.0软件预测蛋白亚细胞定位；NCBI-CDD (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)预测氨基酸序列的保守结构域；SignalP软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测蛋白有无信号肽；NetPhos 3.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)软件预测蛋白的磷酸化位点；Sopma软件预测蛋白二级结构；SWISS-MODEL软件(http://swissmodel.expasy.org/)预测蛋白的三级结构；BLASTP程序分析双峰驼CYP2J蛋白与其它物种CYP2J蛋白的同源性；MEGA 6软件构建各物种CYP2J蛋白的进化树。
1.7 实时荧光定量PCR以双峰驼各组织总RNA反转录后得到的cDNA为模板，ACTB为内参基因，设计2对引物(Real-CYP2JF、Real-CYP2JR、Real-ACTBF、Real-ACTBR)，按照说明书指导配制反应体系并设定反应程序。采用real-time quantitative PCR方法分析CYP2J基因在双峰驼心、肝、脾、肺、肾、胰腺、血管、小肠、大肠等组织的表达情况。real-time quantitative PCR试验设计3个重复，采用2-△△CT方法对荧光定量PCR数据进行均一化处理，利用SPSS 20.0软件中的Student′s t-test或ANOVA进行差异显著性分析，以P＜0.05作为差异显著性判断标准。使用Graphpad prism 6.02绘制CYP2J基因在双峰驼9个组织中的表达分布图。
2 结果 2.1 双峰驼CYP2J基因的克隆3′RACE扩增产物电泳显示一条大小约1 100 bp的条带(图 1a)，经测序得到一条含有1 135个核苷酸的序列，其中包括31 bp的Poly A尾；5′RACE扩增产物电泳显示有一条约800 bp(图 1b)的条带，测序得到一条含有827个核苷酸的序列。利用DNAMAN软件将CYP2J基因3′RACE和5′RACE序列进行拼接，获得一条1 770 bp的序列，其开放阅读框为1 509 bp，共编码502个氨基酸(图 2)；含有8 bp的5′非编码区(5′UTR)和253 bp的3′非编码区(3′UTR)。为进一步验证上述拼接后基因序列的准确性，在开放阅读框外侧设计特异性引物，利用RT-PCR进行扩增后，PCR产物电泳检测如图 1c所示，经测序验证，进一步表明试验成功获得了含有完整开放阅读框的CYP2J基因序列。
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a. CYP2J基因3′RACE电泳图；b. CYP2J基因5′RACE电泳图；c. CYP2J完整开放阅读框扩增电泳图；M. DNA相对分子质量标准；1、2、3.分别代表 3′RACE、5′RACE和完整开放阅读框(ORF)的扩增产物 a. 3′RACE electropherogram of CYP2J; b. 5′RACE electropherogram of CYP2J; c. ORF amplified electropherogram of CYP2J; M. DL2000 DNA marker; 1, 2, 3. 3′RACE, 5′RACE and open reading frame (ORF) products of CYP2J, respectively 图 1 双峰驼CYP2J基因RACE及RT-PCR扩增产物电泳图 Figure 1 Electropherogram of products of RACE and RT-PCR amplification of CYP2J gene in Bactrian camel |
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下划线为6个底物识别位点(substrate recognition sites, SRS)；方框内为血红素结合域(heme-binding motif)；“*”代表终止密码子(TGA) The 6 SRS regions are underlined; The heme-binding motif region is boxed; The asterisk indicate the stop codon(TGA) 图 2 双峰驼CYP2J基因的开放阅读框和其翻译的蛋白质序列 Figure 2 Nucleotide and deduced amino acid sequences of ORF of CYP2J gene of Bactrian camel |
ProtParam分析结果表明(表 2)，CYP2J基因编码502个氨基酸残基，分子式为C2645H4099N713O726S15，分子量为57 983，等电点(pI)为8.45，负电荷残基数(Asp+Glu)为56个，正电荷残基数(Arg+Lys)为59个，不稳定系数为38.62(较为稳定), 脂肪系数为90.68，总平均亲水性GRAVY值为－0.226，属于亲水性蛋白。此外，利用ProtScale工具预测蛋白一级结构的亲疏水性，从预测结果可知(图 3)，CYP2J蛋白在一级结构上，多数区域的打分值为负值，即表现亲水性，其结果与ProtParam预测结果一致。
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表 2 双峰驼CYP2J蛋白理化性质预测 Table 2 Prediction of physicochemical properties of CYP2J protein of Bactrian camel |
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图 3 双峰驼CYP2J蛋白氨基酸序列亲水性/疏水性预测 Figure 3 Prediction of hydrophilicity/hydrophobicity of CYP2J protein of Bactrian camel |
利用TMHMM 2.0 Server软件对CYP2J蛋白结构进行预测分析，如图 4所示，该蛋白含有一个跨膜结构，为第12~35位氨基酸，属于跨膜蛋白。此外，已有研究结果表明，细胞色素P450蛋白N端有一疏水性螺旋结构将其锚定在内质网膜上[27]，因此双峰驼CYP2J所具有的跨膜特性进一步表明该蛋白具有细胞色素P450蛋白家族的特性，属于P450蛋白家族。
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图 4 双峰驼CYP2J蛋白跨膜区预测 Figure 4 Prediction of transmembrane region of CYP2J protein of Bactrian camel |
使用SignalP软件预测双峰驼CYP2J蛋白的N端信号肽，设定默认参数，预测结果显示，该蛋白D值(discrimination score)为0.263，小于设定阈值0.500(图 5)。因此，双峰驼CYP2J蛋白无信号肽，表明此蛋白为非分泌蛋白且不具有信号识别功能。
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图 5 双峰驼CYP2J蛋白信号肽预测 Figure 5 Prediction of signal peptide of CYP2J protein of Bactrian camel |
ProtCompv.9.0是一种对蛋白进行亚细胞定位的软件。其预测方法是将已知亚细胞定位的同源性蛋白(LocDB)、数据库中具有理论推测定位的蛋白(PotLocDB)、神经网络分析预测(Neural Nets)和序列与数据库五聚体分布对比(Pentamers)4种方法结合，并对这4项打分进行加权后，得到总分为10分的最终预测结果(Integral)。对双峰驼CYP2J蛋白使用ProtCompv.9.0软件进行亚细胞定位预测，结果表明，CYP2J蛋白主要定位于内质网上，其软件综合打分结果最高为9.40(表 3)。
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表 3 双峰驼CYP2J蛋白亚细胞定位预测 Table 3 Prediction of sub-cellular location of CYP2J protein of Bactrian camel |
利用NetPhos 3.1 Server对双峰驼CYP2J蛋白进行磷酸化位点预测，如图 6所示，分数在0.5(阈值)以上的有14个Ser位点、20个Thr位点和5个Tyr位点，共计39个蛋白激酶磷酸化位点，推测CYP2J可能受蛋白磷酸激酶的调控。此外，NCBI-CDD(Conserved Domain Database)预测到该蛋白的保守结构域在44~497肽链区间，属于细胞色素P450家族。
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图 6 双峰驼CYP2J蛋白的磷酸化位点预测 Figure 6 Prediction of phosphorylation sites of CYP2J protein of Bactrian camel |
采用Sopma软件预测双峰驼CYP2J蛋白二级结构，结果如图 7所示，上行为氨基酸序列，下行为其所对应的二级结构，其中h代表α-螺旋(alpha helix)、e代表延伸链(extended strand)、c代表无规则卷曲(random coil)。预测结果表明，CYP2J蛋白二级结构组分中，h占46.41%，e占13, 15%，c占40.44%。由此可推测，α-螺旋和无规则卷曲是CYP2J蛋白的大量结构元件，而延伸链则散布于整个蛋白质中。用SWISS-MODEL对CYP2J基因编码氨基酸的三级结构进行预测，结果如图 8所示，双峰驼CYP2J蛋白的三级结构中α-螺旋所占比例较高，其次为无规则卷曲，与其二级结构预测的结果相一致。
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图 7 CYP2J蛋白二级结构预测 Figure 7 Prediction of the secondary structure of CYP2J protein of Bactrian camel |
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图 8 双峰驼CYP2J蛋白的三级结构预测模型 Figure 8 Predicted tertiary structure model of CYP2J protein of Bactrian camel |
利用NCBI中的BLASTP程序，分析双峰驼CYP2J蛋白与其它物种CYP2J蛋白的氨基酸同源性。结果表明，双峰驼CYP2J氨基酸序列与羊(AAV66395.1)、猴子(AAZ29440.1)、人(AAC50370.2)、牛(NP_001033640.1)、兔子(AA14401.1)、大鼠(AAF21133.1)、小鼠(AAB87636.1)的氨基酸序列同源性分别为82.67%、79.08%、78.49%、78.09%、75.10%、72.31和71.51%(表 4)。多序列比对结果表明，双峰驼CYP2J蛋白序列与其他7种动物CYP2J蛋白结构类似，均具有保守的血红素结合域(heme-binding motif)。此外，利用MEGA 6软件构建各物种间CYP2J蛋白的系统进化树。如图 9所示，双峰驼与羊和牛的亲缘关系最近。
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表 4 双峰驼CYP2J蛋白与其它物种间的同源性分析 Table 4 Analysis of homology of CYP2J protein between Bactrian camel and other species |
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图 9 双峰驼CYP2J蛋白与其他物种的系统进化树 Figure 9 Phylogenetic tree analysis of CYP2J protein between Bactrian camel and other species |
采用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR)测定双峰驼9种组织中CYP2J基因的相对表达量。结果如图 10显示，CYP2J基因mRNA在双峰驼不同组织表达水平存在明显差异。在肝和胰腺表达量最高，其次是肾、肺、心、小肠和血管，而在脾和大肠的表达量较低。
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相同字母表示差异不显著(P＞0.05)，不同字母表示差异显著(P＜0.05) The same letter indicates the difference is not significant (P > 0.05); The different letters indicate the difference is significant (P < 0.05) 图 10 CYP2J基因在双峰驼各组织的相对表达量 Figure 10 CYP2J gene expression abundance in different tissues of Bactrian camel |
CYP450酶系是一种广泛存在于动物、植物和微生物等不同生物体内的多功能氧化酶，能够催化多种重要内源性物质和外源性化合物的代谢，尤其是在药物的生物转化过程中发挥着非常重要的作用。与牛、羊、马和人的CYP基因相比，双峰驼CYP基因亚家族的分布具有明显的差异，如在拷贝数上双峰驼拥有较多的CYP2J，CYP2J亚家族目前公布的18条同源性基因中，双峰驼体内含有11条CYP2J基因，远远高于其它物种[28]。因此，双峰独特的物质代谢途径、耐高盐特性和特殊的解毒能力等可能与其CYP基因家族的特殊性有关，尤其是高拷贝数的CYP2J基因。
获得基因全长序列是生物工程和分子生物学研究的重点之一。RACE技术因为其试验周期短、技术步骤简单已成为克隆未知基因全长cDNA序列的常用手段并成功运用于许多基因的克隆和分离[29]。本研究中，通过RACE技术成功获得了双峰驼CYP2J cDNA全长序列及其开放阅读框编码的蛋白，并利用RT-PCR进一步验证了所获得序列的准确性。
此外，随着基因组学和蛋白质组学研究的深入，生物信息学理论及分析方法也得到了迅猛发展[30]。许多重要的软件及网站的开发极大的方便了基因和蛋白质数据的分析，如美国国家生物技术信息中心(NCBI)的GenBank数据库和瑞士蛋白质专家分析系统服务器(Expasy)等。对双峰驼CYP2J蛋白进行生物信息学分析结果表明，双峰驼CYP2J蛋白为亲水性蛋白，不含有信号肽剪切位点，跨膜螺旋结构预测结果推测，CYP2J蛋白含有1个N端跨膜螺旋结构，属于膜结合蛋白，含有6个底物结合位点和1个血红素结合域，这与其它动物CYP2J蛋白相一致[31]。进化树分析结果显示，双峰驼CYP2J蛋白与羊和牛的亲缘关系最近，这可能是因为双峰驼与羊和牛同属反刍动物。
采用real-time quantitative PCR技术在mRNA水平上检测了CYP2J基因在双峰驼9种组织中的表达情况。研究结果显示，CYP2J基因在双峰驼肝和胰腺表达量相对高，而在心、肾和小肠等组织也具有较高的表达量。这与其它CYP亚族酶主要在肝中存在的特点不一致，但与其它动物的CYP2J基因的表达与分布基本一致[22, 32-33]，这可能与内源性物质花生四烯酸被CYP2J酶代谢后产生的EETs在心血管系统和肾发挥着极为重要的作用有关[4-5]。在心血管系统，CYP2J源性的EETs可降低血压、抗血栓、促进血管内皮细胞增殖和抑制内皮细胞凋亡[34]。在肾中，CYP2J源性EETs可抑制Na+\K+-腺苷三磷酸酶的活性、调节细胞质中的Ca2+对血管紧张素Ⅱ的诱导作用、抑制水和Na+的重吸收以及K+的分泌[35-36]。正是由于CYP2J源性表氧化酶-EET系统的这些生理功能，使双峰驼能够耐高盐且不发生盐敏感性高血压，从而很好的适应这些水源缺乏、高温炎热、食物种类贫乏且味道苦咸的荒漠化环境，并把这些地方作为自己的家园。
4 结论本研究借助RACE技术成功获得了双峰驼CYP2J基因的cDNA全长序列，其中开放阅读框长1 509 bp，共编码502个氨基酸。该基因编码的蛋白质为稳定的亲水性蛋白，第12~35个氨基酸为跨膜区域，不具有信号肽识别功能，主要定位在内质网上。CYP2J基因在双峰驼各组织中均有表达，在肝和胰腺中表达量最高，其次是肾、肺、心、小肠和血管，而在脾和大肠的表达量较低。
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